專利名稱：利用分子標記鑒定玉米互交種的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種互交種的鑒定方法，尤其是一種利用分子標記鑒定玉米互交種的方法。
背景技術：
玉米是我國乃至世界上重要的糧飼作物，在農業(yè)生產中具有重要地位。玉米能否正常生產關系著我國糧食生產安全。種子純度是種子質量的重要指標之一，也是種子分級的主要依據(jù)。生產上造成玉米種子純度降低的主要原因較多隔離條件不充分、母本去雄去雜不徹底以及收獲時的機械混雜等[薛艷穎，陳興奎，樊嚴，陳小丹.SSR分子標記 技術在雜交玉米種子純度鑒定中的應用.雜糧作物，2007，27(1) : 6-7]。由此產生的種子混雜方式也多種多樣,包括親本自交種的混雜、其他品種的混雜及正交種、反交種的混雜等。傳統(tǒng)品種純度的檢驗方法主要依賴于品種的形態(tài)特征、生理特性及同工酶等指標。隨著分子生物學的發(fā)展，分子標記技術越來越廣泛的應用于品種純度檢測，國家和一些地方也相繼出臺了玉米品種純度及真實性的分子標記檢測方法，為玉米種子純度的分子檢測提供了標準。玉米互交種是由兩個不同的玉米親本自交系以相反的交配順序得到的，正交與反交是相對的，指定一種交配順序獲得的雜交種為正交種，則相反的交配順序獲得的雜交種為反交種。一般的正、反交種的表現(xiàn)型沒有差異，但是對于受細胞質基因控制的母性遺傳性狀，正交種與反交種會表現(xiàn)出顯著差異。盡管受母本控制的部分性狀可作為形態(tài)學標記對部分互交種進行鑒定，但是利用分子標記鑒定是從根本上實現(xiàn)互交種判定的可靠方法?，F(xiàn)行的玉米品種純度的分子標記檢測標準不能對互交種的混雜進行區(qū)分，主要原因在于該檢測標準是建立在不同玉米品種基因組成是有差異的基礎之上的。由于互交種的基因均來自相同的親本，因此，互交種含有相同的基因，基因組之間不存在質的差異。因此，如果從DNA水平上對互交種進行判定，只能從基因劑量的角度進行挖掘。玉米胚乳是一個精子和兩個極核融合后發(fā)育形成的組織，基因組含有兩個拷貝的母本基因及一個拷貝的父本基因，來自母本與父本的等位基因具有二倍劑量關系，可以此作為利用分子標記區(qū)分互交種的基礎。Insertion/Deletion(InDel)標記作為一種有應用前景的遺傳標記得到了研究者的關注[Dinakar B，Maureen D, Mike H，Robin ff, Dave V, James C R, Scott V T,Antoni R. Insertion-deletion polymorphisms in 3' regions of maize genes occurfrequently and can be used as highly informative genetic markers. Plant MolBiol, 2002，48: 539-547]。盡管玉米品種純度鑒定主要利用SSR分子標記[李曉輝，李新海，李文華，王振華，馬鳳鳴，袁力行，張世煌.SSR標記技術在玉米雜交種種子純度測定中的應用.作物學報，2003，29(1) : 63- 68;張華生，王鳳格，趙久然，易紅梅，李瑞媛，楊國航，王璐.利用形態(tài)性狀和SSR標記進行玉米品種的特異性鑒定.玉米科學，2011，19(3) : 51- 55]，但InDel標記用于玉米品種純度分析已有報道[張體付，葛敏，韋玉才，趙涵.玉米功能性Insertion/Deletion (InDel)分子標記的挖掘及其在雜交種純度鑒定中的應用.玉米科學，2012，20(2): 64-68]。目前，InDel較多用于基因組多態(tài)性的評價[馮芳君，羅利軍，李熒，周立國，徐小艷，吳金紅，陳宏偉，陳亮，梅捍衛(wèi).水稻InDel和SSR標記多態(tài)性的比較分析.分子植物育種，2005，3(5): 725- 730;申璐，沈火林，柴敏，王銀磊，楊文才.釆用InDel和SSR標記分析番茄品種基因組DNA多態(tài)性.中國農業(yè)大學學報，2011，16(2):34- 42]，未見用于互交種判定的研究。玉米基因組中存在大量的InDel多態(tài)，據(jù)估計每309bp就有一個InDel [VrohB I， McMullen M, Sanchez-Villeda H， Schroeder S， Gardiner J， Schaeffer M，Soderlund C，Wing R，F(xiàn)ang Z，Coe J E. Single nucleotide polymorphisms andinsertion-deletions for genetic markers and anchoring the maize fingerprintcontig physical map. Crop Sci, 2006，46: 12-21]。隨著玉米基因組測序及重測序工作的完成，玉米InDel多態(tài)性標記得到了更快的發(fā)展[Schnable P S，Ware D, Fulton R S，Schnable P S，Ware D，F(xiàn)ulton R S，Stein J C，Wei F S，Pasternak S，Liang C Z，Zhang J W, Fulton L，Graves T A，Minx P，Reily A D，Courtney L，Kruchowski SS, Tomlinson C， Strong C， Delehaunty K， Fronick C， Courtney B， Rock S M， BelterE, Du Fj Kim K，Abbott R M，Cotton M，Levy A，Marchetto P，Ochoa K，Jackson SM, Gillam B，Chen W, Yan L，Higginbotham J，Cardenas M，Waligorski J，ApplebaumE, Phelps L, Falcone J，Kanchi K，Thane T，Scimone A，Thane N，Henke J，WangT, Ruppert J，Shah N，Rotter K，Hodges J，Ingenthron E，Cordes M，Kohlberg S，Sgro J，Delgado B，Mead K，Chinwalla A，Leonard S，Crouse K，Collura K，KudrnaD, Currie J，He R，Angelova A，Rajasekar S，Mueller T，Lomeli R，Scara G，KoA， Delaney K， Wissotski M， Lopez G， Campos D， Braidotti M， Ashley E， Golser W,Kim H, Lee S，Lin J，Dujmic Z，Kim W, Talag J，Zuccolo A，F(xiàn)an C，Sebastian A，Kramer M，Spiegel L，Nascimento L，Zutavern T，Miller B，Ambroise C，Muller S，Spooner W, Narechania A，Ren L，Wei S，Kumari S，F(xiàn)aga B，Levy M J，McMahan L，Buren P V，Vaughn M W, Ying K，Yeh C，Emrich S J，Jia Y，Kalyanaraman A，HsiaA，Barbazuk W B，Baucom R S，Brutnell T P，Carpita N C，Chaparro C，Chia J，Deragon J，Estill J C，F(xiàn)u Y，Jeddeloh J A，Han Y，Lee H，Li P，Lisch D R，LiuS, Liu Z, Nagel D H，McCann M C，SanMiguel P，Myers A M，Nettleton D，NguyenJ，Penning B W, Ponnala L，Schneider K L，Schwartz D C，Sharma A，Soderlund C，Springer N M，Sun Q，Wang H，Waterman M，Westerman R，Wolfgruber T K，Yang L，YuY, Zhang L，Zhou S，Zhu Q，Bennetzen J L，Dawe R K，Jiang J，Jiang N，Presting GG, Wessler S R，Aluru S，Martienssen R A，Clifton S W, McCombie W R，Wing R A，Wilson R K. The B73 maize genome: complexity, diversity, and dynamics. Science,2009，326: 1112-1115 ； Lai J S, Li R Q，Xu X，JinW W, Xu M M，Zhao H N，Xiang ZK, Song W B, Ying K，Zhang M，Jiao Y P，Ni P X，Zhang J G，Li D，Guo X S，Ye KX，Jian M, Wang B，Zheng H S，Liang H Q，Zhang X Q，Wang S C，Chen S J，Li J S，F(xiàn)u Y, Springer N M，Yang H M，Wang J，Dai J R，Schnable P S，Wang J. Genome-widepatterns of genetic variation among elite maize inbred lines. Nat Genet, 2010，、42(11) : 1027-1030]。InDel標記多態(tài)是一種擴增片段長度多態(tài)，從幾個堿基對到幾十個堿基對甚至上百個堿基對不等。對于差異較大的InDel標記的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳即可分辨出長度差異。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，針對目前現(xiàn)行的分子標記檢測玉米品種純度方法不能對玉米互交種進行鑒定的問題，提供一種利用InDel分子標記鑒定玉米互交種的方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種利用分子標記鑒定玉米互交種的方法，其特征在于 提取玉米待檢互交種胚乳、葉片及其親本葉片DNA，提取的DNA樣本測定濃度并用瓊脂糖凝膠檢測質量；
根據(jù)待檢互交種親本全基因組序列及基因組二代測序序列存在的差異發(fā)展InDel標記，通過PCR擴增，篩選出親本葉片DNA之間存在共顯性差異的InDel標記；
以互交種葉片DNA為模板進行PCR擴增并對瓊脂糖凝膠電泳條帶進行圖像識別以分析等位基因擴增質量，識別圖像曲線圓滑、波峰波谷獨立且互交種等位基因識別圖像一致的共顯性InDel標記被確定為鑒定互交種的分子標記。利用確定的共顯性InDel標記對待檢互交種胚乳及葉片DNA進行同一批次PCR擴增，PCR循環(huán)數(shù)應為處于指數(shù)擴增期且在瓊脂糖凝膠上能夠清晰表現(xiàn)擴增條帶的PCR循環(huán)數(shù)；
對等位基因擴增產物的電泳條帶進行定量分析，獲得待檢互交種葉片及胚乳DNA等位基因擴增產物相對量的實測值，通過XA’/Xa’=2In / 5;或xA’/xa’=o. 5 X, / 5;獲得正交種或反交種胚乳等位基因擴增產物相對量的理論值(x；/x；分別為正交種或反交種胚乳等位基因擴增產物相對量的理論值, / I為同一批次互交種葉片等位基因擴增產物相對量實測值重復間的平均值)；
利用卡方測驗對待檢互交種胚乳等位基因擴增產物相對量的實測值與其理論值進行統(tǒng)計分析，計算概率八若實測值與正交種胚乳等位基因擴增產物相對量理論值的統(tǒng)計概率P>Q. 05且與反交種胚乳等位基因擴增產物相對量理論值的統(tǒng)計概率/7 ^0. 05,則判定為正交種，反之則為反交種。在本發(fā)明中，共顯性InDel分子標記是這樣獲得的二代原始序列經過整理后，刪除在另一親本全基因組序列中對應多個位點的二代測序序列，再根據(jù)InDel差異發(fā)展標記，通過PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳，篩選親本基因組間存在共顯性差異的InDel標記。在本發(fā)明中，所述的待檢互交種胚乳及葉片DNA進行同一批次PCR擴增是指利用相同的InDel標記對待檢互交種胚乳及葉片DNA同時進行擴增，在PCR反應體系配制時采用統(tǒng)一混合然后分裝的方法，即根據(jù)總反應量先混合除DNA模板以外的所有PCR組分形成PCR反應混合液，然后按照待檢互交種胚乳及葉片DNA模板的樣本量分裝PCR反應混合液，在分裝的混合液里加入相應的待檢互交種胚乳或葉片DNA模板形成完整的PCR反應體系，將完整的PCR反應體系分裝為若干重復即可在同一臺PCR儀器上以相同的PCR程序進行擴增，這樣可使同一標記在互交種葉片DNA及互交種胚乳DNA中等位基因擴增效率保持穩(wěn)定，即可利用互交種葉片等位基因擴增產物相對量獲得互交種胚乳等位基因擴增產物相對量的理論值。在本發(fā)明中，所述的PCR循環(huán)數(shù)應為處于指數(shù)擴增期且在瓊脂糖凝膠上能夠清晰表現(xiàn)擴增條帶的PCR循環(huán)數(shù)是指對相應標記以不同的循環(huán)數(shù)進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳時隨著循環(huán)數(shù)的增加擴增條帶的亮度逐漸增強，則該PCR階段處于指數(shù)擴增期，以該階段在瓊脂糖凝膠上能夠清晰表現(xiàn)擴增條帶的PCR循環(huán)數(shù)作為鑒定玉米互交種的PCR循環(huán)數(shù)。本發(fā)明的優(yōu)點在于
本發(fā)明采用互交種胚乳DNA作為PCR反應模板，胚乳DNA等位基因劑量關系為嚴格的 二倍關系，不會因為加樣的誤差發(fā)生改變。本發(fā)明利用的InDel標記可以通過瓊脂糖凝膠進行檢測，相比于SSR標記的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法操作簡便，成本更低。本發(fā)明以PCR指數(shù)擴增期為鑒定時期，可確保PCR反應初始模板量與終產物量具有線性關系。本發(fā)明在PCR反應體系配制過程中采用統(tǒng)一混合然后分裝的方法。這種操作可以最大程度的保證相同PCR條件下同一標記在互交種葉片DNA及互交種胚乳DNA中等位基因擴增效率保持穩(wěn)定，使互交種胚乳等位基因擴增產物相對量理論值與互交種葉片等位基因擴增產物相對量實測值建立關系。本發(fā)明適應性廣，可用于其它能夠獲得InDel標記的作物互交種鑒定。本發(fā)明的鑒定結果不受環(huán)境的影響，可以早期對互交種進行鑒定。


圖I是本發(fā)明實施例中親本間InDel標記的篩選(奇數(shù)泳道對應的親本為Mol7，偶數(shù)泳道對應的親本為B73)；
圖2共顯性標記在互交種葉片DNA中的擴增(波形圖右上角的數(shù)字與瓊脂糖凝膠電泳泳道相對應，顯示了相應標記在等位基因間的擴增質量。波形圖下面的數(shù)字為對應的標記編號)。圖3共顯性標記在不同PCR循環(huán)數(shù)下的瓊脂糖凝膠電泳結果(M為IOObp DNAladder,泳道對應的數(shù)字為相應的PCR循環(huán)數(shù))。圖4標記81對互交種樣本的鑒定(泳道1，2分別為標記81在親本B73，Mol7中的擴增條帶；波形圖中的數(shù)字與泳道數(shù)字對應；左右兩條波峰分別為來自B73，Mol7的等位基因擴增后ImageJ的識別圖像)。
具體實施例方式本發(fā)明的實施例是利用玉米自交系B73、Mol7作為親本及雜交的互交種為材料，本發(fā)明是基于對所述的互交種進行鑒定的。材料與方法
I.I材料
供試材料為玉米自交系B73、Mol7、正交種B73XMol7 (BM)及反交種Mol7XB73(MB)。提取B73、Mol7、BM、MB葉片DNA以及BM、MB胚乳(各5個樣本)DNA提取按照Karroten植物基因組DNA提取試劑盒(南京塞吉科技有限公司)相關步驟操作，提取的DNA樣本測定濃度并用0. 8%的瓊脂糖凝膠檢測質量。擴增及瓊脂糖凝膠電 泳
PCR 反應體積為 25 u I，其中含 2 mmol I71 MgCl2, 100 u mo I I71 dNTP ,0.2 u mol I71引物，I U Taq酶，50 Ug模板DNA，上覆20 U L礦物油。反應在2720 Thermal cycler型DNA擴增儀上進行。熱循環(huán)程序為94 °C 3 min ；94 V 40 s, 58 V 40 s, 72 V40 S，37個循環(huán)；72 V 5 min。擴增產物在2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5 Ug mF1 )上以80 V電壓電泳45 min,紫外透射儀上觀察結果并拍照。電泳條帶的定量分析
電泳條帶的定量分析由ImageJ公共圖像處理軟件完成。將要分析的電泳圖片進行校正后，利用軟件的長型框工具選定要分析的區(qū)域，軟件以波形圖的形式顯示選定區(qū)域的影像強度，突出的波峰對應的區(qū)域即為目標條帶區(qū)，通過直線工具將波形圖的目標條帶區(qū)與非條帶區(qū)分開，選擇該軟件的魔術棒工具點擊目標波形區(qū)即可通過計算該區(qū)域面積得出電泳條帶的強度。分子標記的開發(fā)與篩選
本研究所用的分子標記為自主開發(fā)的Insertion/Deletion (InDel)標記。第二版B73全基因組序列從www. maizesequence. org網(wǎng)站上下載獲得，Mol7 二代序列分別來自中國農業(yè)大學和美國JGI-D0E。Mol7 二代原始序列經過Q20標準過濾后用BWA軟件處理并利用SAMtool對結果進行整理。在分析過程中刪除了可在B73基因組上對應多個位點的Mol7二代原始序列。引物設計由emboss軟件包中eprimer3完成。開發(fā)的InDel標記在B73、Mol7間進行比較，篩選出擴增條帶清晰、無非特異性擴增的共顯性標記用于后續(xù)分析?；ソ环N胚乳等位基因相對定量原理
PCR反應方程為X=Xtl(1+Ex)n。其中，n為擴增反應的循環(huán)次數(shù)；X為第n次循環(huán)后的擴增產物A為初始模板量；Ex為擴增效率。當Ex=I時為理想的PCR擴增反應。在實際的操作中很難達到理想水平。假定玉米雜交種親本中某一位點的一對等位基因分別為A、a，對于某一引物來說這對等位基因的PCR反應方程分別為Xa =Xao(I+Ea)\Xa =Xa0(l+Ea)no其中，XA、Xa分別為等位基因A、a第n次循環(huán)后的擴增產物量；XA(I、Xa0分別為等位基因A、a的初始模板量；Ea、Ea分別為等位基因A、a擴增效率。在PCR指數(shù)擴增期階段，等位基因擴增產物的相對量與初始模板量具有線性關系。由于雜交種葉片中等位基因A、a的初始模板相對量Xaci :Xa(l=l，可由第n次循環(huán)后等位基因擴展產物相對量的實測值推測該引物在等位基因間的擴增效率的關系(1+￡4)7(1+￡〕1^4/\。若正交種胚乳基因型為44&，反交種胚乳基因型為aaA，則正交種胚乳等位基因的劑量關系為A a=2 (即胚乳初始模板相對量Xaci Xa0=2)，反交種胚乳等位基因的劑量關系A :a=0. 5 (即胚乳初始模板相對量Xaci :Xa(l=0. 5)。對于同一弓丨物相同批次的以雜交種葉片DNA及胚乳DNA為模板的PCR反應，由于反應條件一致，雜交種葉片及胚乳基因組等位基因的擴增效率關系能夠最大限度地保持穩(wěn)定。因此，第n次循環(huán)后雜交種胚乳等位基因擴增產物相對量理論值與雜交種葉片等位基因擴增產物相對量的實測值即可建立如下關系正交種等位基因擴增產物相對量理論值XA’/Xa’=2X,
八力葉片等位基因擴增產物相對量實測值Xa/^同一批次樣品重復間的平均值)；反交種等位基因擴增產物相對量理論值XA’/Xa’=0. 5 m互交種等位基因擴增產物相對量理論
值與其實測值進行統(tǒng)計分析，若理論值與實測值無顯著性差異，則判定為正交種或反交種。統(tǒng)計分析
利用卡方(X2)測驗對互交種等位基因擴增產物相對量理論值與其實測值進行統(tǒng)計分析，計算概率凡若實測值與正交種等位基因擴增產物相對量理論值的統(tǒng)計/^>0. 05且與反交種等位基因擴增產物相對量理論值的統(tǒng)計/7 < 0. 05，則判定為正交種，反之則為反交種。二結果與分析
2.I InDel分子標記的開發(fā)與共顯性標記的篩選 經過分析，B73、Mol7之間約11 400個長度小于IOObp的InDel位點(深度>3)可以進行標記開發(fā)。為了便于發(fā)展的標記進行瓊脂糖凝膠檢測，從中剔除了長度小于20bp的InDel,選取了部分長度大于20bp的InDel位點發(fā)展標記。對新發(fā)展的143對InDel標記通過瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，其中118對引物可以清晰地揭示B73與Mo 17 DNA之間的多態(tài)，PCR擴增產物大小與預測大小完全吻合。根據(jù)B73基因組序列對新發(fā)展的標記進行分析，發(fā)現(xiàn)InDel長度多在20bp 80bp之間，PCR產物長度在141bp 361bp之間。從中選取8個B73、Mol7間特異擴增的共顯性InDel標記(圖1)，用于互交種BM及MB葉片基因組等位基因的擴增，驗證標記在互交種葉片基因組等位基因的擴增質量(圖2)。標記在等位基因間的擴增質量由ImageJ圖像軟件生成的波形圖判定，擴增質量高的引物的波形圖應具有兩個特征1)波形圖曲線圓滑且波峰波谷獨立，便于準確確定擴增主帶區(qū)間；2)互交種等位基因波形圖一致，顯示了標記在互交種等位基因間擴增的穩(wěn)定性。圖2中標記18的波峰波谷區(qū)分不明顯，標記54的波形圖出現(xiàn)了明顯的鋸齒狀，曲線不夠圓滑。因此，這兩個標記會影響到定量的準確性。其余6個共顯性標記擴增穩(wěn)定，波形圖符合定量要求，擴增產物長度介于117bp-301bp之間，InDel大小介于43bp_143bp之間(表I),用于后續(xù)分析。表I篩選的共顯性InDel標記對應的引物信息
權利要求
1.一種利用分子標記鑒定玉米互交種的方法，包括，提取玉米待檢互交種DNA，提取的DNA樣本測定濃度并用瓊脂糖凝膠檢測質量；根據(jù)待檢親本全基因組序列及基因組二代測序序列存在的差異發(fā)展InDel標記，通過PCR擴增，篩選出親本葉片DNA之間存在共顯性差異的InDel標記，其特征在于 a、提取玉米待檢互交種胚乳、葉片及其親本葉片DNA，提取的DNA樣本測定濃度并用瓊脂糖凝膠檢測質量； b、根據(jù)待檢互交種親本全基因組序列及基因組二代測序序列存在的差異發(fā)展InDel標記，通過PCR擴增，篩選出親本葉片DNA之間存在共顯性差異的InDel標記； C、以互交種葉片DNA為模板進行PCR擴增并對瓊脂糖凝膠電泳條帶進行圖像識別以分析等位基因擴增質量，識別圖像曲線圓滑、波峰波谷獨立且互交種等位基因識別圖像一致的共顯性InDel標記被確定為鑒定互交種的分子標記； d、利用確定的共顯性InDel標記對待檢互交種胚乳及葉片DNA進行同一批次PCR擴增，PCR循環(huán)數(shù)應為處于指數(shù)擴增期且在瓊脂糖凝膠上能夠清晰表現(xiàn)擴增條帶的PCR循環(huán)數(shù)； e、對等位基因擴增產物的電泳條帶進行定量分析，獲得待檢互交種葉片及胚乳DNA等位基因擴增產物相對量的實測值，并由葉片DNA等位基因擴增產物相對量的實測值獲得胚乳DNA等位基因擴增產物相對量的理論值，當XA’/Xa’=2X, / X時獲得正交種胚乳等位基因擴增產物相對量的理論值，當XA’/Xa’=0. 5 Xh / X時獲得反交種胚乳等位基因擴增產物相對量的理論值，式中 x；/x；分別為正交種或反交種胚乳等位基因擴增產物相對量的理論值； 1./5;為同一批次互交種葉片等位基因擴增產物相對量實測值重復間的平均值； f、利用卡方測驗對待檢互交種胚乳等位基因擴增產物相對量的實測值與其理論值進行統(tǒng)計分析，計算概率八若實測值與正交種胚乳等位基因擴增產物相對量理論值的統(tǒng)計概率產>0. 05且與反交種胚乳等位基因擴增產物相對量理論值的統(tǒng)計概率/7 < 0. 05，則判定為正交種，反之則為反交種。
2.根據(jù)權利要求I所述的利用分子標記鑒定玉米互交種的方法，共顯性InDel分子標記是這樣獲得的二代原始序列經過整理后，刪除在另一親本全基因組序列中對應多個位點的二代測序序列，再根據(jù)InDel差異發(fā)展標記，通過PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳，篩選親本基因組間存在共顯性差異的InDel標記。
3.根據(jù)權利要求I所述的利用分子標記鑒定玉米互交種的方法，其特征在于，所述的待檢互交種胚乳及葉片DNA進行同一批次PCR擴增是指利用相同的InDel標記對待檢互交種胚乳及葉片DNA同時進行擴增，在PCR反應體系配制時采用統(tǒng)一混合然后分裝的方法，即根據(jù)總反應量先混合除DNA模板以外的所有PCR組分形成PCR反應混合液，然后按照待檢互交種胚乳及葉片DNA模板的樣本量分裝PCR反應混合液，在分裝的混合液里加入相應的待檢互交種胚乳或葉片DNA模板形成完整的PCR反應體系，將完整的PCR反應體系分裝為若干重復即可在同一臺PCR儀器上以相同的PCR程序進行擴增，這樣可使同一標記在互交種葉片DNA及互交種胚乳DNA中等位基因擴增效率保持穩(wěn)定，即可利用互交種葉片等位基因擴增產物相對量實測值獲得互交種胚乳等位基因擴增產物相對量的理論值。
4.根據(jù)權利要求I所述的利用分子標記鑒定玉米互交種的方法，其特征在于，所述的PCR循環(huán)數(shù)應為處于指數(shù)擴增期且在瓊脂糖凝膠上能夠清晰表現(xiàn)擴增條帶的PCR循環(huán)數(shù)是指對相應標記以不同的循環(huán)數(shù)進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳時隨著循環(huán)數(shù)的增加擴增條帶的亮度逐漸增強，則該PCR階段處于指數(shù)擴增期，以該階段在瓊脂糖凝膠上能夠清晰表現(xiàn)擴增條帶的PCR循環(huán)數(shù)作為鑒定玉米互交種的PCR循環(huán)數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用分子標記鑒定玉米互交種的方法，其特征在于提取玉米待檢互交種胚乳、葉片及親本葉片DNA；根據(jù)親本基因組序列差異發(fā)展InDel標記并篩選親本間共顯性標記；分析互交種葉片DNA等位基因擴增產物質量確定鑒定玉米互交種的分子標記；摸索標記的PCR指數(shù)擴增期及在瓊脂糖凝膠上清晰表現(xiàn)擴增產物的循環(huán)數(shù)，對互交種胚乳及葉片DNA進行同一批次擴增；定量分析電泳條帶獲得互交種葉片及胚乳等位基因擴增產物相對量實測值；由互交種葉片等位基因擴增產物相對量實測值獲得胚乳等位基因擴增產物相對量理論值；利用卡方測驗對待檢互交種胚乳等位基因擴增產物相對量實測值與理論值進行統(tǒng)計，計算概率P，對互交種進行判定。
文檔編號C12Q1/68GK102747163SQ201210256500
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月24日 優(yōu)先權日2012年7月24日
發(fā)明者張體付, 蔣璐, 趙涵 申請人:江蘇省農業(yè)科學院