專利名稱：鴨i型肝炎病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細小病毒的三重pcr試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種鑒定或輔助鑒定鴨相關病毒的引物對組、試劑盒及其應用，特別涉及一種鑒定或輔助鑒定番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨I型肝炎病毒的引物對組、試劑盒及其應用。
背景技術：
鴨I型肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus type I,DHV I)是雛鴨的一種高度致死性的病毒性傳染病的病原。該病主要侵害4周齡以內(nèi)的雛鴨，死亡率高達90%以上，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴重的傳染病之一。鴨圓環(huán)病毒(Duck Circovirus, DuCV)是近年來新發(fā)現(xiàn)的病毒之一，是在2003年由德國學者Hattermann等首先發(fā)現(xiàn)并測定序列的，之后分別在世界各地被發(fā)現(xiàn)報道。Soike等發(fā)現(xiàn)DuCV在臨床上主要使病鴨表現(xiàn)為生長遲緩、羽毛凌亂、體重減輕等癥狀，更重要的是可感染禽類的免疫系統(tǒng)，引起免疫抑制。番鴨細小病毒(Muscovyduckling parvovirus,MDPV),是危害番鴨養(yǎng)殖的重要病原,可引起I周齡 3周齡雛番鴨發(fā)病,致死率可達到50% 80%。目前，這三種病毒的傳統(tǒng)檢測方法有血清中和試驗、瓊脂擴散試驗和ELISA等，但這些檢測存在耗時長、敏感性較低、不易標準化等缺點，在實際應用中具有一定的局限性。PCR技術由于具有敏感性高、特異性好、快速、簡便等特點，已經(jīng)走進臨床診斷實驗室并廣泛應用于各種禽病病原體的檢測，包括用于DuCV、MDPV和DHV的檢測。三重PCR是一種特殊的PCR形式，其突出特點是，一次PCR反應，能同時檢測并鑒別出三種病原體，在臨床上具有很高的應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定鴨相關病毒的引物對組。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定鴨相關病毒的引物對組可由三個引物對組成，第一個引物對是由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定所述番鴨細小病毒的引物對1，第二個引物對是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定所述鴨圓環(huán)病毒的引物對2，第三個引物對是由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定所述鴨I型肝炎病毒的引物對3。所述鴨相關病毒為番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨I型肝炎病毒中的至少一種。其中，序列I由20個核苷酸組成；序列2由20個核苷酸組成；序列3由18個核苷酸組成；序列4由21個核苷酸組成；序列5由20個核苷酸組成；序列6由25個核苷酸組成。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定鴨相關病毒的引物對組，也可由兩個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定所述番鴨細小病毒的引物對1，另一個引物對是下述兩個引物對中的任一個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定所述鴨圓環(huán)病毒的引物對2，和由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定所述鴨I型肝炎病毒的引物對3 ;所述鴨相關病毒為番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨I型肝炎病毒中的至少一種。在實際應用中，所述引物對組中的所述引物對I、所述引物對2和所述引物對3在PCR反應體系中的摩爾比為5 5 3 ;所述引物對I、所述引物對2和所述引物對3中各引物對的兩條引物均等摩爾。在本發(fā)明的一個實施例中，所述引物對組中，所述引物對I中的兩條引物在PCR反應體系中的終濃度均為0. 25 u M，所述弓I物對2中的兩條弓I物在PCR反應體系中的終濃度均為0. 25 ii M，所述引物對3中的兩條引物在PCR反應體系中的終濃度均為0. 15 u M。本發(fā)明的再一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定番鴨細小病毒的引物對。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定番鴨細小病毒的引物對由兩條單鏈DNA組成，所·述兩條DNA單鏈分別為序列表中序列I所示的單鏈DNA，和序列表中序列2所示的單鏈DNA。本發(fā)明的另一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定鴨相關病毒的試劑盒。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定鴨相關病毒的試劑盒包含上述任一所述的引物對組，或所述的引物對；所述鴨相關病毒為番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨I型肝炎病毒中的至少一種。上述任一所述的引物對組，或所述的引物對的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。該制備方法包括將上述任一所述的引物對組，或所述的引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。上述PCR試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。該制備方法包括如下步驟將上述任一所述的引物對組，或所述的引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。上述任一所述的引物對組，或所述的引物對，或所述的試劑盒在制備鑒定或輔助鑒定待測樣品中是否含有鴨相關病毒產(chǎn)品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述鴨相關病毒為番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨I型肝炎病毒中的至少一種。在所述應用中，所述鑒定或輔助鑒定待測樣品中是否含有鴨相關病毒具體可為利用上述任一所述的引物對組，或所述的引物對，或所述的試劑盒對所述待測樣品進行PCR擴增；所述PCR擴增的退火溫度為50-60°C。在本發(fā)明的一個實施例中，所述PCR擴增的退火溫度具體為55 °C。所述待測樣品來自健康的動物或死亡的動物，可為DNA和/或RNA。實驗證明，本發(fā)明建立一次PCR反應就能同時檢測和鑒別番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨I型肝炎病毒三種病原體的三重PCR技術，具有特異性強、靈敏度高、低成本、高效率等優(yōu)點，而且本發(fā)明在引物設計上利用擴增片段長度的不同直接判定擴增結(jié)果，使得該方法在結(jié)果判定時更簡便、直觀和實用。本發(fā)明最低能同時檢出Ipg鴨I型肝炎病毒RNA、Ipg鴨圓環(huán)病毒DNA和Ipg番鴨細小病毒DNA，這對于在鴨的鴨I型肝炎病毒、鴨圓環(huán)病毒和番鴨細小病毒的發(fā)病早期提供準確的診斷結(jié)果，切斷其傳播途徑有重要意義，具有廣闊的應用前景，對鴨養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要的現(xiàn)實意義。


圖I為三重RT-PCR的敏感性試驗結(jié)果。其中，泳道M為分子量標準IOObpDNAladder ;泳道 I 為 IOng MDPVUOng DuCV 和 IOng DHV I ;泳道2 為 Ing MDPVUng DuCV和Ing DHV I ;泳道3 為 IOOpg MDPVUOOpg DuCV 和 IOOpg DHV I ;泳道4 為 IOpg MDPVUOpgDuCV 和 IOpg DHV I ;泳道5 為 Ipg MDPVUpg DuCV 和 Ipg DHV I ;泳道6 為 lOOfgMDPV、IOOfgDuCV和IOOfgDHV I ;泳道7為陰性對照(水)。圖2為三重RT-PCR的特異性試驗結(jié)果。其中，泳道M為分子量標準IOObpDNAladder ;泳道 I 為 MDPV DNA ;泳道 2 為 DuCV DNA ;泳道 3 為 DHV I RNA ;泳道 4 為 MDPVDNA和DuCV DNA的混合樣品(濃度比I: I);泳道5為MDPV DNA和DHV I RNA的混合樣品(濃度比I: I);泳道6為DuCV DNA和DHV I RNA的混合樣品(濃度比I: I);泳道7為MDPVDNA、DuCV DNA和DHV I RNA的混合樣品(濃度比I: I: I);泳道8為小鵝瘟病毒DNA ;泳道9 為新城疫病毒RNA ;泳道10為鴨瘟病毒DNA ;泳道11為H9亞型禽流感RNA ;泳道12為陰性對照水。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。病毒毒株鴨I型肝炎病毒AV2111株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，產(chǎn)品目錄號為AV2111。番鴨細小病毒(MDPV)記載在“廣西番鴨細小病毒的分離和鑒定”，廣西畜牧獸醫(yī)，2002，18(6) : 5-7，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；鴨圓環(huán)病毒記載在“廣西部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況調(diào)查”，中國畜牧獸醫(yī)，2010,37 (11) :156-158,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；小鵝瘟病毒記載在“小鵝瘟病毒熒光定量PCR檢測方法的建立”，上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008，160 (06) :30-31，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；新城疫病毒記載在“新城疫植物油乳劑苗的研究”，中國預防獸醫(yī)學報，2000, (04) :23-27,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；鴨瘟病毒AV1221株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；H9亞型禽流感記載在“多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應快速檢測鑒別H9亞型禽流感病毒方法的建立”，中國人獸共患病學報，2006，(09) :858-860，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；試劑及儀器病毒RNA/DNA快速純化試劑盒和One Step RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；PUM-T試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；DNA片斷膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司。PCR儀為美國Perkin Elmer Cetus公司生產(chǎn)的PE9600儀。實施例I、引物的設計與合成根據(jù)現(xiàn)有公開的鴨I型肝炎病毒(DHV I)，鴨圓環(huán)病毒(DuCV)和番鴨細小病毒(MDPV)的基因保守序列，通過Blast驗證，設計并合成了 3對特異性引物(表I)。表I鑒定MDPV、DuCV和DHV I的引物序列
權利要求
1.鑒定或輔助鑒定鴨相關病毒的引物對組，所述鴨相關病毒為番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨I型肝炎病毒中的至少一種，其特征在于所述引物對組由三個引物對組成，第一個引物對是由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定所述番鴨細小病毒的引物對1，第二個引物對是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定所述鴨圓環(huán)病毒的引物對2，第三個引物對是由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定所述鴨I型肝炎病毒的引物對3。
2.鑒定或輔助鑒定鴨相關病毒的引物對組，由兩個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定所述番鴨細小病毒的弓丨物對1，另一個引物對是下述兩個引物對中的任一個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定所述鴨圓環(huán)病毒的引物對2，和由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定所述鴨I型肝炎病毒的引物對3 ;所述鴨相關病毒為番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨I型肝炎病毒中的至少一種。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的引物對組，其特征在于所述引物對組中的所述引物對I、所述引物對2和所述引物對3在PCR反應體系中的摩爾比為5 5 3 ;所述引物對I、所述引物對2和所述引物對3中各引物對的兩條引物均等摩爾。
4.鑒定或輔助鑒定番鴨細小病毒的引物對，由兩條單鏈DNA組成，所述兩條DNA單鏈分別為序列表中序列I所示的單鏈DNA，和序列表中序列2所示的單鏈DNA。
5.鑒定或輔助鑒定鴨相關病毒的試劑盒，包含權利要求1-3中任一所述的引物對組或權利要求4所述的引物對；所述鴨相關病毒為番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨I型肝炎病毒中的至少一種。
6.權利要求1-3中任一所述的引物對組或權利要求4所述的引物對的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權利要求1-3中任一所述的引物對組或權利要求4所述的引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
7.權利要求5所述PCR試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權利要求1-3中任一所述的引物對組或權利要求4所述的引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)=PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
8.權利要求1-3中任一所述的引物對組，或權利要求4所述的引物對，或權利要求5所述的試劑盒的在制備鑒定或輔助鑒定待測樣品中是否含有鴨相關病毒產(chǎn)品中的應用；所述鴨相關病毒為番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨I型肝炎病毒中的至少一種。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于所述鑒定或輔助鑒定待測樣品中是否含有鴨相關病毒為利用權利要求1-3中任一所述的引物對組，或權利要求4所述的引物對，或權利要求5所述的試劑盒對所述待測樣品進行PCR擴增；所述PCR擴增的退火溫度為50-60。。。
10.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于所述PCR擴增的退火溫度為55°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定或輔助鑒定鴨相關病毒的引物對組、試劑盒及其應用。本發(fā)明所提供的引物對組由如下三個引物對組成序列1和序列2、序列3和序列4，以及序列5和序列6分別所示的兩條單鏈DNA組成的三個引物對；所述鴨相關病毒為番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨I型肝炎病毒中的至少一種。本發(fā)明建立一次PCR反應就能同時檢測和鑒別番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨I型肝炎病毒三種病原體的三重PCR技術，具有特異性強、靈敏度高(最低檢測線1pg)、低成本、高效率等優(yōu)點，而且在引物設計上利用擴增片段長度的不同直接判定擴增結(jié)果，使得該方法在結(jié)果判定時更簡便、直觀和實用。
文檔編號C12Q1/70GK102719564SQ20121021287
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月25日 優(yōu)先權日2012年6月25日
發(fā)明者劉加波, 龐耀珊, 范晴, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所