專利名稱：水稻產(chǎn)量基因gy6的克隆及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及到一個(gè)位于水稻第6染色體短臂上控制谷粒產(chǎn)量的基因GY6的克隆與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻谷粒產(chǎn)量是水稻生產(chǎn)最重要的目標(biāo)，單株穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)和千粒重是水稻谷粒產(chǎn)量的三個(gè)主要構(gòu)成因子。水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成因子是典型的數(shù)量性狀，由數(shù)量性狀基因(Quantitative trait Ioci7QTL)控制。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,近年來已有14個(gè)控制水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL應(yīng)用圖位克隆策略獲得克隆，分布于除第6、11和12染色體外的10個(gè)不同座位上，它們通過調(diào)控株型、穗形、每穗實(shí)粒數(shù)、每穗穎花數(shù)、粒重或灌漿速率控制產(chǎn)量。近等基因系(Near-isogenic line, NIL)是QTL精細(xì)定位和克隆中最常用的材料，其優(yōu)點(diǎn)是只在目標(biāo)區(qū)間存在差異，遺傳背景高度一致，使得群體只在單個(gè)QTL區(qū)間發(fā)生分離，極大地降低了遺傳背景差異對目標(biāo)QTL作用的干擾和對目標(biāo)性狀測定結(jié)果的影響，有效地提高了 QTL檢測的靈敏度和可靠性。長期以來，近等基因系的構(gòu)建一般通過多代回交獲得，利用剩余雜合體(Residual heterozygote, RH)或剩余雜合系(Residualheterozygous line,RHL)發(fā)展近等基因系是ー種新的策略。所謂RH,指的是目標(biāo)區(qū)間雜合而遺傳背景純合的單株，可從重組自交系群體中通過ー輪標(biāo)記篩選獲得，它相當(dāng)于ー對近等基因系雜交產(chǎn)生的Fl單株。應(yīng)用RH自交產(chǎn)生的只在目標(biāo)區(qū)間發(fā)生分離的群體，可以有效地實(shí)現(xiàn)QTL的精細(xì)定位和克隆。這種策略為分離和克隆新基因提供了一種新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是應(yīng)用圖位克隆法從水稻中分離克隆一種控制谷粒產(chǎn)量的基因，并利用該基因提高水稻的谷粒生產(chǎn)能力。申請人將克隆的這個(gè)基因命名為GY6，所述片段如序列表SEQ ID No :1-6所示，或者基本相當(dāng)于SEQ ID No : 1_6所示的高度同源核苷酸序列。具體地，本發(fā)明分離克隆的基因或等位基因的核苷酸序列及其氨基酸序列的信息如下—種控制水稻谷粒產(chǎn)量的基因GY6,它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:l所不。上述基因GY6的編碼序列如序列表SEQ ID No 2所不。上述基因GY6的氨基酸序列如序列表SEQ ID No 3所示。與此同時(shí)，申請人得到GY6的ー種等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:4所示。上述等位基因的編碼序列如序列表SEQ ID No:5所不。上述等位基因的氣基酸序列如序列表SEQ ID No:6所不。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)從珍汕97/密陽46F7重組自交系中篩選獲得一個(gè)在第6染色體短臂上的、RM190-RM19784約7. 3Mb區(qū)域呈雜合而背景基本純合的剩余雜合體，自交產(chǎn)生分離群體，通過DNA分子標(biāo)記分析，篩選獲得雜合區(qū)間更小且相互交疊的RH梯系材料。經(jīng)連續(xù)4次自交構(gòu)建群體和基因型篩選，最終獲得僅在13. 7kb區(qū)間呈分離的近等基因系。近等基因系群體產(chǎn)量性狀鑒定結(jié)果顯示，該基因?qū)γ克雽?shí)粒數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量均具顯著作用，來源于珍汕97的等位基因提高每穗實(shí)粒數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量(見本發(fā)明下述的表2)。該區(qū)間僅含一個(gè)候選基因，將之命名為GY6。序列分析表明，珍汕97和密陽46等位基因的基因組DNA分別長為6842bp和4716bp，編碼序列長度均為537bp，編碼ー個(gè)由178個(gè)氨基酸組成的含 PEBP結(jié)構(gòu)域的蛋白。與珍汕97等位基因相比，密陽46等位基因在編碼區(qū)共存在11處單核苷酸多態(tài)，導(dǎo)致了 6處氨基酸的置換。將GY6 (ZS97)等位基因轉(zhuǎn)入中花11中，其T2代產(chǎn)量性狀鑒定結(jié)果顯示，該基因?qū)γ克雽?shí)粒數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量均具顯著作用，轉(zhuǎn)入GY6 (ZS97)可提高每穗實(shí)粒數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量(見本發(fā)明下述的表3)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明在水稻中克隆了ー個(gè)對粒數(shù)、粒重和谷粒產(chǎn)量具有較大正調(diào)控效應(yīng)的基因GY6，為水稻等禾谷類作物的高產(chǎn)育種提供了新的基因資源。


序列表SEQ ID No 1顯示的是本發(fā)明分離克隆的來源于珍汕97的GY6等位基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID No 2顯示的是本發(fā)明分離克隆的來源于珍汕97的GY6等位基因的編碼序列。序列表SEQ ID No 3顯示的是本發(fā)明分離克隆的來源于珍汕97的GY6蛋白的氨
基酸序列。序列表SEQ ID No 4顯示的是本發(fā)明分離克隆的來源于密陽46的GY6等位基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID No 5顯示的是本發(fā)明分離克隆的來源于密陽46的GY6等位基因的編碼序列。序列表SEQ ID No 6顯示的是本發(fā)明分離克隆的來源于密陽46的GY6蛋白的氨
基酸序列。圖I為近等基因系單株和主穗在灌漿期的表現(xiàn)。圖I左側(cè)圖片中的左邊為攜帶珍汕97GY6等位基因的NIL-GY6 (ZS97)單株，右邊為攜帶密陽46GY6等位基因的NIL-GY6(MY46)單株；圖I右側(cè)圖片中的左邊為NIL-GY6 (ZS97)主穗，右邊為 NIL-GY6 (MY46)主穗。圖2為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因所用的表達(dá)載體圖譜。圖3為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因單株和主穗在灌漿后期的表現(xiàn)。圖3左側(cè)圖片中的左邊為中花11陰性單株，右邊為轉(zhuǎn)GY6(ZS97)陽性單株；圖3右側(cè)圖片中的左邊為成熟時(shí)期的中花11陰性單株主穗，右邊為轉(zhuǎn)GY6(ZS97)陽性單株主穗。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)ー步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑商店購買得到。實(shí)施例1GY6的圖位克隆I. NIL 構(gòu)建根據(jù)珍汕97/密陽46衍生群體產(chǎn)量性狀的初定位結(jié)果，從F7株系中選擇到ー個(gè)剩余雜合體，該單株在第6染色體短臂上的RM190-RM19784約7. 3Mb區(qū)域呈雜合，在其他區(qū)域基本呈純合。利用該單株自交，獲得由221個(gè)株系組成的F8:9群體。應(yīng)用位于RM190和RM19784之間的22個(gè)SSR(簡單序列重復(fù))標(biāo)記進(jìn)行基因型檢測，從23個(gè)F8家系的332個(gè)F9單株中篩選獲得14個(gè)在RM4923-RM6119區(qū)域的部分區(qū)間呈雜合且相互交疊的RH梯系材料；分別自交獲得14套Fltl群體，從其中ー套含288個(gè)體的群體中篩選獲得I個(gè)在 RM3414-RM19417區(qū)間約97. Ikb呈雜合的單株，自交后形成由200個(gè)個(gè)體組成的F11群體；從中選取I個(gè)雜合單株自交形成了由680個(gè)單株組成的F12群體，應(yīng)用3個(gè)SSR標(biāo)記和新發(fā)展的4個(gè)InDel (插入缺失)標(biāo)記，從后代中挑選出I個(gè)在RM19410-RM19417區(qū)間約64. 2kb呈雜合的單株，自交后形成由288個(gè)個(gè)體組成的F13群體；應(yīng)用包含新發(fā)展的2個(gè)在內(nèi)的6個(gè)InDel標(biāo)記進(jìn)行篩選，挑選到I個(gè)僅在Si2925和Si2927_4/5之間、只包含一個(gè)預(yù)測基因的約I. 7kb區(qū)間呈雜合的單株，從其自交群體中挑選出30個(gè)母本純合型和30個(gè)父本純合型的株系，構(gòu)建了只在第6染色體短臂Si2925和Si2927-4/5區(qū)間呈分離的NIL群體。2. DNA微量提取(I)剪取水稻幼苗葉片2 3cm，剪成O. 5cm長的碎片，放入2. OmL離心管中。(2)加入450ul DNA提取液和ー顆鋼珠，應(yīng)用組織研磨儀進(jìn)行研磨。(3)加入450ul氯仿萃取液，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻。(4) 11, OOOrpm離心2分鐘至清晰分相。吸取上清液400ul,轉(zhuǎn)入新的I. 5ml離心
管中，棄槍頭。(5)加入800ul預(yù)冷的無水こ醇，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻。-20°C放置30分鐘。(6) 11，OOOrpm離心3分鐘至沉淀附于離心管底部，棄上清液。(7)用70%こ醇洗滌沉淀2遍，將I. 5ml離心管倒置于紙上，自然干燥。(8)加入50ul的1/10XTE緩沖液溶解沉淀。(9)取 I μ I 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。3.分子標(biāo)記開發(fā)本發(fā)明所用到的SSR標(biāo)記信息來自于Gramene網(wǎng)站(www. gramene. org)。此外，根據(jù)珍汕97和密陽46在第6染色體短臂RM19410-RM19417區(qū)間的基因組片段測序結(jié)果，挑選具有InDel差異、PCR產(chǎn)物長度大約在100-500bp的片段進(jìn)行分子標(biāo)記開發(fā)，引物設(shè)計(jì)軟件為Oligo 7. O (Lasergene公司)。應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物對珍汕97和密陽46檢測，檢查擴(kuò)增效果和多態(tài)性，最終選用6個(gè)在珍汕97和密陽46之間呈多態(tài)的InDel標(biāo)記(表I)。4. PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系如下335mMTris-HCL, pH 8. 8 ；80mM(NH4)2SO4 ；0. 9mM MgCl ；0. 05 %TWEEN-20 ；0. 2mM dNTPs ；3. 3ng/μ I 正向引物；3. 3ng/μ I 反向引物；O. 5 單位 TaqDNA 聚合酶/10 μ I ;1μ L DNA/10 μ I。
擴(kuò)增條件如下94°C 2分鐘；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C I分鐘，30循環(huán)；
權(quán)利要求
1.ー種控制水稻谷粒產(chǎn)量的基因GY6，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示。
2.如權(quán)利要求I所述的基因GY6，它的編碼序列如序列表SEQID NO :2所示。
3.如權(quán)利要求I所述的基因GY6，它的編碼氨基酸序列如序列表SEQID NO :3所示。
4.如權(quán)利要求I所述的基因GY6的等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO 4所示。
5.如權(quán)利要求4所述的等位基因，它的編碼序列如序列表SEQID N0:5所示。
6.如權(quán)利要求4所述的等位基因，它的編碼氨基酸序列如序列表SEQID N0:6所示。
7.權(quán)利要求I或2或3所述的基因在作物遺傳改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，公開了分離克隆的控制水稻谷粒產(chǎn)量的基因GY6及其等位基因的核苷酸序列。所述序列如SEQ ID NO1(珍汕97)和SEQ ID NO4(密陽46)所示，包含4個(gè)外顯子；其編碼序列如SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO6所示。兩者在在編碼區(qū)共存在11處單核苷酸多態(tài)，導(dǎo)致6個(gè)氨基酸變化。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)GY6基因的水稻植株，轉(zhuǎn)基因陽性植株表現(xiàn)出實(shí)粒數(shù)增加、千粒重提高、產(chǎn)量增加的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102643829SQ20121004730
公開日2012年8月22日 申請日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者付亞萍, 劉文真, 莊杰云, 朱玉君, 樊葉楊, 程式華, 黃得潤 申請人:中國水稻研究所