擬南芥jav1蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗病和抗蟲性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了擬南芥JAV1蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗病和抗蟲性中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種提高植物抗病和抗蟲性的方法及用于降低JAV1基因表達(dá)物質(zhì)的發(fā)夾RNA、小干擾RNA及干擾載體和干擾片段。實(shí)驗(yàn)證明，與野生型和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照相比，T3代轉(zhuǎn)pBI121-JAV1-RNAi的擬南芥株系JAV1基因的相對(duì)表達(dá)量明顯降低；接種灰霉菌后的侵染葉片面積為0.25-0.27平方厘米，明顯小于野生型和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照；用生長(zhǎng)5周的葉片飼喂的甜菜夜蛾幼蟲，6天后體重增加1.58—2.03毫克，明顯低于野生型和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照；用遲眼蕈蚊幼蟲放入生長(zhǎng)有18天的各株系單株的土壤中，12天后植株仍能正常生長(zhǎng)。本發(fā)明為培育抗病抗蟲植物提供了一條新的途徑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場(chǎng)前景。
【專利說明】擬南芥JAV1蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗病和抗蟲性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種擬南芥JAVl蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗病和抗蟲性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物在進(jìn)化過程中會(huì)形成對(duì)害蟲或病原菌危害所產(chǎn)生的一定程度的避害、耐害或抗生的生態(tài)適應(yīng)性。根據(jù)植物抗性研究開展的植物抗性基因工程是利用分子遺傳學(xué)原理，鑒定和分離抗性基因，并將抗性基因?qū)胧荏w，獲得抗性穩(wěn)定表達(dá)并遺傳的再生個(gè)體的生物技術(shù)?？剐曰蚨鄟碜杂谔烊坏目鼓嫘陨?，或是植物在逆境中產(chǎn)生的起保護(hù)作用的基因。將這些基因轉(zhuǎn)移到抗性差的品種中，就可以提高抗逆性。該技術(shù)多以過表達(dá)外源抗性基因?yàn)橹鳎煌锓N之間的差異可能會(huì)影響抗性效果。擬南芥(Arabidopsis thaliana)隸屬被子植物門雙子葉植物綱十字花科，是現(xiàn)代國際和國內(nèi)進(jìn)行植株生物學(xué)研究的模式植物。擬南芥作為研究的模式植物得益于幾個(gè)特點(diǎn):基因組小，僅有5條染色體，約24000個(gè)基因；植株小；結(jié)子多；適于人工培養(yǎng)。對(duì)擬南芥基因功能的深入研究將有助于作物性狀的遺傳改良。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供擬南芥JAVl蛋白的新用途。該蛋白的氨基酸序列如序列表序列I所示，所述新用途即所述蛋白可用于調(diào)控目的植物的病害抗性和/或蟲害抗性，或調(diào)節(jié)序列表序列I所示蛋白表達(dá)量的物質(zhì)或方法可用于調(diào)控目的植物的病害抗性和/或蟲害抗性。
[0004]所述病害可為傳染性病害或非傳染性病害；所述傳染性病害的生物病原物可為真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲；所述真菌具體可為灰霉菌(Botrytis cinerea)。
[0005]所述蟲害的致病害蟲可為夜蛾、蕈蚊或蚜蟲；
[0006]所述夜蛾具體可為甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜紋夜蛾(SpodopteraIitura)或棉鈴蟲(Heliothis armigera)；
[0007]所述蕈蚊具體可為遲眼蕈蚊(Bradysia impatiens)或韭菜遲眼蕈蚊(Bradysiaodoriphage)；
[0008]所述姆蟲具體可為桃姆(Myzus persicae Siilzer)。
[0009]本發(fā)明提供一種發(fā)夾RNA，其核苷酸序列由一個(gè)莖環(huán)序列及位于所述莖環(huán)序列兩側(cè)的序列A和序列B組成，所述序列A和序列B反向互補(bǔ)；所述序列A為序列表序列I所示蛋白的編碼基因中200-500bp DNA轉(zhuǎn)錄得到的RNA序列。
[0010]所述蛋白的編碼基因中的200-500bp的DNA中不含有所述蛋白的編碼基因的5，UTR區(qū)或3’ UTR區(qū)序列。
[0011 ] 所述蛋白的編碼基因具體可為序列表序列2所示的DNA分子；其中，所述5’UTR區(qū)為序列表序列2的自5’末端第I位至第259位核苷酸；所述3’ UTR區(qū)為序列表序列2的自5’末端第839位至第1129位核苷酸。
[0012]所述蛋白的編碼基因中的200-500bp的DNA具體可為序列表序列2的第260-559位核苷酸序列所示的DNA。
[0013]由上述任一所述發(fā)夾RNA衍生的小干擾RNA也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014]所述發(fā)夾RNA具體可為由如下序列依次相連組成的DNA片段轉(zhuǎn)錄形成的RNA --序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、載體PTCK303的Kpn I和Spe I位點(diǎn)間的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列。
[0015]本發(fā)明提供上述任一所述RNA (發(fā)夾RNA或小干擾RNA)的編碼基因。
[0016]所述RNA的編碼基因具體為如下I)或2)的DNA分子:
[0017]I)式I所示的DNA片段，(I) SEQ正向-X-SEQ反向，
[0018]所述SEQtt是序列表序列2中包括第260位至第559位的核苷酸段，
[0019]所述SEQg的序列與所述SEQtt的序列反向互補(bǔ)，
[0020]所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQIE向及所述SEQ反向均不互補(bǔ)；
[0021]2)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且抑制序列表序列I所示蛋·白表達(dá)的DNA分子。
[0022]所述SEQ1^1的核苷酸序列具體可為序列表序列2中第260位至第559位核苷酸序列。
[0023]本發(fā)明保護(hù)下述3)或4)的DNA分子:
[0024]3)其核苷酸序列為序列表序列2的第260位至第559位核苷酸段；
[0025]4)在嚴(yán)格條件下與3)限定的DNA序列雜交的DNA分子；
[0026]本發(fā)明保護(hù)含有上述任一所述RNA的編碼基因或DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物、重組菌或重組病毒。
[0027]所述重組載體具體可為載體pBI121-JAVl-RNAi 和 pTCK303_JAVl_RNAi ；
[0028]所述載體pBI121-JAVl_RNAi為在載體pBI121的Xba I和Sac I位點(diǎn)間插入了由如下序列依次相連組成的DNA片段:序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、載體PTCK303的Kpn I和Spe I位點(diǎn)間的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列；
[0029]所述載體pTCK303-JAVl_RNAi為在載體pTCK303的Xba I和Sac I位點(diǎn)間插入了由如下序列依次相連組成的DNA片段:序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、載體PTCK303的Kpn I和Spe I位點(diǎn)間的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列。
[0030]本發(fā)明提供一種提高植物的病害抗性和/或蟲害抗性的方法，是抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表達(dá)，得到病害抗性和/或蟲害抗性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物；
[0031]所述病害的致病菌可為灰霉菌(Botrytis cinerea)；
[0032]所述蟲害的致病害蟲可為夜蛾或蕈蚊；[0033]所述夜蛾具體可為甜菜夜蛾(Spodoptera exigua),所述蕈蚊具體可為遲眼蕈蚊(Bradysia impatiens)。
[0034]所述病害抗性高于所述目的植物表現(xiàn)可為:所述轉(zhuǎn)基因植物葉片接種所述病害的病原物后的侵染面積小于所述目的植物葉片接種所述病害的病原物后的侵染面積；
[0035]所述蟲害抗性高于所述目的植物表現(xiàn)可為:用所述轉(zhuǎn)基因植物葉片飼喂的所述致病害蟲的重量增加量小于用所述目的植物葉片飼喂的所述致病害蟲的重量增加量。
[0036]所述抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表達(dá)具體是通過將上述任一所述RNA的編碼基因?qū)肽康闹参镏斜磉_(dá)上述任一所述RNA實(shí)現(xiàn)的。
[0037]本發(fā)明還提供另一種降低植物病害抗性和/或蟲害抗性的方法，是將序列表序列I所示蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到病害抗性?或蟲害抗性低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物；
[0038]所述病害的致病菌可為灰霉菌(Botrytis cinerea)；
[0039]所述蟲害的致病害蟲可為夜蛾或蕈蚊；
[0040]所述夜蛾具體可為甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，所述蕈蚊具體可為遲眼蕈蚊(Bradysia impatiens)。
[0041]所述序列表序列I所示蛋白的編碼基因可為如下I)或2)或3)的基因:
[0042]I)序列表序列2中第260位至838位所示的DNA分子；
[0043]2 )序列表序列2所示的DNA分子；
[0044]3)與I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且編碼序列表序列I所示蛋白的DNA分子；
[0045]4)在嚴(yán)格條件下與I)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼序列表序列I所示蛋白的DNA分子；
[0046]所述嚴(yán)格條件可為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5MNa3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC, 0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.5XSSC,0.1%SDS 中漂洗；還可為:50°C，在 7% SDS,0.5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.1 X SSC,
0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65°C，0.1 X SSC, 0.1%SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 XSSC,0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0047]所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物；
[0048]所述雙子葉植物具體可為擬南芥或卷心菜；
[0049]所述單子葉植物具體可為玉米或水稻。
[0050]本發(fā)明保護(hù)通過上述任一所述方法所獲得的轉(zhuǎn)基因植物。
[0051]實(shí)驗(yàn)證明，與野生型和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照相比，T3代轉(zhuǎn)pBI121-JAVl_RNAi的擬南芥株系JAVl基因的相對(duì)表達(dá)量明顯降低；接種灰霉菌后的侵染葉片面積為0.25-0.27平方厘米，明顯小于野生型和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的1.07和1.1平方厘米；用生長(zhǎng)5周的葉片飼喂的甜菜夜蛾幼蟲，6天后體重增加1.58—2.03毫克，明顯低于野生型和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的2.9和3.0毫克；用遲眼蕈蚊幼蟲放入生長(zhǎng)有18天的各株系單株的土壤中，12天后植株仍能正常生長(zhǎng)而野生型植株矮小。本發(fā)明為培育抗病抗蟲植物提供了一條新的途徑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場(chǎng)前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1 為 RNAi 載體 pBI121-JAVl-RNAi 的 T-DNA 結(jié)構(gòu)示意圖。
[0053]圖2為T1代轉(zhuǎn)pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥植株P(guān)CR鑒定電泳圖。其中，M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)，WT為野生型擬南芥，P為質(zhì)粒pBI121-JAVl-RNAi陽性對(duì)照，1-10為待測(cè)轉(zhuǎn)基因植株，含有目的條帶的為陽性轉(zhuǎn)pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥植株。 [0054]圖3為1\代轉(zhuǎn)空載體pBI121的擬南芥植株P(guān)CR鑒定電泳圖。其中，M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)，WT為野生型擬南芥，P為質(zhì)粒PBI121陽性對(duì)照，其余1-4為待測(cè)轉(zhuǎn)基因植株，含有目的條帶的為陽性轉(zhuǎn)空載體PBI121的擬南芥植株。
[0055]圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥的JAVl基因的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果。其中，WT為野生型擬南芥，CK為轉(zhuǎn)空載體PBI121的擬南芥株系，L1-L7為7個(gè)1~3代轉(zhuǎn)pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥株
系O
[0056]圖5為T3代轉(zhuǎn)pBI121-JAVl_RNAi的擬南芥株系噴灑灰霉菌菌液的表型。其中，框中的植株為轉(zhuǎn)pBI121-JAVl-RNAi擬南芥，表現(xiàn)為對(duì)灰霉菌有一定抗性；其余植株為野生型及轉(zhuǎn)空載體的擬南芥，表現(xiàn)為對(duì)灰霉菌的侵染十分敏感。
[0057]圖6為T3代轉(zhuǎn)pBI121-JAVl_RNAi的擬南芥株系滴加灰霉菌菌液的表型。其中，標(biāo)尺代表2毫米。
[0058]圖7為T3代轉(zhuǎn)pBI121-JAVl_RNAi的擬南芥株系的甜菜夜蛾幼蟲抗性鑒定結(jié)果。其中，標(biāo)尺代表2毫米。
[0059]圖8為T3代轉(zhuǎn)pBI121-JAVl_RNAi的擬南芥株系的遲眼蕈蚊幼蟲抗性鑒定結(jié)果。其中，標(biāo)尺代表2毫米。
【具體實(shí)施方式】
[0060]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0061]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0062]根癌農(nóng)桿菌GV3101 (Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101):參考文獻(xiàn):Cheng Huij Song Sushengj Xiao Langtaoj Soo Hui Mengj Cheng Zhiweij Xie Daoxinj PengJinrong.Gibberellin Acts through Jasmonate to Control the Expression ofMYB21, MYB24 and MYB57 to Promote Stamen Filament Growth in Arabidopsis.PLoSGenetics.2009，5(3):e 1000440.公眾可從清華大學(xué)獲得。
[0063]pBI121:參考文獻(xiàn):Zhiwei Cheng, Li Sun, Tiancong Qij Bosen Zhang, DaoxinXie.The bHLH Transcription Factor MYC3 Interacts with the JasmonateZIM-Domain Proteins to Mediate Jasmonate Response in Arabidopsis.Mol.Plant.2011,4(2):279-288.公眾可從清華大學(xué)獲得。
[0064]pTCK303:參考文獻(xiàn):Zhen Wang, Changbin Chen, Yunyuan Xuj Rongxi Jiang, YeHan，Zhihong Xu and Kang Chong.A practical vector for efficient knockdownof gene expression in rice(Oryza sativa L.).Plant Molecular BiologyReporter.2004, 4(22):409-417.公眾可從清華大學(xué)獲得。
[0065]實(shí)施例1、擬南芥JAVl基因的獲得
[0066]提取擬南芥(Arabidopsisthaliana) Columbia_0 生態(tài)型(ArabidopsisBiological Resource Center (ABRC),種子號(hào):CS6673)花的總 RNA,反轉(zhuǎn)錄得至Ij cDNA,以該 cDNA 為模板，以引物 1:5’ -CGAATCAAATTAAACATTGT-3’ 和引物 2:5’ -AAAACATTTTTATTTATTT-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將得到的PCR產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果如序列表序列2所示。序列表序列2為擬南芥JAVl基因的全長(zhǎng)cDNA序列，其中，自序列表序列2的第260-838位為開放閱讀框，編碼序列表序列I所示的由192個(gè)氨基酸組成JAVl蛋白；自序列表序列2的5’末端第I位至第259位為5’ UTR區(qū)；自序列表序列2的3’末端第839位至第1129位為3’ UTR區(qū)。
[0067]也可人工合成序列表中的序列2。
[0068]實(shí)施例2、利用JAVl的RNAi載體培育抗蟲抗病轉(zhuǎn)基因擬南芥
[0069]1、RNAi 載體 pBI121-JAVl_RNAi 的獲得
[0070]以實(shí)施例1 的擬南芥 cDNA 為模板，用引物 3:5，-GCTCTAGAATGGCTAACCCCAACGAGTG-3’(下劃線堿基為 Xba I 識(shí)別序列)和引物 4:5’-TTGGTACCAGCAGAAGTAGTATTACCGG-3’ (下劃線堿基為Kpn I識(shí)別序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得300bp左右的DNA片段，將該片段用XbaI和Kpn I雙酶切，與經(jīng)過Xba I和Kpn I雙酶切的載體pTCK303的載體骨架片段相連，獲得中間載體I。
[0071]以實(shí)施例1 的擬南芥 cDNA 為模板，用引物 5:5，-CCACTAGTAGCAGAAGTAGTATTACCGG-3’(下劃線堿基為 Spe I 識(shí)別序列)和引物 6:5’-TAGAGCTCATGGCTAACCCCAACGAGTG-3’ (下劃線堿基為Sac I識(shí)別序列)進(jìn)行P`CR擴(kuò)增，獲得300bp左右的DNA片段，將該片段用SpeI和Sac I雙酶切，與經(jīng)過Spe I和Sac I雙酶切的中間載體的載體骨架片段相連，獲得載體 pTCK303-JAVl-RNAi，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，載體 pTCK303_JAVl_RNAi 為在載體 pTCK303 的 Xba I和Sac I位點(diǎn)間插入了由如下序列依次相連組成的DNA:序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、載體PTCK303的Kpn I和Spe I位點(diǎn)間的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列。
[0072]將載體pTCK303-JAVl_RNAi用Xba I和Sac I雙酶切后，回收Ikb左右的片段，與經(jīng)過Xba I和Sac I雙酶切的pBI121載體骨架片段相連，獲得RNAi干擾載體pBI121-JAVl-RNAi，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，載體 pBI121_JAVl_RNAi 為在載體 pBI121 的 Xba I 和 SacI位點(diǎn)間插入了由如下序列依次相連組成的DNA:序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、載體PTCK303的Kpn I和Spe I位點(diǎn)間的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列。該插入片段編碼具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾RNA，可產(chǎn)生20bp左右的小干擾RNA，該小干擾RNA再與目的基因JAZl的mRNA結(jié)合，最終沉默JAZl的表達(dá)。載體pBI121-JAVl-RNAi的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。
[0073]2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得
[0074]I)重組根癌農(nóng)桿菌的獲得
[0075]將載體pBI121_JAVl_RNAi用電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101 (Agrobacteriumtumefaciens Strain GV3101)中，提取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)該質(zhì)粒為pBI121-JAVl-RNAi。將含有質(zhì)粒pBI121-JAVl_RNAi的陽性轉(zhuǎn)化子即重組根癌農(nóng)桿菌命名為 GV3101/pBI121-JAVl-RNAi。
[0076]2)轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得
[0077]用步驟I)得到的重組根癌農(nóng)桿菌GV3101/pBI121-JAVl_RNAi浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsis thaliana) Columbia-O生態(tài)型,收獲轉(zhuǎn)化當(dāng)代擬南芥植株上所結(jié)的種子，播種于含卡那霉素20mg/L的MS篩選培養(yǎng)基上，得到123株具有卡那霉素抗性的T1代轉(zhuǎn)pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥植株。待T1代轉(zhuǎn)pBI121-JAVl_RNAi擬南芥植株長(zhǎng)至4_6葉時(shí)移到蛭石上生長(zhǎng)60天，光照時(shí)間(24°C:16小時(shí)/光照+8小時(shí)/黑暗)。
[0078]分別提取上述123株T1代轉(zhuǎn)pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥植株葉片基因組DNA，用CaMV35S啟動(dòng)子上的特異引物5’ -ACAGTGGTCCCAAAGATGGACC-3’和JAVl基因上的一條反向引物5’-GTCGGTGTTGAGAAGCGT-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)測(cè)產(chǎn)物大小為420bp，共得到55株T1代陽性轉(zhuǎn)pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥植株，部分檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。
[0079]采用同樣的方法，將空載體pBI121轉(zhuǎn)入擬南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-O生態(tài)型中，得到T1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥植株。提取抗卡那霉素的T1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥葉片的基因組DNA，用pBI121載體上CaMV35S啟動(dòng)子上特異引物5’ -ACAGTGGTCCCAAAGATGGACC-3’ 和該載體上另?xiàng)l引物 5’ -TTAITTTATCAATAAATATT-3’ 進(jìn)行PCR,預(yù)測(cè)產(chǎn)物大小為300bp，共得到10株T1代陽性轉(zhuǎn)空載體的擬南芥植株，部分檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。
[0080]T1代表示轉(zhuǎn)化當(dāng)代植株自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株；T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株；τ3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株。
[0081]按照上述PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)T1代PCR呈陽性的轉(zhuǎn)基因株系的T2代及T3代植株，將T3代植株全部呈PCR陽性的株系確定為純合轉(zhuǎn)pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥株系或純合轉(zhuǎn)空載體的擬南芥株系。
[0082]3、轉(zhuǎn)基因擬南芥的熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
[0083]取同一正常培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)21天的、步驟2獲得的7個(gè)T3代純合轉(zhuǎn)pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥株系(編號(hào)為L(zhǎng)I一L7)、T3代純合轉(zhuǎn)空載體擬南芥株系(CK)和野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana) Columbia-O生態(tài)型(WT)的植株葉片，分別提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以此cDNA為模板，以JAVl基因特異引物7和8進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，分析各株系植株內(nèi)JAVl基因的表達(dá)情況，以Actin8為內(nèi)參基因，引物為F和R。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在ABI PRISlf 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，一次平行試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。利用Livak KJ和Schmittgen TD (2001)報(bào)道的方法，即2_Δ Δετ計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。
[0084]Δ Δ Cj^T.Actin^ Time x ^ ^T.Target ^T.Actin^ Time 0
[0085]Time x表示任意時(shí)間點(diǎn)，Time0表示經(jīng)act in校正后I倍量的目標(biāo)基因表達(dá)。
[0086]JAVl基因的特異引物序列如下(靶序列為序列表序列2的第260-835位):
[0087]引物7:5，-ATGGCTAACCCCAACGAG-3，；
[0088]引物8:5，-TTGCAACCTCGAAGA-3’ ；
[0089]內(nèi)參基因Actin8的特異引物序列如下:
[0090]F:5’-TCAGCACTTTCCAGCAGATG-3’ ；
[0091 ] R:5’-CTGTGGACAATGCCTGGAC-3’。[0092]結(jié)果如圖4所示，野生型擬南芥JAVl基因的相對(duì)表達(dá)量為1.0 ;轉(zhuǎn)pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥株系(L1-L7)的相對(duì)表達(dá)量均明顯小于I。野生型擬南芥(WT)和轉(zhuǎn)空載體擬南芥(CK)的結(jié)果無顯著差異。
[0093]4、轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病性鑒定
[0094]取步驟2中的4個(gè)編號(hào)為L(zhǎng)I一L4的T3代純合轉(zhuǎn)pBI121_JAVl_RNAi的擬南芥株系、野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-0生態(tài)型(WT)和T3代純合轉(zhuǎn)空載體擬南芥株系(CK)(每個(gè)株系取30個(gè)單株，設(shè)三次重復(fù))按照如下方法進(jìn)行灰霉菌抗性檢測(cè):
[0095]I)灰霉菌(Botrytis cinerea)(文獻(xiàn):Mercedes M.Keller, MiriamD.Cargnel, Patricia V.Demkura, Mieke de Wit, Micaela S.Patitucci, RonaldPierik, CorneM.J.Pieterse and Carlos L.Ballare.Low Red/Far-Red Ratios ReduceArabidopsis Resistance to Botrytis cinerea and Jasmonate Responses via aCOI1-JAZlO-Dependent, Salicylic Acid-1ndependent Mechanism Ignacio Cerrud0.Plant Physiology.2012, 158(4):2042-2052)用馬鈴薯培養(yǎng)基(每升加馬鈴薯200g，取浸出汁加瓊脂20g)，24V、12小時(shí)光照培養(yǎng)7到10天，收集孢子至濃度5 X IO5每毫升，按照每株2毫升的量均勻的噴灑于生長(zhǎng)18天的擬南芥蓮座葉表面，黑暗放置18-24小時(shí)，保濕7天后，拍照，統(tǒng)計(jì)各株系內(nèi)所有單株不同侵染級(jí)別的葉片數(shù)目(沒有侵染記為“O”;侵染面積在25%以下記為“I”;侵染面積在25%-50%之間的記為“2”;侵染面積大于50%的記為“3”)，分別計(jì)算各株系不同侵染級(jí)別的葉片數(shù)占株系所有葉片數(shù)的百分比，取各重復(fù)的平均值，結(jié)果表1所示。
[0096]表1.灰霉菌抗性檢測(cè)結(jié)果(不同侵染級(jí)別的葉片數(shù)百分比)
[0097]
【權(quán)利要求】
1.發(fā)夾RNA，其核苷酸序列由一個(gè)莖環(huán)序列及位于所述莖環(huán)序列兩側(cè)的序列A和序列B組成，所述序列A和序列B反向互補(bǔ)；所述序列A為序列表序列I所不蛋白的編碼基因中200-500bp DNA轉(zhuǎn)錄得到的RNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)夾RNA，其特征在于:所述蛋白的編碼基因中的200-500bp的DNA序列中不含有所述蛋白的編碼基因的5’ UTR區(qū)或3’ UTR區(qū)的序列； 所述蛋白的編碼基因具體可為序列表序列2所示的DNA分子； 所述蛋白的編碼基因中的200-500bp的DNA具體可為序列表序列2的第260-559位核苷酸序列所示的DNA。
3.由權(quán)利要求1或2所述發(fā)夾RNA衍生的小干擾RNA。
4.權(quán)利要求1-3中任一所述RNA的編碼基因； 所述RNA的編碼基因具體為如下I)或2)的DNA分子: 1)式I所示的DNA片段，(I)SEQm-X-SEQ反向， 所述SEQ1^1是序列表序列2中包括第260位至第559位的核苷酸段， 所述SEQ的序列與所述SEQm的序列反向互補(bǔ)， 所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ1向及所述SEQfiJg不互補(bǔ)； 2)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%`、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且抑制序列表序列I所示蛋白表達(dá)的DNA分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的編碼基因，其特征在于:所述SEQ1^1的核苷酸序列是序列表序列2中第260位至第559位核苷酸序列。
6.下述3)或4)的DNA分子: 3)其核苷酸序列為序列表序列2的第260位至第559位核苷酸段； 4)在嚴(yán)格條件下與3)限定的DNA序列雜交的DNA分子。
7.含有權(quán)利要求4-6中任一所述編碼基因或DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒。
8.一種提高植物的病害抗性和/或蟲害抗性的方法，是抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表達(dá)，得到病害抗性和/或蟲害抗性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表達(dá)具體是通過將權(quán)利要求4或5所述編碼基因?qū)肽康闹参镏斜磉_(dá)權(quán)利要求1-3中任一所述RNA實(shí)現(xiàn)的； 所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體可為擬南芥； 所述病害的致病菌為灰霉菌(Botrytis cinerea)； 所述蟲害的致病害蟲為夜蛾或蕈蚊。
10.序列表序列I所示蛋白在調(diào)控目的植物病害抗性和/或蟲害抗性中的應(yīng)用； 所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥； 所述病害的致病菌為灰霉菌(Botrytis cinerea)； 所述蟲害的致病害蟲為夜蛾或蕈蚊。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK103589722SQ201210293627
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月16日
【發(fā)明者】謝道昕, 胡珀, 周武 申請(qǐng)人:清華大學(xué)