豬sncg基因的一個可用于溯源的snp分子標記及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬SNCG基因的一個可用于溯源的SNP分子標記及其檢測方法。所述的SNP分子標記是通過DNA池（pool）測序獲得的，共1599bp，其包含部分第三內含子序列，第984位堿基處有一個堿基突變984C-984T，其序列如SEQ?ID?NO?1所示。在包括11個豬品種或品系的試驗群體中，分析該SNP分子標記在試驗群體中等位基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)該分子標記在不同的品種或品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，并且雜合度都大于0.3，初步判定該SNP標記可用作豬肉產(chǎn)品DNA溯源。
【專利說明】豬SNCG基因的一個可用于溯源的SNP分子標記及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬食品安全領域，涉及一種豬SNCG基因的一個可用于溯源的SNP分子標記及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]隨著生活水平和保健意識的提高，人們越來越注重食品安全問題。豬肉制品作為人膳食中重要的蛋白質來源，如何確保其安全衛(wèi)生，保障消費者的身體健康和生命安全已成為全球性的熱點問題。世界各國政府紛紛采取一系列的技術措施來強化對肉產(chǎn)品的安全管理，以期最大程度上減少食品安全事件的發(fā)生。我國各大城市也紛紛建立了肉產(chǎn)品的追溯系統(tǒng)，通過肉制品的溯源管理，能夠為消費者提供準確而詳細的有關產(chǎn)品的信息，有利于生產(chǎn)經(jīng)營者及時發(fā)現(xiàn)各環(huán)節(jié)中存在的不安全隱患，為消費者提供一個獲取有效可靠信息的途徑。更為重要的是，大大加強了政府部門對肉質品質量安全的監(jiān)管，為國家迅速建立食品安全風險的應對機制提供有效信息，將有助于社會的安定。
[0003]但是我國肉產(chǎn)品追溯系統(tǒng)所采用的標簽技術存在標簽丟失、記錄出差、標記圖案模糊不清以及標簽容易人為改換等缺點；而國外發(fā)達國家所采用的DNA溯源技術是基于個體DNA指紋圖譜的生物學技術，有著絕對的不可更改性和唯一性，不受人為因素影響。而且因為DNA溯源技術容易分型、重復性好、檢測手段簡單快捷、成本低廉等成為目前國際上被公認為最具發(fā)展?jié)摿蛻脙r值的快速溯源技術。
[0004]DNA溯源技術的產(chǎn)生源于DNA的遺傳與變異，用于構建個體DNA指紋圖譜的分子標記有AFLP標記(擴增片段長度多態(tài)性)、SSR標記(微衛(wèi)星標記)和SNP標記(單核苷酸多態(tài)性)。
[0005]AFLP標記具有高度可靠性和操作簡便性，但卻同時存在著對模板反應表現(xiàn)遲鈍、譜帶可能發(fā)生錯配與缺失、成本相對比較高等缺點。相比SNP標記，微衛(wèi)星標記的等位基因眾多，多態(tài)豐富，但也正因如此，使得SSR標記的帶型復雜，給DNA指紋識別自動化和規(guī)模化帶來困難。SNP標記是第三代分子遺傳標記，是指基因組同一位點上單個核苷酸的變異，一般表現(xiàn)為二等位基因，非常適宜高通量自動化分析，所以日益成為動物身份識別最受關注的分子標記。
[0006]但是用于肉產(chǎn)品溯源的SNP標記不同于一般的SNP標記，對于單個的SNP標記，它必須至少具有以下特征:(1)變異度高，在品種或品系中等位基因頻率接近；(2)品種間等位基因分布頻率差異?。?3)雜合度大于等于0.3。
[0007]在長期的育種工作中，研究者積累了大量的SNP標記，但是這些SNP標記往往集中分布在某些染色體上，如1號染色體，12號染色體等，而另外部分染色體，如5號，8號，14號，18號染色體等則缺乏SNP標記，因此為了滿足對豬肉產(chǎn)品進行DNA溯源的要求，我們進行新SNP標記的研究工作。
[0008]豬SNCG基因位于豬的18號染色體上， 該基因在豬中研究甚少。人的SNCG基因稱為、突觸核蛋白基因(Y-synuclein，SNCG)，近年來研究發(fā)現(xiàn)的乳腺癌特異性基因1(Breast Cancer Specific Gene 1,BCSG1)被證實與\突觸核蛋白是同一蛋白，其與乳腺癌和卵巢癌密切相關，在多數(shù)進展期的乳腺癌和卵巢癌中特異性的高表達，而與其他腫瘤的關系報道相對較少。SNCG基因是新的人類多種癌癥廣譜性生物標記，該論文在世界癌癥研究著名雜志《美國癌癥研究雜志》和《國際腫瘤學雜志》上刊登。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種豬SNCG基因的一個可用于溯源的SNP分子標記及其檢測方法，該SNP分子標記在商品豬培育中，可以廣泛用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源及其檢測，特別是用于豬肉產(chǎn)品的安全性溯源。
[0010]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案來實現(xiàn)。
[0011]所述的豬SNCG基因的一個可用于溯源的SNP分子標記，共1599bp，包含部分第三內含子序列，且第984位堿基處有一個堿基突變984C — 984T，其DNA序列如SEQ ID NO 1所示。
[0012]所述的SNP分子標記是通過DNA池(pool)測序獲得的，并在包括10個豬品種或品系的試驗群體(共計235個個體)中，分析該SNP分子標記在試驗群體中等位基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)該分子標記在不同的品種和品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，初步判定該SNP標記可用作豬肉產(chǎn)品DNA溯源。
[0013]所述的豬SNCG基因中一個可用于溯源的SNP分子標記的檢測方法，采用PCR-Bpull021-RFLP方法進行，包括以下步驟:
[0014](1)構建豬的 DNA 池(pool);
[0015](2)設計正、反向引物分離S`NCG基因的DNA片段，測序并分析；
[0016](3)PCR-Bpull02I_RFLP檢測方法的建立及突變位點的檢測；
[0017](4)采集10個品種和品系的耳組織樣，共計235個個體；
[0018](5)檢測SNP分子標記在試驗群體的分布，統(tǒng)計分析，并進一步試驗驗證是否適用于豬肉產(chǎn)品溯源中。
[0019]其中，上述檢測方法中，所述的分離SNCG基因的DNA片段的正、反向引物序列如下:
[0020]正向引物:5,-TTTGT GATGG TGCTC TGCGT TT-3' (SEQ ID No 2)
[0021]反向引物:5,-CCCTG CCTGA AGGTG GTTGT-3' (SEQ ID No 3)
[0022]本發(fā)明通過DNA池檢測到豬SNCG基因中存在的SNP分子標記，在包括10個豬品種或品系的試驗群體中，分析該SNP分子標記在試驗群體中等位基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)該分子標記在不同的品種或品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，并且雜合度都大于0.3，初步判定該SNP標記可用作豬肉產(chǎn)品DNA溯源以及豬肉產(chǎn)品的安全性溯源中。
[0023]由于單個SNP溯源標記是無法完成溯源的，因此在溯源模擬試驗中，將本發(fā)明獲得的SNCG基因的新SNP分子標記位點與其它現(xiàn)有已公開的SNP分子標記位點結合在一起(共計12個SNP位點)進行溯源實驗。在屠宰場隨機挑選100個個體，檢測每個個體12個SNP位點的基因型，統(tǒng)計每個個體的基因型結果，發(fā)現(xiàn)100個個體均擁有各自不通的基因型，能實現(xiàn)個體區(qū)分；同時，隨機在這100個個體中挑取20份肌肉樣，同樣檢測統(tǒng)計12個SNP分子標記位點的基因型，然后跟100個個體的基因型進行比對分析，發(fā)現(xiàn)均能找到與20份肌肉樣品基因型完全一致的個體，即通過溯源在100個個體中找到20份豬肌肉的來源個體，因此判定本發(fā)明的該SNP分子標記可以用于豬肉產(chǎn)品溯源。
【具體實施方式】
[0024]以下結合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術方案。
[0025]實施例1分子標記的查找
[0026](1) DNA 池(pool)的構建
[0027]分別隨機采集杜洛克豬、梅山豬個體各2頭(不分性別)的耳組織，提取DNA后，等量吸取4個個體的DNA放入同一離心管中，混勻待用。
[0028](2)引物設計
[0029]以豬SNCG基因的DNA序列(Genbank:EF104639)為模板，設計引物分離豬SNCG基因(以一頭杜洛克豬的DNA為PCR擴增的模板)，引物如下:
[0030]正向引物:5,-TTTGTGATGGTGCTCTGCGTTT-3' (SEQ ID No 2)
[0031]反向引物:5,-CCCTGCCTGAAGGTGGTTGT-3' (SEQ ID No 3)
[0032]PCR 反應總體積為 20 μ 1，其中豬 SNCG基因組DNA 約 lOOng，含 1 Xbuffer(Promega公司)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP (上海生工生物公司)終濃度為150 μ mol/L，引物終濃度為
0.2 μ mol/L, 2U Taq DNA 聚合酶(Promega 公司)。
[0033]PCR 擴增:94°C 4min,(94°C 30s，62°C退火 40s，72°C 40s)循環(huán) 30 次，最后 72°C延伸 lOmin。
[0034]PCR反應產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0035](3)克隆測序分析
[0036]將得到的豬SNCG基因PCR產(chǎn)物按照如下方法進行克隆。
[0037]PCR產(chǎn)物的純化:在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mlEpendorff管中，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(天根生化科技有限公司)純化。
[0038]連接反應:將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體(大連寶生物公司)連接，連接反應總體積是10μ 1，其中包括5μ 1 solution I (大連寶生物公司)，0.5 μ 1的T載體(大連寶生物公司)，2.5μ 1的純化PCR產(chǎn)物，最后加入2μ 1滅菌水置4°C水浴過夜。
[0039]轉化:無菌狀態(tài)下取100-120 μ 1感受態(tài)細胞(天根生化科技有限公司)于1.5mlEpendorff管中，將5μ 1的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42°C熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3_4min，加入400 μ 1無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C平放lh后倒置培養(yǎng)。
[0040]菌落PCR鑒定:經(jīng)菌落PCR鑒定后的菌株在LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)過夜，隨即挑取多個克隆子送到上海生工生物有限公司測序。
[0041]經(jīng)測試，該經(jīng)拼接后的豬SNCG基因的DNA序列共1599bp，包含部分第三內含子序列，序列如SEQ ID No 1所示。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)其第984堿基處存在一個堿基突變984C —984T。通過分子生物學軟件分析，發(fā)現(xiàn)該第984堿基處的堿基突變導致Bpull021-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,即 Bpull02I_RFLP 位點)多態(tài)性。[0042](4) PCR-Bpull021-RFLP檢測方法的建立及突變位點的檢測
[0043]酶切反應總體積10 μ 1，其中IXbuffer 10 μ 1，PCR產(chǎn)物3-5 μ 1，限制性內切酶Bpull02I 為 0.5μ 1 (5U)，用 Η2。補足 10 μ 1，37°C 水浴 4h，稱取 0.6g 瓊脂糖溶于 15.75mlDEPC (上海生工生物公司)處理水中，稍冷卻(60°C)，加入5ml的5X甲醛凝膠電泳緩沖液和4.25ml的37%甲醛溶液，混勻制膠，電泳后檢測酶切結果。結果發(fā)現(xiàn):SEQ ID No 1序列中C等位基因只有1599bp —個片段，T等位基因有985bp和6146bp兩個片段，這兩個等位基因可組成三種基因型，CC，CT，TT。且在該SEQ ID No 1序列的第984位堿基發(fā)生突變，C — T。
[0044]實施例2等位基因的分布情況
[0045]( 1)試驗群體的設計
[0046]試驗組:采集皮特蘭(21頭)、申農(17頭)、大白(43頭)、大申(52頭)、長申(16頭)、杜申(23頭)、皮大申(11頭)、長大申(25頭)、杜大申(7頭)和杜皮大申(20頭)個體的耳組織，提取DNA，共計235個DNA樣本。
[0047]試驗群體的目的在于檢測SNP標記在不同品種中的分布情況。
[0048](2)基因檢測
[0049]正向引物:5,-TTTGTGATGGTGCTCTGCGTTT-3' (SEQ ID No 2)
[0050]反向引物:5,-CCCTGCCTGAAGGTGGTTGT-3' (SEQ ID No 3)
[0051]進行擴增(條件如實施例1)，用相同的PCR-Bpull021-RFLP方法檢測試驗群體所有的個體基因型。
[0052](3)統(tǒng)計分析
[0053]記錄所有個體的基因型，并計算等位基因頻率和雜合度，結果如下表1。
[0054]表1
[0055]
【權利要求】
1.一種豬SNCG基因的一個可用于溯源的SNP分子標記，是通過DNA池測序獲得的，共1599bp，包含部分第三內含子序列，第984位堿基處有一個堿基突變984C — 984T。
2.根據(jù)權利要求1所述的SNP分子標記，其DNA序列如SEQID NO 1所示。
3.權利要求1或2所述的豬SNCG基因的一個可用于溯源的SNP分子標記的檢測方法，其特征在于，采用PCR-Bpull021-RFLP方法進行，包括以下步驟: (1)構建豬的DNA池； (2)設計正、反引物分離豬SNCG基因的DNA片段，測序并分析； (3)PCR-Bpull021-RFLP檢測方法的建立及突變位點的檢測； (4)采集豬的10個品種或品系的耳組織樣，共計235個個體； (5)檢測SNP分子標記在試驗群體的分布，統(tǒng)計分析，并進一步試驗驗證是否適用于豬肉產(chǎn)品溯源。
4.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，分離豬SNCG基因的DNA片段的正、反向引物的序列分別如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
5.權利要求1或2所述的豬SNCG基因的一個可用于溯源的SNP分子標記在豬肉產(chǎn)品DNA溯源中的 應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103589716SQ201210296711
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月17日 優(yōu)先權日:2012年8月17日
【發(fā)明者】吳瀟, 唐雪明, 楊世方, 趙凱, 王金斌, 劉華, 蔣瑋, 何建華 申請人:上海市農業(yè)科學院