專利名稱：小偃麥異代換系中外源染色體的微分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種外源染色體的切割鑒定方法，具體的說是一種小麥-中間偃麥草異代換系中外源染色體的微分離方法，屬于分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
染色體微切害I]、微分離與微克隆(chromosome microdissection and microcloning)技術(shù)是在1981年由Scalenghe創(chuàng)立的一項(xiàng)分子細(xì)胞遺傳學(xué)新技術(shù)。該技術(shù)首先對(duì)果蠅染色體進(jìn)行了切割，成功獲得了 80個(gè)克隆，隨后用于鼠和人類染色體的切割。 隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，微切割和微克隆技術(shù)得到了較大發(fā)展，利用染色體微切割和微克隆技術(shù)獲得了黑麥DNA克隆以來，該技術(shù)在植物染色體文庫的構(gòu)建、特異探針篩選、抗性基因的克隆以及遺傳與進(jìn)化研究上得到了較為廣泛應(yīng)用，但是，相比較而言，植物在這方面開展的研究仍然滯后于動(dòng)物和人類。目前，植物染色體顯微切割技術(shù)主要存在以下幾個(gè)方面的困難
(I)植物細(xì)胞壁的存在、同步化的困難，阻礙了良好分散染色體標(biāo)本的制備，影響了切割效率。(2)植物基因組倍性多樣，染色體結(jié)構(gòu)變異大，基因排列順序不夠保守；植物染色體DNA含量高、蛋白質(zhì)含量低，大多數(shù)染色體上不顯示G、R或Q帶帶紋，從而影響DNA序列， 通行的C帶，對(duì)染色體DNA破壞太大，不利于構(gòu)建完整的DNA文庫；而有些植物染色體大小差異不明顯，帶紋相似，難于精確識(shí)別染色體及其細(xì)微結(jié)構(gòu)，加大了分析的復(fù)雜性。(3)植物染色體DNA高度重復(fù)序列多，如中間偃麥草、大麥、黑麥和燕麥核基因組有約80%的重復(fù)序列，麥類作物DNA含量高，如六倍體燕麥DNA含量為13. 2—14. 3pg，中間偃麥草C值為1.7X109bp，平均每條染色體0.8X109bp，相當(dāng)于人類基因組的四分之一若每個(gè)插入片段為lkb，每條染色體特異性DNA文庫包含8 X IO5以上克隆，篩庫工作量巨大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述問題的不足，提供基于SLy CELLCUT系統(tǒng)的小偃麥異代換系中外源染色體的微分離方法，標(biāo)本的制備方法簡單，其鑒定方法簡單，分析簡單，便于染色體的切割與回收，為后續(xù)切割染色體的鑒定與分析奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明為解決上述問題所采用的技術(shù)方案是小偃麥異代換系中外源染色體的微分離技術(shù)，包括以下步驟
步驟一、小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備
O按重量份數(shù)比取0. 5份的中國春小麥種子和0. 5份的山農(nóng)小麥種子，混合均勻，后將混合后的小麥種子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麥種子，在溫度為I一4°C條件下，放置24小時(shí)，后在溫度為25°C條件下培養(yǎng)使小麥種子發(fā)芽，繼續(xù)培養(yǎng)至新生小麥根長為I. 5—2. Ocm時(shí)，取0. 5—0. 8cm的根尖部位，備用；
2)取步驟I)中的小麥根尖放在O°C的冰水混合物中，放置24小時(shí)后取出小麥根尖放于2—3份的溫度為1—4°C的卡諾氏液中，放置24小時(shí)，取出，將小麥根尖放于質(zhì)量濃度為 70%的酒精中，備用；
3)試劑的配制
①混合酶液按重量份數(shù)比取I份質(zhì)量濃度為2%的纖維素酶和I份質(zhì)量濃度為2%的果膠酶，混合均勻，制得混合酶液；
②石炭酸品紅溶液取3g的堿性品紅和IOOml質(zhì)量濃度為70%的乙醇，混合均勻，形成原液a，備用；
取IOml原液a和90ml質(zhì)量濃度為5%的石炭酸水溶液，混合均勻，形成原液b，備用；
取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml質(zhì)量濃度為37%的福爾馬林，混合均勻，形成原液c，備用；
取10 — 20ml的原液c、80— 90ml質(zhì)量濃度為45%的乙酸和I. 8g的山梨醇，混合均勻， 制得石炭酸品紅溶液，備用；
4)將步驟2)中的小麥根尖從酒精中取出，將Ig的小麥根尖浸泡在IOml的蒸餾水中， 放置10分鐘，過濾，得到浸泡后的小麥根尖，將浸泡后的小麥根尖放在電子顯微鏡的載物臺(tái)上，進(jìn)行初步鏡檢，得到有絲分裂中期的根尖細(xì)胞染色體，后將有絲分裂中期的根尖細(xì)胞染色體加到Iml步驟3)中得到的混合酶液中，在溫度為37°C條件下，酶解I一I. 5小時(shí)，形成酶解物I，利用無菌蒸餾水對(duì)酶解物I沖洗10分鐘，在O. 5ml的離心管a內(nèi)加入50 μ g 的酶解物I和50μ I步驟3)中得到的石炭酸品紅溶液，混合均勻，形成混合物，將混合物涂在載玻片上，在含有混合物的載玻片上覆蓋一層分離膜，壓緊分離膜和載玻片，使混合物附著在分離膜上，后將分離膜與載玻片分離，在分離膜的表面上形成混合物痕跡，利用質(zhì)量濃度為75%的酒精對(duì)分離膜上的混合物痕跡進(jìn)行第一次細(xì)胞內(nèi)脫水，脫水步驟為將質(zhì)量濃度為75%的酒精滴加在含有混合物痕跡的分離膜上，放置3分鐘，后利用蒸餾水對(duì)分離膜沖洗I分鐘，晾干，然后依據(jù)第一次細(xì)胞內(nèi)脫水的方法，利用質(zhì)量濃度為100%的酒精對(duì)分離膜上的混合物痕跡進(jìn)行第二次細(xì)胞內(nèi)脫水，制得小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本；
步驟二、花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備
1)取處于減數(shù)分裂中期I的小麥-中間偃麥草異代換系山農(nóng)0095與小麥品種煙農(nóng)15 的雜種F1代花粉母細(xì)胞，備用；
2)按重量份數(shù)比取I份步驟I)中得到的花粉母細(xì)胞和2—3份的卡諾氏液，將花粉母細(xì)胞放于I一4°C的卡諾氏液中，放置3 — 24小時(shí)，取出，將花粉母細(xì)胞放在質(zhì)量濃度為70% 的酒精中，備用；
3)將步驟2)中的花粉母細(xì)胞從質(zhì)量濃度為70%的酒精中取出，將Ig的花粉母細(xì)胞浸泡在IOml的蒸餾水中，放置10分鐘，過濾，得到浸泡后的花粉母細(xì)胞，將浸泡后的花粉母細(xì)胞加到Iml步驟一)中得到的混合酶液中，在溫度為37°C條件下，酶解I小時(shí)，形成酶解物 II，利用無菌蒸餾水對(duì)酶解物II沖洗10分鐘，將酶解物II涂在載玻片上，在含有酶解物II 的載玻片上覆蓋一層分離膜，壓緊分離膜和載玻片，使酶解物II附著在分離膜上，后將分離膜與載玻片分離，在分離膜的表面上形成酶解物II痕跡，利用質(zhì)量濃度為70%的酒精對(duì)分離膜上的酶解物II痕跡進(jìn)行第一次細(xì)胞內(nèi)脫水，脫水步驟為將質(zhì)量濃度為70%的酒精滴加在含有酶解物II痕跡的分離膜上，放置3分鐘，后利用蒸餾水對(duì)分離膜沖洗I分鐘，晾干， 然后依據(jù)第一次細(xì)胞內(nèi)脫水的方法，利用質(zhì)量濃度為100%的酒精對(duì)分離膜上的酶解物II痕跡進(jìn)行第二次細(xì)胞內(nèi)脫水，制得花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本，備用；
步驟三、小麥根尖細(xì)胞染色體的顯微分離
在步驟一中制得的小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的載玻片上滴加20 μ I無水乙醇，后在載玻片上覆蓋蓋玻片，將載玻片置于SLy CELIXUT顯微切割系統(tǒng)的載物臺(tái)上，在4Χ物鏡下找到目標(biāo)染色體，然后轉(zhuǎn)換至40Χ物鏡下，對(duì)染色體的單價(jià)體進(jìn)行切割，收集切割后的單根尖細(xì)胞染色體存放在I. 5ml離心管a中，備用；
步驟四、花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割
依據(jù)步驟三的操作方法對(duì)花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割，將切割收集后的花粉母細(xì)胞染色體存放在I. 5ml離心管b中，備用；
步驟五、對(duì)切割后的小麥根尖細(xì)胞染色體和花粉母細(xì)胞染色體分別進(jìn)行DOP-PCR擴(kuò)增
1)試劑配制及兼并引物序列的合成
蛋白酶K處理液在500 μ I的I XTaq DNA聚合酶緩沖液中加入O. 3mg的蛋白酶K，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為600ng/l·! I的蛋白酶K母液，后用IXTaq DNA聚合酶緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為20ng/l·! I的蛋白酶K處理液，備用；
兼并引物序列5’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ；
2)小麥根尖細(xì)胞染色體的預(yù)處理
將步驟二中得到的小麥根尖染色體放在O. 5ml離心管b內(nèi)，后在含有小麥根尖染色體的O. 5ml離心管b內(nèi)加入20 μ I步驟I)中得到的質(zhì)量濃度為20ng/μ I的蛋白酶K處理液， 混合均勻，形成混合液，將含有混合液的O. 5ml離心管b置于37°C條件下，放置4小時(shí)，然后將O. 5ml離心管b放于離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，得到上層液體，將上層液體放在70°C條件下，滅菌20分鐘，取出，得到處理后的小麥根尖目標(biāo)染色體，備用；
3)花粉母細(xì)胞染色體的預(yù)處理
依據(jù)步驟2)中對(duì)小麥根尖細(xì)胞染色體的預(yù)處理方法對(duì)花粉母細(xì)胞染色體進(jìn)行預(yù)處理， 得到花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體，備用；
4)小麥根尖目標(biāo)染色體的DOP-PCR擴(kuò)增
第一次PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系I :在0.5ml離心管c中加入24. 6 μ I的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體、 4 μ I的10XPCR緩沖液，3 μ I質(zhì)量濃度為25mmol/L的Mg2+、4 μ I濃度為25mmol/L的三磷酸脫氧核糖核苷混合液、O. 4μ I質(zhì)量濃度為5υ/μ I的TaqDNA聚合酶、2 μ I的兼并引物和 12 μ I的去離子水,形成反應(yīng)體系I ,備用；
PCR程序?qū)⒎磻?yīng)體系I放入PCR儀內(nèi)，94°C預(yù)變性10分鐘，94°C變性I. 5分鐘、50°C退火I. 5分鐘、72°C延伸3分鐘，PCR擴(kuò)增共5個(gè)循環(huán)，然后94°C變性I. 5分鐘、57°C退火I. 5 分鐘、72°C延伸I. 5分鐘，PCR擴(kuò)增共25個(gè)循環(huán)，72°C再次延伸10分鐘，形成PCR產(chǎn)物I， 備用;
第二次PCR擴(kuò)增
將PCR反應(yīng)體系I配制過程中的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體替換為PCR產(chǎn)物I，按照相同方法配制成PCR體系II，后依據(jù)第一次PCR擴(kuò)增中PCR程序的方法進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物II，備用；
5)花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的DOP-PCR擴(kuò)增第一次PCR擴(kuò)增
將步驟4)中PCR反應(yīng)體系I配制過程中的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體替換為處理后的花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體，按照相同方法配制成PCR反應(yīng)體系III，后依據(jù)步驟4)中第一次 PCR擴(kuò)增中PCR程序的方法進(jìn)行花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第一次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物 III，備用；
第二次PCR擴(kuò)增
將PCR反應(yīng)體系III配制過程中的處理后的花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體替換為PCR產(chǎn)物III， 按照相同方法配制成PCR體系IV，后依據(jù)花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第一次PCR擴(kuò)增中PCR 程序的方法進(jìn)行花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第二次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物IV，備用；
步驟六、利用聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物II和PCR產(chǎn)物II，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)PCR產(chǎn)物II中含有切割后的普通小麥染色體的目的基因，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn) PCR產(chǎn)物IV中含有切割后的中間偃麥草外源染色體的目的基因。露白就是種子在合適的溫度、水分條件下，發(fā)生吸水膨脹，胚根伸長，露出白的芽，叫露白，屬于種子發(fā)芽過程中的一個(gè)生理現(xiàn)象。有益效果
本發(fā)明的小偃麥異代換系中外源染色體的微分離方法，其方法簡單，易于操作，便于廣泛應(yīng)用于小麥遺傳背景中其他外源染色體的分離，并且實(shí)用性強(qiáng)。本發(fā)明的小偃麥異代換系中外源染色體的微分離技術(shù)，采用小麥-中間偃麥草異代換系山農(nóng)0095與其親本普通小麥煙農(nóng)15的雜種F1代花粉母細(xì)胞為材料，利用“原位”移膜法制備含有外源染色體的標(biāo)本，其制片簡單、快速、方便。本發(fā)明的小偃麥異代換系中外源染色體的微分離技術(shù)，根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)理論，能夠快速、準(zhǔn)確識(shí)別染色體標(biāo)本中的外源染色體以及具有其他明顯細(xì)胞學(xué)特征的目標(biāo)染色體。本發(fā)明的小偃麥異代換系中外源染色體的微分離技術(shù)，采用適于單條染色體為目標(biāo)染色體進(jìn)行酶切，以便于微克隆的篩選和鑒定研究。本發(fā)明的小偃麥異代換系中外源染色體的微分離技術(shù)，在對(duì)SLy CELLCUT顯微切割系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)參數(shù)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，提出了小麥染色體切割所需的染色體標(biāo)本制備、目標(biāo)染色體的微分離、微分離染色體的鑒定等技術(shù)，為其他作物應(yīng)用該系統(tǒng)鑒定了實(shí)踐基礎(chǔ)，大大拓寬了該系統(tǒng)的使用范圍和利用效率，提高了相對(duì)經(jīng)濟(jì)效益。


圖I為小麥根尖染色體標(biāo)本圖譜；
圖2為花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本圖譜；
圖3為PCR產(chǎn)物II和PCR產(chǎn)物IV的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜；
圖中標(biāo)號(hào)點(diǎn)樣孔1、13 :1&^1 ^，點(diǎn)樣孔2、10 :中國春單細(xì)胞染色體，點(diǎn)樣孔3、9 :中國春的2條染色體，點(diǎn)樣孔4、8 :中國春的I條染色體，點(diǎn)樣孔5 :中間偃麥草外源染色體I條染色體，點(diǎn)樣孔6 :中國春的3條染色體，點(diǎn)樣孔7 :中間偃麥草基因組DNA，點(diǎn)樣孔11 :對(duì)照 DNA溶液、點(diǎn)樣孔12 :去離子水。
具體實(shí)施例方式小偃麥異代換系中外源染色體的微分離方法，包括以下步驟
步驟一、小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備
O按重量份數(shù)比取O. 5份的中國春小麥種子和O. 5份的山農(nóng)小麥種子，混合均勻，后將混合后的小麥種子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麥種子，在溫度為I一4°C條件下，放置24小時(shí)，后在溫度為25°C條件下培養(yǎng)使小麥種子發(fā)芽，繼續(xù)培養(yǎng)至新生小麥根長為I. 5 — 2. Ocm時(shí)，取O. 5—0. 8cm的根尖部位，備用；
2)取步驟I)中的小麥根尖放在0°C的冰水混合物中，放置24小時(shí)后取出小麥根尖放于2—3份的溫度為1—4°C的卡諾氏液中，放置24小時(shí)，取出，將小麥根尖放于質(zhì)量濃度為 70%的酒精中，備用；
3)試劑的配制
①混合酶液按重量份數(shù)比取I份質(zhì)量濃度為2%的纖維素酶和I份質(zhì)量濃度為2%的果膠酶，混合均勻，制得混合酶液；
②石炭酸品紅溶液取3g的堿性品紅和IOOml質(zhì)量濃度為70%的乙醇，混合均勻，形成原液a，備用；
取IOml原液a和90ml質(zhì)量濃度為5%的石炭酸水溶液，混合均勻，形成原液b，備用；
取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml質(zhì)量濃度為37%的福爾馬林，混合均勻，形成原液c，備用；
取10 — 20ml的原液c、80— 90ml質(zhì)量濃度為45%的乙酸和I. 8g的山梨醇，混合均勻， 制得石炭酸品紅溶液，備用；
4)將步驟2)中的小麥根尖從酒精中取出，將Ig的小麥根尖浸泡在IOml的蒸餾水中， 放置10分鐘，過濾，得到浸泡后的小麥根尖，將浸泡后的小麥根尖放在電子顯微鏡的載物臺(tái)上，進(jìn)行初步鏡檢，得到有絲分裂中期的根尖細(xì)胞染色體，后將有絲分裂中期的根尖細(xì)胞染色體加到Iml步驟3)中得到的混合酶液中，在溫度為37°C條件下，酶解I一I. 5小時(shí)，形成酶解物I，利用無菌蒸餾水對(duì)酶解物I沖洗10分鐘，在O. 5ml的離心管a內(nèi)加入50 μ g 的酶解物I和50 μ I步驟3)中得到的石炭酸品紅溶液，混合均勻，形成混合物，將混合物涂在載玻片上，在含有混合物的載玻片上覆蓋一層分離膜，壓緊分離膜和載玻片，使混合物附著在分離膜上，后將分離膜與載玻片分離，在分離膜的表面上形成混合物痕跡，利用質(zhì)量濃度為75%的酒精對(duì)分離膜上的混合物痕跡進(jìn)行第一次細(xì)胞內(nèi)脫水，脫水步驟為將質(zhì)量濃度為75%的酒精滴加在含有混合物痕跡的分離膜上，放置3分鐘，后利用蒸餾水對(duì)分離膜沖洗I分鐘，晾干，然后依據(jù)第一次細(xì)胞內(nèi)脫水的方法，利用質(zhì)量濃度為100%的酒精對(duì)分離膜上的混合物痕跡進(jìn)行第二次細(xì)胞內(nèi)脫水，制得小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本；
步驟二、花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備
1)取處于減數(shù)分裂中期I的小麥-中間偃麥草異代換系山農(nóng)0095與小麥品種煙農(nóng)15 的雜種F1代花粉母細(xì)胞，備用；
2)按重量份數(shù)比取I份步驟I)中得到的花粉母細(xì)胞和2—3份的卡諾氏液，將花粉母細(xì)胞放于I一4°C的卡諾氏液中，放置3 — 24小時(shí)，取出，將花粉母細(xì)胞放在質(zhì)量濃度為70% 的酒精中，備用；
3)將步驟2)中的花粉母細(xì)胞從質(zhì)量濃度為70%的酒精中取出，將Ig的花粉母細(xì)胞浸泡在IOml的蒸餾水中，放置10分鐘，過濾，得到浸泡后的花粉母細(xì)胞，將浸泡后的花粉母細(xì)胞加到Iml步驟一)中得到的混合酶液中，在溫度為37°C條件下，酶解I小時(shí)，形成酶解物 II，利用無菌蒸餾水對(duì)酶解物II沖洗10分鐘，將酶解物II涂在載玻片上，在含有酶解物II 的載玻片上覆蓋一層分離膜，壓緊分離膜和載玻片，使酶解物II附著在分離膜上，后將分離膜與載玻片分離，在分離膜的表面上形成酶解物II痕跡，利用質(zhì)量濃度為70%的酒精對(duì)分離膜上的酶解物II痕跡進(jìn)行第一次細(xì)胞內(nèi)脫水，脫水步驟為將質(zhì)量濃度為70%的酒精滴加在含有酶解物II痕跡的分離膜上，放置3分鐘，后利用蒸餾水對(duì)分離膜沖洗I分鐘，晾干， 然后依據(jù)第一次細(xì)胞內(nèi)脫水的方法，利用質(zhì)量濃度為100%的酒精對(duì)分離膜上的酶解物II 痕跡進(jìn)行第二次細(xì)胞內(nèi)脫水，制得花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本，備用；
步驟三、小麥根尖細(xì)胞染色體的顯微分離
在步驟一中制得的小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的載玻片上滴加20μ I無水乙醇，后在載玻片上覆蓋蓋玻片，將載玻片置于SL μ CELIXUT顯微切割系統(tǒng)的載物臺(tái)上，在4Χ物鏡下找到目標(biāo)染色體，然后轉(zhuǎn)換至40Χ物鏡下，對(duì)染色體的單價(jià)體進(jìn)行切割，收集切割后的單根尖細(xì)胞染色體存放在I. 5ml離心管a中，備用；
步驟四、花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割
依據(jù)步驟三的操作方法對(duì)花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割，將切割收集后的花粉母細(xì)胞染色體存放在I. 5ml離心管b中，備用；
步驟五、對(duì)切割后的小麥根尖細(xì)胞染色體和花粉母細(xì)胞染色體分別進(jìn)行DOP-PCR擴(kuò)增
1)試劑配制及兼并引物序列的合成
蛋白酶K處理液在500 μ I的I XTaq DNA聚合酶緩沖液中加入O. 3mg的蛋白酶K，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為600ng/l·! I的蛋白酶K母液，后用IXTaq DNA聚合酶緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為20ng/l·! I的蛋白酶K處理液，備用；
兼并引物序列5’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ；
2)小麥根尖細(xì)胞染色體的預(yù)處理
將步驟二中得到的小麥根尖染色體放在O. 5ml離心管b內(nèi)，后在含有小麥根尖染色體的O. 5ml離心管b內(nèi)加入20 μ I步驟I)中得到的質(zhì)量濃度為20ng/μ I的蛋白酶K處理液， 混合均勻，形成混合液，將含有混合液的O. 5ml離心管b置于37°C條件下，放置4小時(shí)，然后將O. 5ml離心管b放于離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，得到上層液體，將上層液體放在70°C條件下，滅菌20分鐘，取出，得到處理后的小麥根尖目標(biāo)染色體，備用；
3)花粉母細(xì)胞染色體的預(yù)處理
依據(jù)步驟2)中對(duì)小麥根尖細(xì)胞染色體的預(yù)處理方法對(duì)花粉母細(xì)胞染色體進(jìn)行預(yù)處理， 得到花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體，備用；
4)小麥根尖目標(biāo)染色體的DOP-PCR擴(kuò)增
第一次PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系I :在0.5ml離心管c中加入24. 6 μ I的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體、
4μ I的10XPCR緩沖液，3 μ I質(zhì)量濃度為25mmol/L的Mg2+、4 μ I濃度為25mmol/L的三磷酸脫氧核糖核苷混合液、O. 4μ I質(zhì)量濃度為5υ/μ I的TaqDNA聚合酶、2 μ I的兼并引物和 12 μ I的去離子水,形成反應(yīng)體系I ,備用；
PCR程序?qū)⒎磻?yīng)體系I放入PCR儀內(nèi)，94°C預(yù)變性10分鐘，94°C變性I. 5分鐘、50°C退火I. 5分鐘、72°C延伸3分鐘，PCR擴(kuò)增共5個(gè)循環(huán)，然后94°C變性I. 5分鐘、57°C退火I. 5 分鐘、72°C延伸I. 5分鐘，PCR擴(kuò)增共25個(gè)循環(huán)，72°C再次延伸10分鐘，形成PCR產(chǎn)物I， 備用;
第二次PCR擴(kuò)增
將PCR反應(yīng)體系I配制過程中的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體替換為PCR產(chǎn)物I，按照相同方法配制成PCR體系II，后依據(jù)第一次PCR擴(kuò)增中PCR程序的方法進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物II，備用；
5)花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的DOP-PCR擴(kuò)增第一次PCR擴(kuò)增
將步驟4)中PCR反應(yīng)體系I配制過程中的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體替換為處理后的花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體，按照相同方法配制成PCR反應(yīng)體系III，后依據(jù)步驟4)中第一次 PCR擴(kuò)增中PCR程序的方法進(jìn)行花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第一次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物 III，備用；
第二次PCR擴(kuò)增
將PCR反應(yīng)體系III配制過程中的處理后的花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體替換為PCR產(chǎn)物III， 按照相同方法配制成PCR體系IV，后依據(jù)花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第一次PCR擴(kuò)增中PCR 程序的方法進(jìn)行花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第二次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物IV，備用；
步驟六、利用聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物II和PCR產(chǎn)物II，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)PCR產(chǎn)物II中含有切割后的普通小麥染色體的目的基因，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn) PCR產(chǎn)物IV中含有切割后的中間偃麥草外源染色體的目的基因。露白就是種子在合適的溫度、水分條件下，發(fā)生吸水膨脹，胚根伸長，露出白的芽，叫露白，屬于種子發(fā)芽過程中的一個(gè)生理現(xiàn)象。實(shí)施例I
小偃麥異代換系中外源染色體的微分離技術(shù)，包括以下步驟
步驟一、SL μ CELIXUT系統(tǒng)參數(shù)的設(shè)置
I)普通光源照明強(qiáng)度將普通光源的照明強(qiáng)度設(shè)置為120V/100W。2)紫外激光參數(shù)設(shè)置
在普通光源為120V/100W的照明強(qiáng)度下，將紫外激光的參數(shù)分別設(shè)置為100Χ物鏡、 激光速度為10，聚焦為49、激光能量為60，40X物鏡、激光速度為51，聚焦為50、激光能量為75，20 X物鏡、激光速度為59、聚焦為74、激光能量為66，IOX物鏡、激光速度為49，聚焦為72、激光能量為79，4Χ物鏡、激光速度為82，聚焦為79、激光能量為70 ；
3)切割樣本的選擇
使用軟件中所列的圓形工具進(jìn)行繪圖，完成對(duì)樣本的切割，避免激光在切割過程中由于熱效應(yīng)造成對(duì)樣本的損傷；
4)單步收集
在操作CellCut 顯微切割系統(tǒng)時(shí)，在4Χ物鏡、IOX物鏡下進(jìn)行目標(biāo)染色體的微切
割;
步驟二、小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備1)按重量份數(shù)比取O.5份的中國春小麥種子和O. 5份的山農(nóng)小麥種子，混合均勻，后將混合后的小麥種子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麥種子，在溫度為1°C條件下，放置 24小時(shí)，后在溫度為25°C條件下培養(yǎng)使小麥種子發(fā)芽，繼續(xù)培養(yǎng)至新生小麥根長為I. 5cm 時(shí)，取O. 5cm的根尖部位，備用；
2)取步驟I)中的小麥根尖放在0°C的冰水混合物中，放置24小時(shí)后取出小麥根尖放于2份的溫度為1°C的卡諾氏液中，放置24小時(shí),取出，將小麥根尖放于質(zhì)量濃度為70%的酒精中，備用；
3)試劑的配制
①混合酶液按重量份數(shù)比取I份質(zhì)量濃度為2%的纖維素酶和I份質(zhì)量濃度為2%的果膠酶，混合均勻，制得混合酶液；
②石炭酸品紅溶液取3g的堿性品紅和IOOml質(zhì)量濃度為70%的乙醇，混合均勻，形成原液a，備用；
取IOml原液a和90ml質(zhì)量濃度為5%的石炭酸水溶液，混合均勻，形成原液b，備用；
取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml質(zhì)量濃度為37%的福爾馬林，混合均勻，形成原液c，備用；
取IOml的原液c、90ml質(zhì)量濃度為45%的乙酸和I. 8g的山梨醇，混合均勻，制得石炭 Ife品紅溶液，備用；
4)將步驟2)中的小麥根尖從酒精中取出，將Ig的小麥根尖浸泡在IOml的蒸餾水中， 放置10分鐘，過濾，得到浸泡后的小麥根尖，將浸泡后的小麥根尖放在電子顯微鏡的載物臺(tái)上，進(jìn)行初步鏡檢，得到有絲分裂中期的根尖細(xì)胞染色體，后將有絲分裂中期的根尖細(xì)胞染色體加到Iml步驟3)中得到的混合酶液中，在溫度為37°C條件下，酶解I小時(shí)，形成酶解物I，利用無菌蒸餾水對(duì)酶解物I沖洗10分鐘，在O. 5ml的離心管a內(nèi)加入50 μ g的酶解物I和50μ I步驟3)中得到的石炭酸品紅溶液，混合均勻，形成混合物，將混合物涂在載玻片上，在含有混合物的載玻片上覆蓋一層分離膜，壓緊分離膜和載玻片，使混合物附著在分離膜上，后將分離膜與載玻片分離，在分離膜的表面上形成混合物痕跡，利用質(zhì)量濃度為75%的酒精對(duì)分離膜上的混合物痕跡進(jìn)行第一次細(xì)胞內(nèi)脫水，脫水步驟為將質(zhì)量濃度為75%的酒精滴加在含有混合物痕跡的分離膜上，放置3分鐘，后利用蒸餾水對(duì)分離膜沖洗 I分鐘，晾干，然后依據(jù)第一次細(xì)胞內(nèi)脫水的方法，利用質(zhì)量濃度為100%的酒精對(duì)分離膜上的混合物痕跡進(jìn)行第二次細(xì)胞內(nèi)脫水，制得小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本；
步驟三、花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備
1)取處于減數(shù)分裂中期I的小麥-中間偃麥草異代換系山農(nóng)0095與小麥品種煙農(nóng)15 的雜種F1代花粉母細(xì)胞，備用；
2)按重量份數(shù)比取I份步驟I)中得到的花粉母細(xì)胞和2份的卡諾氏液，將花粉母細(xì)胞放于1°C的卡諾氏液中，放置3小時(shí)，取出，將花粉母細(xì)胞放在質(zhì)量濃度為70%的酒精中，備用；
3)將步驟2)中的花粉母細(xì)胞從質(zhì)量濃度為70%的酒精中取出，將Ig的花粉母細(xì)胞浸泡在IOml的蒸餾水中，放置10分鐘，過濾，得到浸泡后的花粉母細(xì)胞，將浸泡后的花粉母細(xì)胞加到Iml步驟一)中得到的混合酶液中，在溫度為37°C條件下，酶解I小時(shí)，形成酶解物
II，利用無菌蒸餾水對(duì)酶解物II沖洗10分鐘，將酶解物II涂在載玻片上，在含有酶解物II的載玻片上覆蓋一層分離膜，壓緊分離膜和載玻片，使酶解物II附著在分離膜上，后將分離膜與載玻片分離，在分離膜的表面上形成酶解物II痕跡，利用質(zhì)量濃度為70%的酒精對(duì)分離膜上的酶解物II痕跡進(jìn)行第一次細(xì)胞內(nèi)脫水，脫水步驟為將質(zhì)量濃度為70%的酒精滴加在含有酶解物II痕跡的分離膜上，放置3分鐘，后利用蒸餾水對(duì)分離膜沖洗I分鐘，晾干， 然后依據(jù)第一次細(xì)胞內(nèi)脫水的方法，利用質(zhì)量濃度為100%的酒精對(duì)分離膜上的酶解物II 痕跡進(jìn)行第二次細(xì)胞內(nèi)脫水，制得花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本，備用；
步驟四、小麥根尖細(xì)胞染色體的顯微分離
在步驟二中制得的小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的載玻片上滴加20 μ I無水乙醇，后在載玻片上覆蓋蓋玻片，將載玻片置于SL μ CELIXUT顯微切割系統(tǒng)的載物臺(tái)上，在4Χ物鏡下找到目標(biāo)染色體，然后轉(zhuǎn)換至40X物鏡下，對(duì)染色體的單價(jià)體進(jìn)行切割，收集切割后的單根尖細(xì)胞染色體存放在I. 5ml離心管a中，備用；
步驟五、花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割
依據(jù)步驟四的操作方法對(duì)花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割，將切割收集后的花粉母細(xì)胞染色體存放在I. 5ml離心管b中，備用；
步驟六、對(duì)切割后的小麥根尖細(xì)胞染色體和花粉母細(xì)胞染色體分別進(jìn)行DOP-PCR擴(kuò)增
1)試劑配制及兼并引物序列的合成
蛋白酶K處理液在500 μ I的I XTaq DNA聚合酶緩沖液中加入O. 3mg的蛋白酶K，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為600ng/l·! I的蛋白酶K母液，后用IXTaq DNA聚合酶緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為20ng/l·! I的蛋白酶K處理液，備用；
兼并引物序列5’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ；
2)小麥根尖細(xì)胞染色體的預(yù)處理
將步驟二中得到的小麥根尖染色體放在O. 5ml離心管b內(nèi)，后在含有小麥根尖染色體的O. 5ml離心管b內(nèi)加入20 μ I步驟I)中得到的質(zhì)量濃度為20ng/μ I的蛋白酶K處理液，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的O. 5ml離心管b置于37°C條件下，放置4 小時(shí)，然后將O. 5ml離心管b放于離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，得到上層液體，將上層液體放在70°C條件下，滅菌20分鐘，取出，得到處理后的小麥根尖目標(biāo)染色體，備用；
3)花粉母細(xì)胞染色體的預(yù)處理
依據(jù)步驟2)中對(duì)小麥根尖細(xì)胞染色體的預(yù)處理方法對(duì)花粉母細(xì)胞染色體進(jìn)行預(yù)處理， 得到花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體，備用；
4)小麥根尖目標(biāo)染色體的DOP-PCR擴(kuò)增
第一次PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系I :在0.5ml離心管c中加入24. 6 μ I的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體、
4μ I的10XPCR緩沖液，3 μ I質(zhì)量濃度為25mmol/L的Mg2+、4 μ I濃度為25mmol/L的三磷酸脫氧核糖核苷混合液、O. 4μ I質(zhì)量濃度為5υ/μ I的TaqDNA聚合酶、2 μ I的兼并引物和 12 μ I的去離子水,形成反應(yīng)體系I ,備用；
PCR程序?qū)⒎磻?yīng)體系I放入PCR儀內(nèi)，94°C預(yù)變性10分鐘，94°C變性I. 5分鐘、50°C退火I. 5分鐘、72°C延伸3分鐘，PCR擴(kuò)增共5個(gè)循環(huán)，然后94°C變性I. 5分鐘、57°C退火I. 5 分鐘、72°C延伸I. 5分鐘，PCR擴(kuò)增共25個(gè)循環(huán)，72°C再次延伸10分鐘，形成PCR產(chǎn)物I，備用;
第二次PCR擴(kuò)增
將PCR反應(yīng)體系I配制過程中的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體替換為PCR產(chǎn)物I，按照相同方法配制成PCR體系II，后依據(jù)第一次PCR擴(kuò)增中PCR程序的方法進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物II，備用；
5)花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的DOP-PCR擴(kuò)增第一次PCR擴(kuò)增
將步驟4)中PCR反應(yīng)體系I配制過程中的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體替換為處理后的花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體，按照相同方法配制成PCR反應(yīng)體系III，后依據(jù)步驟4)中第一次 PCR擴(kuò)增中PCR程序的方法進(jìn)行花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第一次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物 III，備用；
第二次PCR擴(kuò)增
將PCR反應(yīng)體系III配制過程中的處理后的花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體替換為PCR產(chǎn)物III， 按照相同方法配制成PCR體系IV，后依據(jù)花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第一次PCR擴(kuò)增中PCR 程序的方法進(jìn)行花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第二次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物IV，備用；
6)將處理后小麥根尖目標(biāo)染色體分別替換為無菌去離子水、中國春基因組DNA和中間偃麥草基因組DNA，后依據(jù)步驟4)的方法對(duì)無菌去離子水、中國春基因組DNA、中間偃麥草基因組DNA進(jìn)行DOP-PCR擴(kuò)增，得到無菌去離子水?dāng)U增產(chǎn)物、中國春基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物和中間偃麥草基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，將中國春基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物和中間偃麥草基因組DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物作為陽性對(duì)照，無菌去離子水?dāng)U增產(chǎn)物作為陰性對(duì)照；
步驟七、利用丙稀酰胺凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物II和PCR產(chǎn)物IV進(jìn)行檢測 O電泳試劑的配制取39g的丙稀酰胺、Ig的甲叉雙丙稀酰胺和IOOmL的水，混合均勻，形成丙稀酰胺母液，備用；
取19. 5mL的去離子水、6mL的5 X TBE緩沖液、4. 5mL的丙稀酰胺母液、16 μ L的TEMED 和160 μ L質(zhì)量濃度為O. lg/mL的過硫酸氨，混合均勻，形成6%聚丙烯酰胺凝膠溶液，備用； 取40mL的乙醇、360mL的水和2mL的乙酸,混合均勻，形成固定液,備用；
取O. 6g的AgNO3和300mL的水，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為O. 2%的銀染液，備用；
取12g的Na0H、2mL的甲醛和400mL的水，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為3%的顯影液，備
用；
取30mL的乙酸和270mL的水，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為10%的乙酸，備用；
2)將步驟I)中得到的6%聚丙烯酰胺凝膠溶液倒入聚丙烯酰胺凝膠制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5μ L的擴(kuò)增產(chǎn)物II、5 μ L的PCR產(chǎn)物IV、5 μ L的對(duì)照DNA溶液、5 μ L的中國春基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物、
5μ L的中間偃麥草基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物、5 μ L的去離子水反應(yīng)產(chǎn)物和2 μ LDNA分子量標(biāo)準(zhǔn) Marker，打開電泳儀開關(guān)，在電泳儀電壓為120伏特時(shí)開始電泳，電泳3小時(shí)后關(guān)閉電泳儀， 將凝膠從電泳盒內(nèi)取出，備用；
3)將凝膠放在步驟I)中得到的固定液中，放置3分鐘，固定液的量淹沒凝膠即可，后取出凝膠，利用去離子水對(duì)凝膠洗滌2次，每次30秒，然后將凝膠放在步驟I)中得到的銀染液中，放置5分鐘，銀染液的量淹沒凝膠即可，取出凝膠，將凝膠放在步驟I)中得到的質(zhì)量濃度為3%的顯影液中，放置10分鐘，取出，用蒸餾水對(duì)凝膠洗滌一次，后將凝膠放在步驟 O中得到的質(zhì)量濃度為10%的乙酸中，備用；
4)將步驟3)中的凝膠放于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)在點(diǎn)樣孔內(nèi)出現(xiàn)切割后的中間偃麥草外源染色體的目的基因和普通小麥染色體的目的基因。其中，中國春基因組對(duì)照DNA溶液的制備方法為
1)將5g中間偃麥草葉片置于_60°C的液氮中,放置6小時(shí),取出研成粉末,后將粉末放入50mL離心管內(nèi)，備用；
2)在含有粉末的50mL離心管內(nèi)加入20mL溫度為65°C的提取液和100μ L質(zhì)量濃度為 10mg/mL的蛋白酶K，混合混勻，形成混合液II，后將含有混合液II的50mL離心管置于溫度為65°C的水浴鍋內(nèi)，放置I小時(shí)，取出，后在50mL離心管內(nèi)加入20mL的酚和氯仿混合液， 混合均勻，形成混合液III，將含有混合液III的50mL離心管送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn) /分鐘，離心20分鐘，得到上層澄清液體a，備用；
3)在I.5mL離心管c內(nèi)加入500 μ L步驟2)中得到的上層澄清液體a和500 μ L的氯仿，混合均勻，形成混合液IV，將含有混合液IV的I. 5mL離心管c送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為 3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，得到上層澄清液體b，備用；
4)在I.5mL離心管d內(nèi)加入500 μ L步驟3)中得到的上層澄清液體b和300 μ L的異丙醇，混合均勻，形成混合液V，將含有混合液V的I. 5mL離心管d送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為 3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，得到沉淀物，將沉淀物用質(zhì)量濃度為70%的乙醇洗滌一次，晾干，備用；
5)在IOmL離心管a內(nèi)加入步驟4)中得到的沉淀物、4mL的IXTE溶液和10μ L質(zhì)量濃度為10mg/mL的RNA酶，混合均勻，后在溫度為37°C條件下，放置I小時(shí)，后加入4mL的酚和氯仿混合液，混合均勻，形成混合液VI，將含有混合液VI的IOmL離心管a送入離心機(jī)內(nèi)， 以轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，得到上層澄清液體C，備用；
6)在IOmL離心管b內(nèi)加入5mL步驟5)中得到的上層澄清液體c和5mL的氯仿，混合均勻，形成混合液VL將含有混合液VII的IOmL離心管b送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/ 分鐘，離心15分鐘，得到上層澄清液體d，備用；
7)在I.5mL離心管e內(nèi)加入300 μ L的上層澄清液體d、30 μ L的質(zhì)量濃度為3mol/L的醋酸鈉和600 μ L的無水乙醇，混合均勻，挑出離心管內(nèi)的絮狀物，用質(zhì)量濃度為70%的乙醇對(duì)絮狀物洗滌I次，晾干，后將絮狀物溶解到40 μ L的I X TE溶液中，形成中國春基因組DNA 對(duì)照溶液，備用；
依據(jù)中國春基因組DNA對(duì)照溶液的制備方法，制備中間偃麥草基因組DNA對(duì)照溶液。實(shí)施例2
小偃麥異代換系中外源染色體的微分離技術(shù)，包括以下步驟
步驟一、SL μ CELIXUT系統(tǒng)參數(shù)的設(shè)置
I)普通光源照明強(qiáng)度將普通光源的照明強(qiáng)度設(shè)置為120V/100W。2)紫外激光參數(shù)設(shè)置
在普通光源為120V/100W的照明強(qiáng)度下，將紫外激光的參數(shù)分別設(shè)置為100X物鏡、激光速度為10，聚焦為49、激光能量為60，40X物鏡、激光速度為51，聚焦為50、激光能量為75，20 X物鏡、激光速度為59、聚焦為74、激光能量為66，IOX物鏡、激光速度為49，聚焦為72、激光能量為79，4X物鏡、激光速度為82，聚焦為79、激光能量為70 ；
3)切割樣本的選擇
使用軟件中所列的圓形工具進(jìn)行繪圖，完成對(duì)樣本的切割，避免激光在切割過程中由于熱效應(yīng)造成對(duì)樣本的損傷；
4)單步收集
在操作CellCut 顯微切割系統(tǒng)時(shí)，在4X物鏡、IOX物鏡下進(jìn)行目標(biāo)染色體的微切
割;
步驟二、小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備
1)按重量份數(shù)比取O.5份的中國春小麥種子和O. 5份的山農(nóng)小麥種子，混合均勻，后將混合后的小麥種子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麥種子，在溫度為2°C條件下，放置 24小時(shí)，后在溫度為25°C條件下培養(yǎng)使小麥種子發(fā)芽，繼續(xù)培養(yǎng)至新生小麥根長為I. 8cm 時(shí)，取O. 7cm的根尖部位，備用；
2)取步驟I)中的小麥根尖放在0°C的冰水混合物中，放置24小時(shí)后取出小麥根尖放于2份的溫度為2°C的卡諾氏液中，放置24小時(shí),取出，將小麥根尖放于質(zhì)量濃度為70%的酒精中，備用；
3)試劑的配制
①混合酶液按重量份數(shù)比取I份質(zhì)量濃度為2%的纖維素酶和I份質(zhì)量濃度為2%的果膠酶，混合均勻，制得混合酶液；
②石炭酸品紅溶液取3g的堿性品紅和IOOml質(zhì)量濃度為70%的乙醇，混合均勻，形成原液a，備用；
取IOml原液a和90ml質(zhì)量濃度為5%的石炭酸水溶液，混合均勻，形成原液b，備用；
取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml質(zhì)量濃度為37%的福爾馬林，混合均勻，形成原液c，備用；
取15ml的原液c、85ml質(zhì)量濃度為45%的乙酸和I. 8g的山梨醇，混合均勻，制得石炭 Ife品紅溶液，備用；
4)將步驟2)中的小麥根尖從酒精中取出，將Ig的小麥根尖浸泡在IOml的蒸餾水中， 放置10分鐘，過濾，得到浸泡后的小麥根尖，將浸泡后的小麥根尖放在電子顯微鏡的載物臺(tái)上，進(jìn)行初步鏡檢，得到有絲分裂中期的根尖細(xì)胞染色體，后將有絲分裂中期的根尖細(xì)胞染色體加到Iml步驟3)中得到的混合酶液中，在溫度為37°C條件下，酶解I. 3小時(shí)，形成酶解物I，利用無菌蒸餾水對(duì)酶解物I沖洗10分鐘，在O. 5ml的離心管a內(nèi)加入50 μ g的酶解物I和50μ I步驟3)中得到的石炭酸品紅溶液，混合均勻，形成混合物，將混合物涂在載玻片上，在含有混合物的載玻片上覆蓋一層分離膜，壓緊分離膜和載玻片，使混合物附著在分離膜上，后將分離膜與載玻片分離，在分離膜的表面上形成混合物痕跡，利用質(zhì)量濃度為75%的酒精對(duì)分離膜上的混合物痕跡進(jìn)行第一次細(xì)胞內(nèi)脫水，脫水步驟為將質(zhì)量濃度為75%的酒精滴加在含有混合物痕跡的分離膜上，放置3分鐘，后利用蒸餾水對(duì)分離膜沖洗 I分鐘，晾干，然后依據(jù)第一次細(xì)胞內(nèi)脫水的方法，利用質(zhì)量濃度為100%的酒精對(duì)分離膜上的混合物痕跡進(jìn)行第二次細(xì)胞內(nèi)脫水，制得小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本；步驟三、花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備
1)取處于減數(shù)分裂中期I的小麥-中間偃麥草異代換系山農(nóng)0095與小麥品種煙農(nóng)15 的雜種F1代花粉母細(xì)胞，備用；
2)按重量份數(shù)比取I份步驟I)中得到的花粉母細(xì)胞和2份的卡諾氏液，將花粉母細(xì)胞放于2°C的卡諾氏液中，放置15小時(shí)，取出，將花粉母細(xì)胞放在質(zhì)量濃度為70%的酒精中，備用；
3)將步驟2)中的花粉母細(xì)胞從質(zhì)量濃度為70%的酒精中取出，將Ig的花粉母細(xì)胞浸泡在IOml的蒸餾水中，放置10分鐘，過濾，得到浸泡后的花粉母細(xì)胞，將浸泡后的花粉母細(xì)胞加到Iml步驟一)中得到的混合酶液中，在溫度為37°C條件下，酶解I小時(shí)，形成酶解物 II，利用無菌蒸餾水對(duì)酶解物II沖洗10分鐘，將酶解物II涂在載玻片上，在含有酶解物II 的載玻片上覆蓋一層分離膜，壓緊分離膜和載玻片，使酶解物II附著在分離膜上，后將分離膜與載玻片分離，在分離膜的表面上形成酶解物II痕跡，利用質(zhì)量濃度為70%的酒精對(duì)分離膜上的酶解物II痕跡進(jìn)行第一次細(xì)胞內(nèi)脫水，脫水步驟為將質(zhì)量濃度為70%的酒精滴加在含有酶解物II痕跡的分離膜上，放置3分鐘，后利用蒸餾水對(duì)分離膜沖洗I分鐘，晾干， 然后依據(jù)第一次細(xì)胞內(nèi)脫水的方法，利用質(zhì)量濃度為100%的酒精對(duì)分離膜上的酶解物II 痕跡進(jìn)行第二次細(xì)胞內(nèi)脫水，制得花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本，備用；
步驟四、小麥根尖細(xì)胞染色體的顯微分離
在步驟二中制得的小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的載玻片上滴加20μ I無水乙醇，后在載玻片上覆蓋蓋玻片，將載玻片置于SL μ CELIXUT顯微切割系統(tǒng)的載物臺(tái)上，在4Χ物鏡下找到目標(biāo)染色體，然后轉(zhuǎn)換至40X物鏡下，對(duì)染色體的單價(jià)體進(jìn)行切割，收集切割后的單根尖細(xì)胞染色體存放在I. 5ml離心管a中，備用；
步驟五、花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割
依據(jù)步驟四的操作方法對(duì)花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割，將切割收集后的花粉母細(xì)胞染色體存放在I. 5ml離心管b中，備用；
步驟六、對(duì)切割后的小麥根尖細(xì)胞染色體和花粉母細(xì)胞染色體分別進(jìn)行DOP-PCR擴(kuò)增
1)試劑配制及兼并引物序列的合成
蛋白酶K處理液在500 μ I的I XTaq DNA聚合酶緩沖液中加入O. 3mg的蛋白酶K，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為600ng/l·! I的蛋白酶K母液，后用IXTaq DNA聚合酶緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為20ng/l·! I的蛋白酶K處理液，備用；
兼并引物序列5’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ；
2)小麥根尖細(xì)胞染色體的預(yù)處理
將步驟二中得到的小麥根尖染色體放在O. 5ml離心管b內(nèi)，后在含有小麥根尖染色體的O. 5ml離心管b內(nèi)加入20 μ I步驟I)中得到的質(zhì)量濃度為20ng/μ I的蛋白酶K處理液，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的O. 5ml離心管b置于37°C條件下，放置4 小時(shí)，然后將O. 5ml離心管b放于離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，得到上層液體，將上層液體放在70°C條件下，滅菌20分鐘，取出，得到處理后的小麥根尖目標(biāo)染色體，備用；
3)花粉母細(xì)胞染色體的預(yù)處理
依據(jù)步驟2)中對(duì)小麥根尖細(xì)胞染色體的預(yù)處理方法對(duì)花粉母細(xì)胞染色體進(jìn)行預(yù)處理，得到花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體，備用；
4)小麥根尖目標(biāo)染色體的DOP-PCR擴(kuò)增第一次PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系I :在0.5ml離心管c中加入24. 6 μ I的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體、
4μ I的10XPCR緩沖液，3 μ I質(zhì)量濃度為25mmol/L的Mg2+、4 μ I濃度為25mmol/L的三磷酸脫氧核糖核苷混合液、O. 4μ I質(zhì)量濃度為5υ/μ I的TaqDNA聚合酶、2 μ I的兼并引物和 12 μ I的去離子水,形成反應(yīng)體系I ,備用；
PCR程序?qū)⒎磻?yīng)體系I放入PCR儀內(nèi)，94°C預(yù)變性10分鐘，94°C變性I. 5分鐘、50°C退火I. 5分鐘、72°C延伸3分鐘，PCR擴(kuò)增共5個(gè)循環(huán)，然后94°C變性I. 5分鐘、57°C退火I. 5 分鐘、72°C延伸I. 5分鐘，PCR擴(kuò)增共25個(gè)循環(huán)，72°C再次延伸10分鐘，形成PCR產(chǎn)物I， 備用;
第二次PCR擴(kuò)增
將PCR反應(yīng)體系I配制過程中的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體替換為PCR產(chǎn)物I，按照相同方法配制成PCR體系II，后依據(jù)第一次PCR擴(kuò)增中PCR程序的方法進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物II，備用；
5)花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的DOP-PCR擴(kuò)增第一次PCR擴(kuò)增
將步驟4)中PCR反應(yīng)體系I配制過程中的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體替換為處理后的花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體，按照相同方法配制成PCR反應(yīng)體系III，后依據(jù)步驟4)中第一次 PCR擴(kuò)增中PCR程序的方法進(jìn)行花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第一次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物 III，備用；
第二次PCR擴(kuò)增
將PCR反應(yīng)體系III配制過程中的處理后的花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體替換為PCR產(chǎn)物III， 按照相同方法配制成PCR體系IV，后依據(jù)花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第一次PCR擴(kuò)增中PCR 程序的方法進(jìn)行花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第二次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物IV，備用；
6)將處理后小麥根尖目標(biāo)染色體分別替換為無菌去離子水、中國春基因組DNA和中間偃麥草基因組DNA，后依據(jù)步驟4)的方法對(duì)無菌去離子水、中國春基因組DNA、中間偃麥草基因組DNA進(jìn)行DOP-PCR擴(kuò)增，得到無菌去離子水?dāng)U增產(chǎn)物、中國春基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物和中間偃麥草基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，將中國春基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物和中間偃麥草基因組DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物作為陽性對(duì)照，無菌去離子水?dāng)U增產(chǎn)物作為陰性對(duì)照；
步驟七、利用丙稀酰胺凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物II和PCR產(chǎn)物IV進(jìn)行檢測 O電泳試劑的配制取39g的丙稀酰胺、Ig的甲叉雙丙稀酰胺和IOOmL的水，混合均勻，形成丙稀酰胺母液，備用；
取19. 5mL的去離子水、6mL的5 X TBE緩沖液、4. 5mL的丙稀酰胺母液、16 μ L的TEMED 和160 μ L質(zhì)量濃度為O. lg/mL的過硫酸氨，混合均勻，形成6%聚丙烯酰胺凝膠溶液，備用； 取40mL的乙醇、360mL的水和2mL的乙酸,混合均勻，形成固定液,備用；
取O. 6g的AgNO3和300mL的水，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為O. 2%的銀染液，備用；
取12g的Na0H、2mL的甲醛和400mL的水，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為3%的顯影液，備
用；取30mL的乙酸和270mL的水，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為10%的乙酸，備用；
2)將步驟I)中得到的6%聚丙烯酰胺凝膠溶液倒入聚丙烯酰胺凝膠制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5μ L的擴(kuò)增產(chǎn)物II、5μ L的PCR產(chǎn)物IV、5y L的對(duì)照DNA溶液、5μ L的中國春基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物、
5μ L的中間偃麥草基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物、5 μ L的去離子水反應(yīng)產(chǎn)物和2 μ LDNA分子量標(biāo)準(zhǔn) Marker，打開電泳儀開關(guān)，在電泳儀電壓為120伏特時(shí)開始電泳，電泳3小時(shí)后關(guān)閉電泳儀， 將凝膠從電泳盒內(nèi)取出，備用；
3)將凝膠放在步驟I)中得到的固定液中，放置3分鐘，固定液的量淹沒凝膠即可，后取出凝膠，利用去離子水對(duì)凝膠洗滌2次，每次30秒，然后將凝膠放在步驟I)中得到的銀染液中，放置5分鐘，銀染液的量淹沒凝膠即可，取出凝膠，將凝膠放在步驟I)中得到的質(zhì)量濃度為3%的顯影液中，放置10分鐘，取出，用蒸餾水對(duì)凝膠洗滌一次，后將凝膠放在步驟 O中得到的質(zhì)量濃度為10%的乙酸中，備用；
4)將步驟3)中的凝膠放于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)在點(diǎn)樣孔內(nèi)出現(xiàn)切割后的中間偃麥草外源染色體的目的基因和普通小麥染色體的目的基因。其中，中國春基因組對(duì)照DNA溶液和中國春基因組DNA對(duì)照溶液的制備方法，與實(shí)施例I相同。實(shí)施例3
小偃麥異代換系中外源染色體的微分離技術(shù)，包括以下步驟
步驟一、SL μ CELIXUT系統(tǒng)參數(shù)的設(shè)置 I)普通光源照明強(qiáng)度將普通光源的照明強(qiáng)度設(shè)置為120V/100W。2)紫外激光參數(shù)設(shè)置
在普通光源為120V/100W的照明強(qiáng)度下，將紫外激光的參數(shù)分別設(shè)置為100Χ物鏡、 激光速度為10，聚焦為49、激光能量為60，40Χ物鏡、激光速度為51，聚焦為50、激光能量為75，20 X物鏡、激光速度為59、聚焦為74、激光能量為66，IOX物鏡、激光速度為49，聚焦為72、激光能量為79，4X物鏡、激光速度為82，聚焦為79、激光能量為70 ；
3)切割樣本的選擇
使用軟件中所列的圓形工具進(jìn)行繪圖，完成對(duì)樣本的切割，避免激光在切割過程中由于熱效應(yīng)造成對(duì)樣本的損傷；
4)單步收集
在操作CellCut 顯微切割系統(tǒng)時(shí)，在4Χ物鏡、IOX物鏡下進(jìn)行目標(biāo)染色體的微切
割;
步驟二、小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備
1)按重量份數(shù)比取O.5份的中國春小麥種子和O. 5份的山農(nóng)小麥種子，混合均勻，后將混合后的小麥種子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麥種子，在溫度為4°C條件下，放置 24小時(shí)，后在溫度為25°C條件下培養(yǎng)使小麥種子發(fā)芽，繼續(xù)培養(yǎng)至新生小麥根長為2. Ocm 時(shí)，取O. 8cm的根尖部位，備用；
2)取步驟I)中的小麥根尖放在0°C的冰水混合物中，放置24小時(shí)后取出小麥根尖放于3份的溫度為4°C的卡諾氏液中，放置24小時(shí),取出，將小麥根尖放于質(zhì)量濃度為70%的酒精中，備用；
3)試劑的配制
①混合酶液按重量份數(shù)比取I份質(zhì)量濃度為2%的纖維素酶和I份質(zhì)量濃度為2%的果膠酶，混合均勻，制得混合酶液；
②石炭酸品紅溶液取3g的堿性品紅和IOOml質(zhì)量濃度為70%的乙醇，混合均勻，形成原液a，備用；
取IOml原液a和90ml質(zhì)量濃度為5%的石炭酸水溶液，混合均勻，形成原液b，備用；
取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml質(zhì)量濃度為37%的福爾馬林，混合均勻，形成原液c，備用；
取20ml的原液c、80ml質(zhì)量濃度為45%的乙酸和I. 8g的山梨醇，混合均勻，制得石炭 Ife品紅溶液，備用；
4)將步驟2)中的小麥根尖從酒精中取出，將Ig的小麥根尖浸泡在IOml的蒸餾水中， 放置10分鐘，過濾，得到浸泡后的小麥根尖，將浸泡后的小麥根尖放在電子顯微鏡的載物臺(tái)上，進(jìn)行初步鏡檢，得到有絲分裂中期的根尖細(xì)胞染色體，后將有絲分裂中期的根尖細(xì)胞染色體加到Iml步驟3)中得到的混合酶液中，在溫度為37°C條件下，酶解I. 5小時(shí)，形成酶解物I，利用無菌蒸餾水對(duì)酶解物I沖洗10分鐘，在O. 5ml的離心管a內(nèi)加入50 μ g的酶解物I和50μ I步驟3)中得到的石炭酸品紅溶液，混合均勻，形成混合物，將混合物涂在載玻片上，在含有混合物的載玻片上覆蓋一層分離膜，壓緊分離膜和載玻片，使混合物附著在分離膜上，后將分離膜與載玻片分離，在分離膜的表面上形成混合物痕跡，利用質(zhì)量濃度為75%的酒精對(duì)分離膜上的混合物痕跡進(jìn)行第一次細(xì)胞內(nèi)脫水，脫水步驟為將質(zhì)量濃度為75%的酒精滴加在含有混合物痕跡的分離膜上，放置3分鐘，后利用蒸餾水對(duì)分離膜沖洗 I分鐘，晾干，然后依據(jù)第一次細(xì)胞內(nèi)脫水的方法，利用質(zhì)量濃度為100%的酒精對(duì)分離膜上的混合物痕跡進(jìn)行第二次細(xì)胞內(nèi)脫水，制得小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本；
步驟三、花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備
1)取處于減數(shù)分裂中期I的小麥-中間偃麥草異代換系山農(nóng)0095與小麥品種煙農(nóng)15 的雜種F1代花粉母細(xì)胞，備用；
2)按重量份數(shù)比取I份步驟I)中得到的花粉母細(xì)胞和3份的卡諾氏液，將花粉母細(xì)胞放于4°C的卡諾氏液中，放置24小時(shí)，取出，將花粉母細(xì)胞放在質(zhì)量濃度為70%的酒精中，備用；
3)將步驟2)中的花粉母細(xì)胞從質(zhì)量濃度為70%的酒精中取出，將Ig的花粉母細(xì)胞浸泡在IOml的蒸餾水中，放置10分鐘，過濾，得到浸泡后的花粉母細(xì)胞，將浸泡后的花粉母細(xì)胞加到Iml步驟一)中得到的混合酶液中，在溫度為37°C條件下，酶解I小時(shí)，形成酶解物 II，利用無菌蒸餾水對(duì)酶解物II沖洗10分鐘，將酶解物II涂在載玻片上，在含有酶解物II 的載玻片上覆蓋一層分離膜，壓緊分離膜和載玻片，使酶解物II附著在分離膜上，后將分離膜與載玻片分離，在分離膜的表面上形成酶解物II痕跡，利用質(zhì)量濃度為70%的酒精對(duì)分離膜上的酶解物II痕跡進(jìn)行第一次細(xì)胞內(nèi)脫水，脫水步驟為將質(zhì)量濃度為70%的酒精滴加在含有酶解物II痕跡的分離膜上，放置3分鐘，后利用蒸餾水對(duì)分離膜沖洗I分鐘，晾干， 然后依據(jù)第一次細(xì)胞內(nèi)脫水的方法，利用質(zhì)量濃度為100%的酒精對(duì)分離膜上的酶解物II痕跡進(jìn)行第二次細(xì)胞內(nèi)脫水，制得花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本，備用；
步驟四、小麥根尖細(xì)胞染色體的顯微分離
在步驟二中制得的小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的載玻片上滴加20 μ I無水乙醇，后在載玻片上覆蓋蓋玻片，將載玻片置于SLy CELIXUT顯微切割系統(tǒng)的載物臺(tái)上，在4Χ物鏡下找到目標(biāo)染色體，然后轉(zhuǎn)換至40Χ物鏡下，對(duì)染色體的單價(jià)體進(jìn)行切割，收集切割后的單根尖細(xì)胞染色體存放在I. 5ml離心管a中，備用；
步驟五、花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割
依據(jù)步驟四的操作方法對(duì)花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割，將切割收集后的花粉母細(xì)胞染色體存放在I. 5ml離心管b中，備用；
步驟六、對(duì)切割后的小麥根尖細(xì)胞染色體和花粉母細(xì)胞染色體分別進(jìn)行DOP-PCR擴(kuò)增
1)試劑配制及兼并引物序列的合成
蛋白酶K處理液在500 μ I的I XTaq DNA聚合酶緩沖液中加入O. 3mg的蛋白酶K，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為600ng/l·! I的蛋白酶K母液，后用IXTaq DNA聚合酶緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為20ng/l·! I的蛋白酶K處理液，備用；
兼并引物序列5’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ；
2)小麥根尖細(xì)胞染色體的預(yù)處理
將步驟二中得到的小麥根尖染色體放在O. 5ml離心管b內(nèi)，后在含有小麥根尖染色體的O. 5ml離心管b內(nèi)加入20μ I步驟I)中得到的質(zhì)量濃度為20ng/μ I的蛋白酶K處理液，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的O. 5ml離心管b置于37°C條件下，放置4 小時(shí)，然后將O. 5ml離心管b放于離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，得到上層液體，將上層液體放在70°C條件下，滅菌20分鐘，取出，得到處理后的小麥根尖目標(biāo)染色體，備用;
3)花粉母細(xì)胞染色體的預(yù)處理
依據(jù)步驟2)中對(duì)小麥根尖細(xì)胞染色體的預(yù)處理方法對(duì)花粉母細(xì)胞染色體進(jìn)行預(yù)處理， 得到花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體，備用；
4)小麥根尖目標(biāo)染色體的DOP-PCR擴(kuò)增
第一次PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系I :在0.5ml離心管c中加入24. 6 μ I的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體、 4 μ I的10XPCR緩沖液，3 μ I質(zhì)量濃度為25mmol/L的Mg2+、4 μ I濃度為25mmol/L的三磷酸脫氧核糖核苷混合液、O. 4μ I質(zhì)量濃度為5υ/μ I的TaqDNA聚合酶、2 μ I的兼并引物和
12μ I的去離子水,形成反應(yīng)體系I ,備用；
PCR程序?qū)⒎磻?yīng)體系I放入PCR儀內(nèi)，94°C預(yù)變性10分鐘，94°C變性I. 5分鐘、50°C退火I. 5分鐘、72°C延伸3分鐘，PCR擴(kuò)增共5個(gè)循環(huán)，然后94°C變性I. 5分鐘、57°C退火I. 5 分鐘、72°C延伸I. 5分鐘，PCR擴(kuò)增共25個(gè)循環(huán)，72°C再次延伸10分鐘，形成PCR產(chǎn)物I， 備用;
第二次PCR擴(kuò)增
將PCR反應(yīng)體系I配制過程中的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體替換為PCR產(chǎn)物I，按照相同方法配制成PCR體系II，后依據(jù)第一次PCR擴(kuò)增中PCR程序的方法進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物II，備用；5)花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的DOP-PCR擴(kuò)增第一次PCR擴(kuò)增
將步驟4)中PCR反應(yīng)體系I配制過程中的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體替換為處理后的花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體，按照相同方法配制成PCR反應(yīng)體系III，后依據(jù)步驟4)中第一次 PCR擴(kuò)增中PCR程序的方法進(jìn)行花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第一次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物 III，備用；
第二次PCR擴(kuò)增
將PCR反應(yīng)體系III配制過程中的處理后的花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體替換為PCR產(chǎn)物III， 按照相同方法配制成PCR體系IV，后依據(jù)花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第一次PCR擴(kuò)增中PCR 程序的方法進(jìn)行花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第二次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物IV，備用；
6)將處理后小麥根尖目標(biāo)染色體分別替換為無菌去離子水、中國春基因組DNA和中間偃麥草基因組DNA，后依據(jù)步驟4)的方法對(duì)無菌去離子水、中國春基因組DNA、中間偃麥草基因組DNA進(jìn)行DOP-PCR擴(kuò)增，得到無菌去離子水?dāng)U增產(chǎn)物、中國春基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物和中間偃麥草基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，將中國春基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物和中間偃麥草基因組DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物作為陽性對(duì)照，無菌去離子水?dāng)U增產(chǎn)物作為陰性對(duì)照；
步驟七、利用丙稀酰胺凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物II和PCR產(chǎn)物IV進(jìn)行檢測 O電泳試劑的配制取39g的丙稀酰胺、Ig的甲叉雙丙稀酰胺和IOOmL的水，混合均勻，形成丙稀酰胺母液，備用；
取19. 5mL的去離子水、6mL的5 X TBE緩沖液、4. 5mL的丙稀酰胺母液、16 μ L的TEMED 和160 μ L質(zhì)量濃度為O. lg/mL的過硫酸氨，混合均勻，形成6%聚丙烯酰胺凝膠溶液，備用； 取40mL的乙醇、360mL的水和2mL的乙酸,混合均勻，形成固定液,備用；
取O. 6g的AgNO3和300mL的水，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為O. 2%的銀染液，備用；
取12g的Na0H、2mL的甲醛和400mL的水，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為3%的顯影液，備
用；
取30mL的乙酸和270mL的水，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為10%的乙酸，備用；
2)將步驟I)中得到的6%聚丙烯酰胺凝膠溶液倒入聚丙烯酰胺凝膠制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5μ L的擴(kuò)增產(chǎn)物II、5μ L的PCR產(chǎn)物IV、5y L的對(duì)照DNA溶液、5μ L的中國春基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物、
5μ L的中間偃麥草基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物、5 μ L的去離子水反應(yīng)產(chǎn)物和2 μ LDNA分子量標(biāo)準(zhǔn) Marker，打開電泳儀開關(guān)，在電泳儀電壓為120伏特時(shí)開始電泳，電泳3小時(shí)后關(guān)閉電泳儀， 將凝膠從電泳盒內(nèi)取出，備用；
3)將凝膠放在步驟I)中得到的固定液中，放置3分鐘，固定液的量淹沒凝膠即可，后取出凝膠，利用去離子水對(duì)凝膠洗滌2次，每次30秒，然后將凝膠放在步驟I)中得到的銀染液中，放置5分鐘，銀染液的量淹沒凝膠即可，取出凝膠，將凝膠放在步驟I)中得到的質(zhì)量濃度為3%的顯影液中，放置10分鐘，取出，用蒸餾水對(duì)凝膠洗滌一次，后將凝膠放在步驟 O中得到的質(zhì)量濃度為10%的乙酸中，備用；
4)將步驟3)中的凝膠放于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)在點(diǎn)樣孔內(nèi)出現(xiàn)切割后的中間偃麥草外源染色體的目的基因和普通小麥染色體的目的基因。
其中，中國春基因組對(duì)照DNA溶液和中國春基因組DNA對(duì)照溶液的制備方法，與實(shí)施例I相同。所述的氯仿和異戊醇混合液的組成成分按體積比氯仿和異戊醇混合液中含有 24份的氯仿和I份的戊醇。所述的IXTE溶液的組成成份每升TE溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、Immol的乙二胺四乙酸，余量為水。所述的5XTBE緩沖液的組成成份每升TBE緩沖液中含有54g的三羥甲基氨基甲烷、27. 5g的硼酸、20mL的乙二胺四乙酸(pH為8. 0)，余量為水。所述的提取液的組成成份每升提取液中含有l(wèi)OOmmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH 為 8. 5)、100mmol/L 的 NaCl、50mmol/L 的乙二胺四乙酸(pH 為 8. O)、2% 的十二
燒基硫酸納，余量為水。
權(quán)利要求
1.小偃麥異代換系中外源染色體的微分離方法，其特征在于包括以下步驟步驟一、小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備O按重量份數(shù)比取O. 5份的中國春小麥種子和O. 5份的山農(nóng)小麥種子，混合均勻，后將混合后的小麥種子放在2份的水中，浸泡至露白，取出小麥種子，在溫度為I一4°C條件下，放置24小時(shí)，后在溫度為25°C條件下培養(yǎng)使小麥種子發(fā)芽，繼續(xù)培養(yǎng)至新生小麥根長為I. 5—2. Ocm時(shí)，取O. 5—0. 8cm的根尖部位，備用；2)取步驟I)中的小麥根尖放在0°C的冰水混合物中，放置24小時(shí)后取出小麥根尖放于2—3份的溫度為1—4°C的卡諾氏液中，放置24小時(shí)，取出，將小麥根尖放于質(zhì)量濃度為 70%的酒精中，備用；3)試劑的配制①混合酶液按重量份數(shù)比取I份質(zhì)量濃度為2%的纖維素酶和I份質(zhì)量濃度為2%的果膠酶，混合均勻，制得混合酶液；②石炭酸品紅溶液取3g的堿性品紅和IOOml質(zhì)量濃度為70%的乙醇，混合均勻，形成原液a，備用；取IOml原液a和90ml質(zhì)量濃度為5%的石炭酸水溶液，混合均勻，形成原液b，備用；取45ml的原液b、6ml的冰乙酸和6ml質(zhì)量濃度為37%的福爾馬林，混合均勻，形成原液c，備用；取10 — 20ml的原液c、80— 90ml質(zhì)量濃度為45%的乙酸和I. 8g的山梨醇，混合均勻， 制得石炭酸品紅溶液，備用；4)將步驟2)中的小麥根尖從酒精中取出，將Ig的小麥根尖浸泡在IOml的蒸餾水中， 放置10分鐘，過濾，得到浸泡后的小麥根尖，將浸泡后的小麥根尖放在電子顯微鏡的載物臺(tái)上，進(jìn)行初步鏡檢，得到有絲分裂中期的根尖細(xì)胞染色體，后將有絲分裂中期的根尖細(xì)胞染色體加到Iml步驟3)中得到的混合酶液中，在溫度為37°C條件下，酶解I一I. 5小時(shí)，形成酶解物I，利用無菌蒸餾水對(duì)酶解物I沖洗10分鐘，在O. 5ml的離心管a內(nèi)加入50 μ g 的酶解物I和50 μ I步驟3)中得到的石炭酸品紅溶液，混合均勻，形成混合物，將混合物涂在載玻片上，在含有混合物的載玻片上覆蓋一層分離膜，壓緊分離膜和載玻片，使混合物附著在分離膜上，后將分離膜與載玻片分離，在分離膜的表面上形成混合物痕跡，利用質(zhì)量濃度為75%的酒精對(duì)分離膜上的混合物痕跡進(jìn)行第一次細(xì)胞內(nèi)脫水，脫水步驟為將質(zhì)量濃度為75%的酒精滴加在含有混合物痕跡的分離膜上，放置3分鐘，后利用蒸餾水對(duì)分離膜沖洗I分鐘，晾干，然后依據(jù)第一次細(xì)胞內(nèi)脫水的方法，利用質(zhì)量濃度為100%的酒精對(duì)分離膜上的混合物痕跡進(jìn)行第二次細(xì)胞內(nèi)脫水，制得小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本；步驟二、花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備1)取處于減數(shù)分裂中期I的小麥-中間偃麥草異代換系山農(nóng)0095與小麥品種煙農(nóng)15 的雜種F1代花粉母細(xì)胞，備用；2)按重量份數(shù)比取I份步驟I)中得到的花粉母細(xì)胞和2—3份的卡諾氏液，將花粉母細(xì)胞放于I一4°C的卡諾氏液中，放置3 — 24小時(shí)，取出，將花粉母細(xì)胞放在質(zhì)量濃度為70% 的酒精中，備用；3)將步驟2)中的花粉母細(xì)胞從質(zhì)量濃度為70%的酒精中取出，將Ig的花粉母細(xì)胞浸泡在IOml的蒸餾水中，放置10分鐘，過濾，得到浸泡后的花粉母細(xì)胞，將浸泡后的花粉母細(xì)胞加到Iml步驟一)中得到的混合酶液中，在溫度為37°C條件下，酶解I小時(shí)，形成酶解物 II，利用無菌蒸餾水對(duì)酶解物II沖洗10分鐘，將酶解物II涂在載玻片上，在含有酶解物II 的載玻片上覆蓋一層分離膜，壓緊分離膜和載玻片，使酶解物II附著在分離膜上，后將分離膜與載玻片分離，在分離膜的表面上形成酶解物II痕跡，利用質(zhì)量濃度為70%的酒精對(duì)分離膜上的酶解物II痕跡進(jìn)行第一次細(xì)胞內(nèi)脫水，脫水步驟為將質(zhì)量濃度為70%的酒精滴加在含有酶解物II痕跡的分離膜上，放置3分鐘，后利用蒸餾水對(duì)分離膜沖洗I分鐘，晾干， 然后依據(jù)第一次細(xì)胞內(nèi)脫水的方法，利用質(zhì)量濃度為100%的酒精對(duì)分離膜上的酶解物II 痕跡進(jìn)行第二次細(xì)胞內(nèi)脫水，制得花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本，備用；步驟三、小麥根尖細(xì)胞染色體的顯微分離在步驟一中制得的小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的載玻片上滴加20μ I無水乙醇，后在載玻片上覆蓋蓋玻片，將載玻片置于SL μ CELIXUT顯微切割系統(tǒng)的載物臺(tái)上，在4Χ物鏡下找到目標(biāo)染色體，然后轉(zhuǎn)換至40Χ物鏡下，對(duì)染色體的單價(jià)體進(jìn)行切割，收集切割后的單根尖細(xì)胞染色體存放在I. 5ml離心管a中，備用；步驟四、花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割依據(jù)步驟三的操作方法對(duì)花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割，將切割收集后的花粉母細(xì)胞染色體存放在I. 5ml離心管b中，備用；步驟五、對(duì)切割后的小麥根尖細(xì)胞染色體和花粉母細(xì)胞染色體分別進(jìn)行DOP-PCR擴(kuò)增1)試劑配制及兼并引物序列的合成蛋白酶K處理液在500 μ I的I XTaq DNA聚合酶緩沖液中加入O. 3mg的蛋白酶K，混合均勻，形成質(zhì)量濃度為600ng/l·! I的蛋白酶K母液，后用IXTaq DNA聚合酶緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為20ng/l·! I的蛋白酶K處理液，備用；兼并引物序列5’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ；2)小麥根尖細(xì)胞染色體的預(yù)處理將步驟二中得到的小麥根尖染色體放在O. 5ml離心管b內(nèi)，后在含有小麥根尖染色體的O. 5ml離心管b內(nèi)加入20 μ I步驟I)中得到的質(zhì)量濃度為20ng/μ I的蛋白酶K處理液， 混合均勻，形成混合液，將含有混合液的O. 5ml離心管b置于37°C條件下，放置4小時(shí)，然后將O. 5ml離心管b放于離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，得到上層液體，將上層液體放在70°C條件下，滅菌20分鐘，取出，得到處理后的小麥根尖目標(biāo)染色體，備用；3)花粉母細(xì)胞染色體的預(yù)處理依據(jù)步驟2)中對(duì)小麥根尖細(xì)胞染色體的預(yù)處理方法對(duì)花粉母細(xì)胞染色體進(jìn)行預(yù)處理， 得到花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體，備用；4)小麥根尖目標(biāo)染色體的DOP-PCR擴(kuò)增第一次PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系I :在O. 5ml離心管c中加入24. 6 μ I的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體、 4 μ I的10XPCR緩沖液，3 μ I質(zhì)量濃度為25mmol/L的Mg2+、4 μ I濃度為25mmol/L的三磷酸脫氧核糖核苷混合液、O. 4μ I質(zhì)量濃度為5υ/μ I的TaqDNA聚合酶、2 μ I的兼并引物和 12 μ I的去離子水,形成反應(yīng)體系I ,備用；PCR程序?qū)⒎磻?yīng)體系I放入PCR儀內(nèi)，94°C預(yù)變性10分鐘，94°C變性I. 5分鐘、50°C退火I. 5分鐘、72°C延伸3分鐘，PCR擴(kuò)增共5個(gè)循環(huán)，然后94°C變性I. 5分鐘、57°C退火I. 5分鐘、72°C延伸I. 5分鐘，PCR擴(kuò)增共25個(gè)循環(huán)，72°C再次延伸10分鐘，形成PCR產(chǎn)物I， 備用;第二次PCR擴(kuò)增將PCR反應(yīng)體系I配制過程中的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體替換為PCR產(chǎn)物I，按照相同方法配制成PCR體系II，后依據(jù)第一次PCR擴(kuò)增中PCR程序的方法進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物II，備用；5)花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的DOP-PCR擴(kuò)增第一次PCR擴(kuò)增將步驟4)中PCR反應(yīng)體系I配制過程中的處理后小麥根尖目標(biāo)染色體替換為處理后的花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體，按照相同方法配制成PCR反應(yīng)體系III，后依據(jù)步驟4)中第一次 PCR擴(kuò)增中PCR程序的方法進(jìn)行花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第一次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物 III，備用；第二次PCR擴(kuò)增將PCR反應(yīng)體系III配制過程中的處理后的花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體替換為PCR產(chǎn)物III， 按照相同方法配制成PCR體系IV，后依據(jù)花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第一次PCR擴(kuò)增中PCR 程序的方法進(jìn)行花粉母細(xì)胞目標(biāo)染色體的第二次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物IV，備用；步驟六、利用聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物II和PCR產(chǎn)物II，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)PCR產(chǎn)物II中含有切割后的普通小麥染色體的目的基因，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn) PCR產(chǎn)物IV中含有切割后的中間偃麥草外源染色體的目的基因。
全文摘要
小偃麥異代換系中外源染色體的微分離方法，包括1)小麥根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備、2)花粉母細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備3)小麥根尖細(xì)胞染色體的顯微分離、4)花粉母細(xì)胞染色體的顯微切割、5)對(duì)切割后的小麥根尖細(xì)胞染色體和花粉母細(xì)胞染色體分別進(jìn)行DOP-PCR擴(kuò)增并利用聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物Ⅱ和PCR產(chǎn)物Ⅱ，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)PCR產(chǎn)物Ⅱ中含有切割后的普通小麥染色體的目的基因，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)PCR產(chǎn)物Ⅳ中含有切割后的中間偃麥草外源染色體的目的基因。本發(fā)明的制備方法簡單，其鑒定方法簡單，分析簡單，便于染色體的切割與回收，為后續(xù)切割染色體的鑒定與分析奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N5/04GK102604883SQ201210060698
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者王春平, 王黎明, 董普輝, 袁建國, 袁瑛 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)