人體內(nèi)含有外源重組dna來源的轉(zhuǎn)錄本、dna片段、或其翻譯產(chǎn)物，及其檢測方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及人體內(nèi)含有外源重組DNA來源的轉(zhuǎn)錄本、DNA片段、或其翻譯產(chǎn)物，及其檢測方法和應(yīng)用。具體地，人體內(nèi)來自于外源重組DNA的氨芐青霉素抗性基因的一種轉(zhuǎn)錄本(rAmp)能夠與內(nèi)源?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(ACAT1)基因的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生反式剪接，從而形成一種獨(dú)特的新轉(zhuǎn)錄本及其翻譯產(chǎn)物。本發(fā)明還提供了檢測人體內(nèi)是否含外源重組DNA來源的轉(zhuǎn)錄本、DNA片段、或其翻譯產(chǎn)物的方法和應(yīng)用。
【專利說明】人體內(nèi)含有外源重組DNA來源的轉(zhuǎn)錄本、DNA片段、或其翻譯產(chǎn)物，及其檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及人體內(nèi)含有外源重組DNA來源的轉(zhuǎn)錄本、DNA片段、或其翻譯產(chǎn)物，及其檢測方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]重組DNA技術(shù)自上世紀(jì)七十年代創(chuàng)立以來發(fā)展非?？焖伲粌H產(chǎn)生了分子生物學(xué)這ー新生學(xué)科，也拓展了各類生命學(xué)科及其相關(guān)學(xué)科的前沿基礎(chǔ)研究，并且建立了動(dòng)物、植物、微生物等的細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體等轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。這些研究成果的成功運(yùn)用獲得各種大量的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，特別是建立了在臨床醫(yī)學(xué)中對(duì)與疾病治療和應(yīng)用相關(guān)的基因工程與基因治療等體系。這些發(fā)展既具有商業(yè)性、經(jīng)濟(jì)性等方面巨大的建設(shè)與價(jià)值，也產(chǎn)生理論性、社會(huì)性等深遠(yuǎn)的影響與意義。
[0003]利用重組DNA技術(shù)建立的各種轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，包括利用重組載體(Vector)或重組質(zhì)粒(Plasmid)或其它特異重組DNA等,將人工分離或修飾的基因?qū)氲缴w細(xì)胞內(nèi)或進(jìn)入基因組中，導(dǎo)入基因的表達(dá)可以引起宿主生命體性狀的可遺傳的修飾,建立的這一重組DNA技術(shù)系統(tǒng)稱之為轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。
[0004]在轉(zhuǎn)基因過程中，體外構(gòu)建重組載體或重組質(zhì)?；蚱渌禺愔亟MDNA等必不可少，通常其含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、翻譯控制元件、轉(zhuǎn)錄終止子等各種元件、或其組合元件，使可攜帯經(jīng)過人工改造的目的基因或DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)或進(jìn)入基因組內(nèi)。
[0005]隨著重組DNA技術(shù)的廣泛應(yīng)用，除轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)體外構(gòu)建的重組載體或重組質(zhì)粒或其它特異重組DNA等外，還包括大量構(gòu)建的不同容量的重組DNA庫、突變DNA庫及其篩選系統(tǒng)等。這些重組DNA技術(shù)的產(chǎn)物也已在自然環(huán)境中分布，許多已知的這類基因存在于轉(zhuǎn)座子、整合子或質(zhì)粒中，能夠通`過接合(conjunction)或水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal genetransfer, HGT)等方式進(jìn)入到同種甚至不同種的其它細(xì)菌等生命體,如在人類的ー些病原生物和共生細(xì)菌(腸道微生物群)中都有抗性基因轉(zhuǎn)移的證據(jù)等，但是否已進(jìn)入人體內(nèi)細(xì)胞或基因組、是否進(jìn)入人體內(nèi)細(xì)胞或基因組表達(dá)并引起作用，國際社會(huì)在非常密切關(guān)注中。
[0006]由于重組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展，人們對(duì)包括轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)、DNA庫篩選系統(tǒng)等的安全性越來越重視。就轉(zhuǎn)基因食品而言，雖然市場上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因食品早在上個(gè)世紀(jì)九十年代初就出現(xiàn)在美國市場，但是目前經(jīng)美國食品和藥物管理局確定的轉(zhuǎn)基因食品品種只有幾十種。此外，由于轉(zhuǎn)基因作物或植物或微生物是人工制造的物種，這些物種對(duì)于自然界原來存在的物種而言，是ー種外來物種，而且，這些外來物種對(duì)環(huán)境或生物多樣性造成威脅或危險(xiǎn)會(huì)持續(xù)一段較長的時(shí)間，如需10年或更長的時(shí)間。
[0007]目前本領(lǐng)域尚不明確重組DNA技術(shù)的外源產(chǎn)物是否已進(jìn)入人或非人哺乳動(dòng)物的體內(nèi)細(xì)胞或基因組、是否進(jìn)入體內(nèi)細(xì)胞或基因組表達(dá)并引起作用、是否由新生重組啟動(dòng)子或其它連接的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄表達(dá)、人體內(nèi)外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本或翻譯產(chǎn)物或DNA片段及其對(duì)人體內(nèi)源基因組DNA或其來源的轉(zhuǎn)錄本與翻譯產(chǎn)物的影響等，因此迫切需要進(jìn)行這些方面的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的就是提供ー種人體內(nèi)含有外源重組DNA來源的轉(zhuǎn)錄本、DNA片段、或其翻譯產(chǎn)物及其檢測方法和應(yīng)用。
[0009]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的轉(zhuǎn)錄本，所述轉(zhuǎn)錄本分離自人或非人哺乳動(dòng)物，并且所述的轉(zhuǎn)錄本是:
[0010](a):來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本與人或非人哺乳動(dòng)物基因組的轉(zhuǎn)錄本的剪接轉(zhuǎn)錄本；或
[0011](b):來自于外源重組DNA的未剪接的轉(zhuǎn)錄本。
[0012]在另ー優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)錄本是氨芐青霉素抗性基因或其片段與?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶I(ACATl)基因或其片段組成的剪接轉(zhuǎn)錄本；優(yōu)選地，所述的剪接轉(zhuǎn)錄本具有如SEQ ID N0.: 1所示的多核苷酸。
[0013]在另ー優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)錄本是來自于外源重組DNA的未剪接的氨芐青霉素抗性基因或其DNA片段的轉(zhuǎn)錄本；優(yōu)選地，所述的轉(zhuǎn)錄本具有如SEQ ID N0.: 2所示的多核苷酸。
[0014]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的DNA片段，所述的DNA片段分離自人或非人哺乳動(dòng)物，并且所述的DNA片段來自于外源重組DNA，并重組于人或非人哺乳動(dòng)物基因組中。
[0015]在另ー優(yōu)選例中，所述的DNA片段編碼權(quán)利要求1所述的來自于外源重組DNA的未剪接的轉(zhuǎn)錄本。
[0016]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種分離的翻譯產(chǎn)物，所述的翻譯產(chǎn)物是由第一方面所述轉(zhuǎn)錄本所翻譯的。
[0017]在本發(fā)明的第四方面，提供了ー種第一方面所述的轉(zhuǎn)錄本、第二方面所述的DNA片段、或第三方面所述的翻譯產(chǎn)物的用途，用于制備檢測試劑或試劑盒，所述檢測試劑或試劑盒用于檢測人或非人哺乳動(dòng)物基因組中是否含有來自于外源重組DNA的DNA片段，或所述的人或非人哺乳動(dòng)物中是否存在來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本或其翻譯產(chǎn)物。
[0018]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種非診斷性和非治療性的檢測方法，包括步驟:檢測待測樣本中是否含有來自于外源重組DNA的DNA片段、或來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本，或所述轉(zhuǎn)錄本的翻譯產(chǎn)物，其中所述的待測樣本為人或非人哺乳動(dòng)物的樣本，并且所述的來自于外源重組DNA的DNA片段、或來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本，或所述轉(zhuǎn)錄本的翻譯產(chǎn)物在樣本中是不存在的。
[0019]在另ー優(yōu)選例中，所述的內(nèi)源基因組來源的轉(zhuǎn)錄本或翻譯產(chǎn)物樣本是沒有被外源重組DNA污染的樣本。
[0020]在另ー優(yōu)選例中，所述的樣本含DNA或RNA，并且所述檢測包括步驟:
[0021](I)獲得待測樣本的基因組DNA，或?qū)⒋郎y樣本的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA ；
[0022](2)檢測步驟(1)所述的DNA中是否含有來自于外源重組DNA的多核苷酸或其互補(bǔ)序列，并且所述的多核苷酸或其互補(bǔ)序列在內(nèi)源基因組中、或其轉(zhuǎn)錄本中不存在。[0023]在另ー優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)錄本包括未剪接的轉(zhuǎn)錄本和經(jīng)剪接的轉(zhuǎn)錄本。
[0024]在另ー優(yōu)選例中，所述的經(jīng)剪接的轉(zhuǎn)錄本包括經(jīng)反式剪接或順式剪接的轉(zhuǎn)錄本。
[0025]在另ー優(yōu)選例中，所述的待測樣本為人的樣本。
[0026]在另ー優(yōu)選例中，所述的人的樣本選自下組:體液樣本、唾液樣本、血液樣本、血清樣本、淋巴液樣本、脊髓液樣本、精液樣本、尿液樣本、毛發(fā)樣本、細(xì)胞樣本、組織樣本、或器官樣本。
[0027]在另ー優(yōu)選例中，所述的外源重組DNA選自下組:表達(dá)載體或其片段、表達(dá)質(zhì)粒或其片段、穿梭載體或其片段、穿梭質(zhì)粒或其片段、重組載體或其片段、重組質(zhì)?；蚱淦?、或其它特異重組DNA或其片段。
[0028]在另ー優(yōu)選例中，所述重組載體為pBR322、pUC18/19、pFLAG、pGL、pGEM_T、pCMV、pBluescript或pcDNA系列，或其片段。
[0029]在另ー優(yōu)選例中，所述的重組載體為pBR322。
[0030]在另ー優(yōu)選例中，所述的來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本為任選自下組的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄本:
[0031](I)與連接的啟動(dòng)子同方向的正向轉(zhuǎn)錄本；
[0032](2)與連接的啟動(dòng) 子反方向的反向轉(zhuǎn)錄本；
[0033](3)標(biāo)記基因或抗性基因的正、反向轉(zhuǎn)錄本；
[0034](4)含有翻譯控制元件的正、反向轉(zhuǎn)錄本；
[0035](5)含有轉(zhuǎn)錄終止子的正、反向轉(zhuǎn)錄本；
[0036](6)來源于所述體外重組DNA的其它轉(zhuǎn)錄本。
[0037]在另ー優(yōu)選例中，所述的標(biāo)記基因或抗性基因選自下組:二氫葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因、綠色熒光蛋白基因、四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、其它特異標(biāo)記基因等。
[0038]在另ー優(yōu)選例中，所述的翻譯控制元件為如核糖體結(jié)合元件、核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)元件、上游小開放閱讀框元件、5’非翻譯區(qū)特異元件等。
[0039]在另ー優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)錄本是:氨芐青霉素抗性基因或其片段與?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶I(ACATl)基因或其片段組成的反式剪接轉(zhuǎn)錄本。
[0040]在另ー優(yōu)選例中，所述的反式剪接轉(zhuǎn)錄本具有如SEQ ID N0.:1所示的多核苷酸。[0041 ] 在另ー優(yōu)選例中，所述的檢測包括:
[0042]對(duì)于轉(zhuǎn)錄本或DNA片段，通過體外擴(kuò)增法和/或核酸測序法進(jìn)行檢測；和/或
[0043]對(duì)于轉(zhuǎn)錄本的翻譯產(chǎn)物，用選自下組的方法進(jìn)行檢測:免疫沉淀法、電泳法、Western印跡法、色譜分離法、質(zhì)譜分析法、氨基酸測序法、或其組合。
[0044]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種鑒定導(dǎo)致人或非人哺乳動(dòng)物遺傳變異的核苷酸序列分析的方法，包括步驟:
[0045](I)測定來自于人或非人哺乳動(dòng)物的待測樣本DNA和/或RNA的序列；
[0046](2)將所測定的樣本DNA序列和/或RNA序列，與所屬同種類的內(nèi)源基因組序列和/或轉(zhuǎn)錄本序列比對(duì)，從而確定變異的序列，其中所述變異的序列是核苷酸序列的插入或置換；
[0047](3)將確定的變異序列與外源重組DNA的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，從而鑒別出來自于外源重組DNA且在同種類內(nèi)源基因組中不存在的、導(dǎo)致人或非人哺乳動(dòng)物遺傳變異的核苷酸序列。
[0048]在另ー優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟:
[0049](4)檢測所述人或非人哺乳動(dòng)物中，是否存在對(duì)應(yīng)于所述導(dǎo)致哺乳動(dòng)物遺傳變異的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄本或其翻譯產(chǎn)物或DNA片段。
[0050]在本發(fā)明的第六方面，提供了ー種試劑盒，所述的試劑盒包括:
[0051](I)使用說明書；以及
[0052](2) 一容器以及位于所述容器內(nèi)的試劑，所述試劑用于檢測待測樣本中的基因組中是否含有來自于外源重組DNA的DNA片段，或所述試劑用于檢測待測樣本中是否含有來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本或其翻譯產(chǎn)物；
[0053]其中所述的待測樣本為人或非人哺乳動(dòng)物的樣本，并且所述的來自于外源重組DNA的DNA片段、轉(zhuǎn)錄本或其翻譯產(chǎn)物是人或非人哺乳動(dòng)物的內(nèi)源基因組或其來源的轉(zhuǎn)錄本或翻譯產(chǎn)物中不存在的。
[0054]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0055]下列附圖用于說明本·發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
[0056]圖1顯示人體內(nèi)來自于外源重組DNA的氨芐青霉素抗性基因的一種轉(zhuǎn)錄本(rAmp)能夠與ACATl基因的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生反式剪接，從而形成ー種獨(dú)特的新轉(zhuǎn)錄本及其翻譯產(chǎn)物；圖1A顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AC29細(xì)胞表達(dá)后經(jīng)蛋白質(zhì)二維電泳純化的ー種人ACATl蛋白，其中帶有人ACAT156kD異構(gòu)體N端的蛋白為P1，P2和P3等三個(gè)點(diǎn)；圖1B顯示經(jīng)MALD1-T0F質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)N端序列測定、蛋白質(zhì)及DNA文庫分析,測定人56kD異構(gòu)體N端的氨基酸序列是來自于外源重組載體的氨芐青霉素抗性基因的一種轉(zhuǎn)錄本(rAmp)的翻譯產(chǎn)物；圖1C顯示rAmp轉(zhuǎn)錄本與ACATl基因轉(zhuǎn)錄本發(fā)生反式剪接的產(chǎn)物的序列測定分析結(jié)果；圖1D顯示人56kD異構(gòu)體的N端序列是rAmp轉(zhuǎn)錄本翻譯產(chǎn)物rAmp_P88的第I至第46個(gè)氨基酸組成的肽段。
[0057]圖2顯示人血液白細(xì)胞(PBMC)基因組DNA中的rAmp DNA分析結(jié)果，PBMC經(jīng)分離得到非貼壁(ua)和貼壁(a)細(xì)胞，抽提細(xì)胞基因組DNA后，利用特異性引物對(duì)rAmp DNA實(shí)施PCR，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0058]圖3顯示人血液白細(xì)胞(PBMC) RNA中的rAmp RNA分析結(jié)果，抽提細(xì)胞總RNA后，利用特異性引物對(duì)rAmp RNA實(shí)施RT-PCR，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0059]圖4顯示人血液白細(xì)胞(PBMC) RNA中外源rAmp RNA與內(nèi)源ACATlmRNA的反式剪接產(chǎn)物分析結(jié)果；圖4A顯示抽提細(xì)胞總RNA后，利用特異性引物對(duì)外源rAmp RNA與內(nèi)源ACATlmRNA的反式剪接產(chǎn)物實(shí)施RT-PCR，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定；圖4B顯示反式剪接RNA的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定。
[0060]圖5顯示人血液白細(xì)胞(PBMC)中反式剪接mRNA的翻譯產(chǎn)物分析，抽提細(xì)胞總蛋白后，利用特異性抗體對(duì)反式剪接mRNA的翻譯產(chǎn)物實(shí)施Western blotting分析。
【具體實(shí)施方式】
[0061]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)天然?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶I(ACATl)基因的轉(zhuǎn)錄本竟然能夠與來自于外源重組載體的氨芐青霉素抗性基因的一種轉(zhuǎn)錄本(rAmp)發(fā)生反式剪接，從而形成一種新轉(zhuǎn)錄本及其翻譯產(chǎn)物。本發(fā)明還提供了待測樣本中人體內(nèi)含外源重組DNA來源的轉(zhuǎn)錄本或翻譯產(chǎn)物或片段的檢測方法和應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0062]術(shù)語
[0063]?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)
[0064]酸基輔酶A:膽固醇酸基轉(zhuǎn)移酶(acyl-coenzyme A:cholesterolacyltransferase, ACAT)是細(xì)胞內(nèi)唯一催化游離膽固醇與長鏈脂肪酸合成膽固醇酷的酶，是參與生命體吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存膽固醇而維持體內(nèi)膽固醇代謝平衡的關(guān)鍵酶之一，在生命細(xì)胞游離膽固醇更新變化、維持血液膽固醇水平等平衡代謝的生理功能中起關(guān)鍵作用，病理上其與膽固醇代謝平衡 異常引起的動(dòng)脈粥樣硬化(AS)、老年性癡呆癥(AD)等病變直接相關(guān)。ACAT的主要包括成員ACATl和ACAT2。
[0065]與膽固醇代謝途徑中的其它關(guān)鍵酶的快速研究進(jìn)展相反，ACAT的研究進(jìn)展相當(dāng)緩慢，到目前為止天然的ACAT還未純化得到，主要原因在于ACAT為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，其純化十分困難。人ACATl cDNA Kl是目前克隆得到唯一的人ACATl基因的cDNA。人ACATl cDNAKl對(duì)應(yīng)序列來源于兩條染色體，由18個(gè)外顯子組成，從5’至3’依次命名為外顯子Xa、Xb和外顯子1-16，其外顯子Xa和外顯子1-16分別與人7號(hào)和I號(hào)染色體的相應(yīng)序列一致。外顯子Xa下游和外顯子I上游序列都是非典型的真核基因內(nèi)含子剪接位點(diǎn)特征序列，而位于外顯子Xa與外顯子I之間的IObp微小外顯子Xb的基因組定位至今仍未確定。序列來源于人兩條不同染色體的ACATl cDNA Kl在內(nèi)源ACAT基因缺失的CHO細(xì)胞株AC29中表達(dá)時(shí)，除了能夠以AUG1397_1399密碼子起始表達(dá)出人50 kD ACATl之外，還表達(dá)出ー種56 kD異構(gòu)體蛋白。人50 kD和56 kD ACATl異構(gòu)體蛋白在細(xì)胞內(nèi)具有相同的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位，人ACATl56kD異構(gòu)體的酶活性較低，約為人50 kD ACATl酶活性的30%左右，當(dāng)人56 kD和50 kDACATl異構(gòu)體蛋白在同一個(gè)細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)，測定的ACATl活性僅為單獨(dú)表達(dá)50 kD ACATl時(shí)酶活性的50%，表明人ACATl 56-kD異構(gòu)體可調(diào)控細(xì)胞ACATl活性。
[0066]反式剪接(trans-splicing)
[0067]如本文所用，術(shù)語“反式剪接”是指:剪接機(jī)器能夠識(shí)別位于不連續(xù)的兩分子pre-RNAs上的剪接位點(diǎn)，并將它們正確連接。在包括人的高等動(dòng)物中都存在反式剪接。天然哺乳動(dòng)物pre-RNA反式剪接現(xiàn)象有外顯子的重復(fù)(exon duplication)(如鼠COT基因和人Spl基因等)、有相鄰基因間(intergenic)剪接(如人RGS12基因和細(xì)胞色素P450 3A基因)、以及屬于跨染色體(interchromosomal)的反式剪接。
[0068]抗生素抗性基因
[0069]如本文所用，術(shù)語“抗生素抗性基因”是指編碼抵抗某種抗生素的物質(zhì)(如酶蛋白)的多核苷酸序列。常用的抗生素抗性基因包括(但不限干):抗氨芐青霉素基因、抗四環(huán)素基因、抗新霉素基因、抗氯霉素基因、抗鏈霉素基因、抗卡那霉素基因。[0070]將所述的抗生素抗性基因置于重組質(zhì)粒中，并將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，在一定的條件下，可以賦予宿主細(xì)胞抵抗特定抗生素的能力。對(duì)于抗生素抗性基因的選擇和重組質(zhì)粒的制備是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。
[0071]氨芐青霉素抗性基因
[0072]如本文所用，術(shù)語“氨芐青霉素抗性基因”或“抗氨芐青霉素基因”是指編碼P -內(nèi)酰胺酶(beta-lactamase)的多核苷酸序列,所述編碼的P _內(nèi)酰胺酶蛋白可分泌進(jìn)入細(xì)菌的周質(zhì)區(qū)，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并催化(6-內(nèi)酰胺環(huán)水解，從而解除氨芐青霉素的毒性。氨芐青霉素抗性基因是目前重組質(zhì)粒中最為常見的選擇標(biāo)記。
[0073]重組載體
[0074]如本文所用，術(shù)語“重組載體”是指經(jīng)過人工構(gòu)建或改造的能夠攜帶目的DNA片段并在宿主細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)復(fù)制的DNA載體。表達(dá)載體的ー個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、抗生素港行基因及啟動(dòng)子、翻譯控制元件(如核糖體結(jié)合位點(diǎn))、轉(zhuǎn)錄終止子、或其組合等。
[0075]常見的重組載體包括(但不限于):pBR322、pUC18/19、pFLAG、pGL、pGEM-T、pCMV、pBluescript、pcDNA3 系列等。
[0076]重組載體可以包括重組質(zhì)粒和重組黏粒等。質(zhì)粒具有性質(zhì)穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，因此質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用常規(guī)方法在質(zhì)粒載體上進(jìn)行操作。這些方法包括DNA的體外重組技術(shù)、合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。重組載體上的特定DNA序列可有效連接到適當(dāng)啟動(dòng)子的下游，以指導(dǎo)mRNA合成。
[0077]重組載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有:大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌`細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞等。
[0078]用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另ー種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0079]轉(zhuǎn)錄本或?qū)?yīng)的翻譯產(chǎn)物與DNA片段
[0080]本發(fā)明提供了一種分離的轉(zhuǎn)錄本，所述轉(zhuǎn)錄本分離自人或非人哺乳動(dòng)物，并且所述的轉(zhuǎn)錄本是:來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本與人或非人哺乳動(dòng)物基因組的轉(zhuǎn)錄本的剪接轉(zhuǎn)錄本；或來自于外源重組DNA的未剪接的轉(zhuǎn)錄本。
[0081]本發(fā)明還提供了一種分離的DNA片段，所述的DNA片段分離自人或非人哺乳動(dòng)物，并且所述的DNA片段來自于外源重組DNA，并重組于人或非人哺乳動(dòng)物基因組中；優(yōu)選地，所述的DNA片段編碼權(quán)利要求1所述的來自于外源重組DNA的未剪接的轉(zhuǎn)錄本。
[0082]本發(fā)明還提供了一種分離的翻譯產(chǎn)物，所述的翻譯產(chǎn)物是由所述轉(zhuǎn)錄本所翻譯的。
[0083]本發(fā)明還提供所述轉(zhuǎn)錄本，或DNA片段，或翻譯產(chǎn)物的用途，用于制備檢測試劑或試劑盒，所述檢測試劑或試劑盒用于檢測人或非人哺乳動(dòng)物中是否含有來自于外源重組DNA的DNA片段，或所述的人或非人哺乳動(dòng)物中是否存在來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本或其翻譯產(chǎn)物。
[0084]應(yīng)用
[0085]本發(fā)明提供了一種非診斷性和非治療性的檢測方法:檢測待測樣本中是否含有來自于外源重組DNA的DNA片段、或來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本，或所述轉(zhuǎn)錄本的翻譯產(chǎn)物，其中所述的待測樣本為人或非人哺乳動(dòng)物的樣本，并且所述的來自于外源重組DNA的DNA片段、或來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本，或所述轉(zhuǎn)錄本的翻譯產(chǎn)物在樣本中是不存在的。
[0086]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的人或非人哺乳動(dòng)物基因組來源的轉(zhuǎn)錄本或翻譯產(chǎn)物或DNA片段樣本是沒有被外源重組DNA污染的樣本。
[0087]如果所述的樣本含DNA或RNA，則所述方法優(yōu)選地包括步驟:(I)獲得待測樣本的基因組DNA，或?qū)⒋郎y樣本的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA ； (2)檢測步驟(1)所述的DNA中是否含有來自于外源重組DNA的多核苷酸或其互補(bǔ)序列，并且所述的多核苷酸或其互補(bǔ)序列在內(nèi)源基因組中、或其轉(zhuǎn)錄本中不存在。
[0088]更優(yōu)選地，所述的轉(zhuǎn)錄本包括未剪接的轉(zhuǎn)錄本和經(jīng)剪接的轉(zhuǎn)錄本；經(jīng)剪接的轉(zhuǎn)錄本包括經(jīng)反式剪接或順式剪接的轉(zhuǎn)錄本。
[0089]所述的待測樣本為人的樣本；人的樣本選自下組:體液樣本、唾液樣本、血液樣本、血清樣本、淋巴液樣本、脊髓液樣本、精液樣本、尿液樣本、毛發(fā)樣本、細(xì)胞樣本、組織樣本、或器官樣本。
[0090]或優(yōu)選地， 來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本為任選自下組的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄本:(I)與連接的啟動(dòng)子同方向的正向轉(zhuǎn)錄本；(2)與連接的啟動(dòng)子反方向的反向轉(zhuǎn)錄本；(3)標(biāo)記基因或抗性基因的正、反向轉(zhuǎn)錄本；(4)含有翻譯控制元件的正、反向轉(zhuǎn)錄本；(5)含有轉(zhuǎn)錄終止子的正、反向轉(zhuǎn)錄本；(6)來源于所述體外重組DNA的其它轉(zhuǎn)錄本。
[0091]本發(fā)明所述的檢測包括:對(duì)于來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本或DNA片段，通過體外擴(kuò)增法和/或核酸測序法進(jìn)行檢測；和/或?qū)τ谵D(zhuǎn)錄本的翻譯產(chǎn)物，用選自下組的方法進(jìn)行檢測:免疫沉淀法、電泳法、Western印跡法、色譜分離法、質(zhì)譜分析法、氨基酸測序法、或其組合。
[0092]本發(fā)明還提供了一種鑒定導(dǎo)致人或非人哺乳動(dòng)物遺傳變異的核苷酸序列分析的方法，包括步驟:測定來自于人或非人哺乳動(dòng)物的待測樣本DNA和/或RNA的序列；將所測定的樣本DNA序列和/或RNA序列，與所屬同種類的內(nèi)源基因組序列和/或轉(zhuǎn)錄本序列比對(duì)，從而確定變異的序列，其中所述變異的序列是核苷酸序列的插入或置換；將確定的變異序列與外源重組DNA的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，從而鑒別出來自于外源重組DNA且在同種類內(nèi)源基因組中不存在的、導(dǎo)致人或非人哺乳動(dòng)物遺傳變異的核苷酸序列。
[0093]優(yōu)選地，所述方法還包括步驟:檢測所述人或非人哺乳動(dòng)物中，是否存在對(duì)應(yīng)于所述導(dǎo)致哺乳動(dòng)物遺傳變異的核苷酸序列或其來源的轉(zhuǎn)錄本或翻譯產(chǎn)物或DNA片段。
[0094]試劑盒
[0095]本發(fā)明提供了ー種試劑盒，包括:使用說明書；以及一容器以及位于所述容器內(nèi)的試劑，所述試劑用于檢測待測樣本中的基因組中是否含有來自于外源重組DNA的DNA片段，或所述試劑用于檢測待測樣本中是否含有來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本或其翻譯產(chǎn)物；其中所述的待測樣本為人或非人哺乳動(dòng)物的樣本，并且所述的來自于外源重組DNA的DNA片段、轉(zhuǎn)錄本或其翻譯產(chǎn)物是人或非人哺乳動(dòng)物的內(nèi)源基因組或其來源的轉(zhuǎn)錄本或翻譯產(chǎn)物中不存在的。
[0096]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè) (New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0097]材料和方法
[0098]細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640和胎牛血清購自Life Technologies公司(Rockville, USA) ；MMLV-逆轉(zhuǎn)錄酶購自 Promega 公司(Madison, USA) ；Taq DNA 聚合酶和 dNTP 購自 TaKaRa 公司(Dalian, China) ；TRIzol Reagent 購自 Sigma 公司(St.Louis，USA);引物寡聚核苷酸由上海生エ生物技術(shù)有限公司(Shanghai，China)合成；HRP率禹聯(lián)的 Ant1-rabbit IgG 購自 Pierce 公司(Rockford, USA) ;ECL 檢測試劑購自 SantaCruz Biotechnology公司(Santa Cruz, USA);人AB血清、蛋白酶抑制劑購自Sigma公司(St.Louis, USA) ； TIANamp Genomic DNA Kit 購自北京 TIANGENBIOTECH 有限公司(Beijing, China) ? 真核表達(dá)載體 pcDNA3 購自 Invitrogen 公司(Carlsbad, USA)。
[0099]Flag融合表達(dá)的ACAT1-NTP的純化
[0100]轉(zhuǎn)染的AC29細(xì)胞培養(yǎng)48h后，利用含有相應(yīng)蛋白酶抑制劑的裂解液(50mMTrisHCl, pH7.4，150mM NaCl, ImM EDTA, l%Triton X-100)于冰上處理 30min，12，OOOXg 離心lOmin，取可溶部分裂解液加入到經(jīng)TBS(50mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH7.4)預(yù)處理的ANT1-FLAG? M2 Affinity Gel中，4°C進(jìn)行結(jié)合反應(yīng),過夜；1，OOOX g離心5min,收集結(jié)合有Flag融合蛋白的ANT1-FLAG? M2Affinity Gel，用TBS洗滌數(shù)次去凈非特異結(jié)合蛋白；加入IOOiU洗脫液(0.1Mglycine-HCl, pH3.5)洗脫Flag融合蛋白；洗脫液迅速加入到中和緩沖液(0.5MTris-HCl, pH7.4，1.5M NaCl)中，保存樣品于_80°C備用。
[0101]考馬斯亮藍(lán)快速染色
[0102]含有分離蛋白樣品的SDS-PAGE膠經(jīng)去離子水漂洗，用25%的こ醇于微波爐中加熱處理4min，棄凈こ醇用去離子水漂洗，反復(fù)處理4次；然后用快染液(IOOmg CBB G250，100ml濃磷酸,定容至1，000ml)于微波爐中加熱處理2min,脫色搖床上反應(yīng)至顯色。
[0103]總蛋白制備及Western blot分析
[0104]培養(yǎng)的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗兩次，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液(50mMTris-HCl pH8.0,0.1%SDS,150mM NaCl，2mM MgC12,1.5%NP-40,0.5%Deoxycholate,50mMDTT)溶解細(xì)胞蛋白質(zhì)。蛋白溶液經(jīng)18號(hào)注射器針頭剪切10次，然后用37°C水浴30min。蛋白含量測定用BCA蛋白測定試劑盒(Bio-Rad)進(jìn)行。按照Laemmli的方法(LaemmliUK.1970)，蛋白樣品用12%或10%的SDS-PAGE電泳分離。電泳完畢后，利用Amersham濕式電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜(NC)上，設(shè)定電流為400mA，時(shí)間2h。轉(zhuǎn)印完畢后取出NC膜，含有轉(zhuǎn)移蛋白的膜面向上。依次用封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST (50mMTr i s-HCl，
0.15M NaCl和0.05%Tween_20，pH值為7.6)在室溫孵育2h，特異抗體在室溫孵育3h，HRP耦聯(lián)的二抗室溫孵育lh。孵育后分別用TBST和TBS洗NC膜三次。最后，用ECL檢測試劑進(jìn)行熒光顯影。
[0105]基因組DNA，總RNA制備及PCR，RT-PCR分析
[0106]細(xì)胞基因組DNA的制備依照TIANamp Genomic DNA Kit提取試劑盒的說明操作?？俁NA的制備利用Trizol Reagent (Sigma)抽提。
[0107]反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR):cDNA的合成采用20 反應(yīng)體系中，含有4 y g細(xì)胞總RNA或5iil體外剪接產(chǎn)物RNA、2pmol人ACATl基因特異性逆轉(zhuǎn)錄引物、IOnmoldNTPs、4 u 15XFirst Strand Buffer 和 I u I (200U/u 1)MMLV Reverse Transcriptase,42°C反應(yīng)I小時(shí)后，70°C 15min滅活反應(yīng)體系中的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在25 u I反應(yīng)體系中包含I u I逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA模板、5nmoI dNTP> IOpmol each of primersets 和 IU Taq DNA polymerase。PCR 反應(yīng)條件如下:先 94°C變性 3min ;再進(jìn)入 94°C、30s,55°C、30s，72°C、30s 的循環(huán) 38 次；最后 72°C延伸 5min。IOu I PCR 產(chǎn)物用 2%agarose 膠分離、鑒定其大小。所有特異性引物見下表(表1)。
[0108]表1
[0109]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的轉(zhuǎn)錄本，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄本分離自人或非人哺乳動(dòng)物，并且所述的轉(zhuǎn)錄本是: (a):來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本與人或非人哺乳動(dòng)物基因組的轉(zhuǎn)錄本的剪接轉(zhuǎn)錄本；或 (b):來自于外源重組DNA的未剪接的轉(zhuǎn)錄本。
2.一種分離的DNA片段，其特征在于，所述的DNA片段分離自人或非人哺乳動(dòng)物，并且所述的DNA片段來自于外源重組DNA，并重組于人或非人哺乳動(dòng)物基因組中； 優(yōu)選地，所述的DNA片段編碼權(quán)利要求1所述的來自于外源重組DNA的未剪接的轉(zhuǎn)錄本。
3.一種分離的翻譯產(chǎn)物，其特征在于，所述的翻譯產(chǎn)物是由權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄本所翻譯的。
4.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)錄本，或權(quán)利要求2所述DNA片段，或權(quán)利要求3所述翻譯產(chǎn)物的用途，其特征在于，用于制備檢測試劑或試劑盒，所述檢測試劑或試劑盒用于檢測人或非人哺乳動(dòng)物的基因組中是否含有來自于外源重組DNA的DNA片段，或所述的人或非人哺乳動(dòng)物中是否存在來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本或其翻譯產(chǎn)物。
5.一種非診斷性和非治療性的檢測方法，其特征在于，包括步驟: 檢測待測樣本中是否含有來自于外源重組DNA的DNA片段、或來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本，或所述轉(zhuǎn)錄本的翻譯產(chǎn)物，其中所述的待測樣本為人或非人哺乳動(dòng)物的樣本，并且所述的來自于外源重組DNA的DNA片段、或來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本，或所述轉(zhuǎn)錄本的翻譯產(chǎn)物在樣本中是不存在的。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的樣本含DNA或RNA，并且所述檢測包括步驟: (1)獲得待測樣本的基因組DNA，或?qū)⒋郎y樣本的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA； (2)檢測步驟(1)所述的DNA中是否含有來自于外源重組DNA的多核苷酸或其互補(bǔ)序列，并且所述的多核苷酸或其互補(bǔ)序列在內(nèi)源基因組中、或其轉(zhuǎn)錄本中不存在； 優(yōu)選地，所述的轉(zhuǎn)錄本包括未剪接的轉(zhuǎn)錄本和經(jīng)剪接的轉(zhuǎn)錄本。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的外源重組DNA選自下組:表達(dá)載體或其片段、表達(dá)質(zhì)?；蚱淦?、穿梭載體或其片段、穿梭質(zhì)?；蚱淦?、重組載體或其片段、重組質(zhì)?；蚱淦?、或其它特異重組DNA或其片段。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)錄本是:氨芐青霉素抗性基因或其片段與?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶I(ACATl)基因或其片段組成的反式剪接轉(zhuǎn)錄本。
9.一種鑒定導(dǎo)致人或非人哺乳動(dòng)物遺傳變異的核苷酸序列分析的方法，其特征在干，包括步驟: (1)測定來自于人或非人哺乳動(dòng)物的待測樣本DNA和/或RNA的序列； (2)將所測定的樣本DNA序列和/或RNA序列，與所屬同種類的內(nèi)源基因組序列和/或轉(zhuǎn)錄本序列比對(duì)，從而確定變異的序列，其中所述變異的序列是核苷酸序列的插入或置換； (3)將確定的變異序列與外源重組DNA的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，從而鑒別出來自于外源重組DNA且在同種類內(nèi)源基因組中不存在的、導(dǎo)致人或非人哺乳動(dòng)物遺傳變異的核苷酸序列。
10.一種檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括: (1)使用說明書；以及 (2)一容器以及位于所述容器內(nèi)的試劑，所述試劑用于檢測待測樣本中的基因組中是否含有來自于外源重組DNA的DNA片段，或所述試劑用于檢測待測樣本中是否含有來自于外源重組DNA的轉(zhuǎn)錄本或其翻譯產(chǎn)物； 其中所述的待測樣本為人或非人哺乳動(dòng)物的樣本，并且所述的來自于外源重組DNA的DNA片段、轉(zhuǎn)錄本或其翻譯產(chǎn)物是人或非人哺乳動(dòng)物的內(nèi)源基因組或其來源的轉(zhuǎn)錄本或翻譯產(chǎn)物中不存在的。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103589740SQ201210293467
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月16日
【發(fā)明者】李伯良, 胡光晶, 陳佳, 趙曉楠, 許佳佳, 郭冬青, 楊新穎, 熊纓, 李琴, 宋保亮, 魯明, 胡西旵 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院