一株生產(chǎn)己二酸前體物順,順-粘康酸的大腸埃希氏菌及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】順，順-粘康酸是一種重要的化工有機(jī)酸，該產(chǎn)品具有廣泛的用途，可以作為己二酸的前體物。把順，順-粘康酸氫化轉(zhuǎn)化為己二酸就可以用于生產(chǎn)尼龍66等聚合物。本發(fā)明利用組合代謝工程的方法，把不同微生物來(lái)源、經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的3-脫氫莽草酸脫水酶，原兒茶酸脫羧酶、兒茶酚1，2-雙氧化酶以及人工設(shè)計(jì)的組成型啟動(dòng)子和終止子組合成異源表達(dá)模塊，并導(dǎo)入莽草酸脫氫酶突變的大腸埃希氏菌中構(gòu)建了一株生產(chǎn)順，順-粘康酸的重組大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)TIB-LEc340?CGMCC?No?6435。大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)TIB-LEc340CGMCC?No?6435在30℃-40℃發(fā)酵16小時(shí)-120小時(shí)，得到的發(fā)酵液中順，順-粘康酸粘康酸的含量最高可達(dá)52g/L，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—株生產(chǎn)己二酸前體物順，順-粘康酸的大腸埃希氏菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到生產(chǎn)己二酸前體物順，順-粘康酸的代謝工程菌,大腸埃希氏菌(Escherichia coli) TIB-LEc340 CGMCC No 6435和利用該菌發(fā)酵生產(chǎn)順，順-粘康酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]己二酸(Adipic acid)是六碳二元酸，具有脂肪族二元酸的通性，能發(fā)生成鹽反應(yīng)、酯化反應(yīng)、酰胺反應(yīng)，能與二元胺縮合成高分子聚合物，是生產(chǎn)己二胺、尼龍66、纖維和工程塑料及其樹(shù)脂的重要工業(yè)基礎(chǔ)原料(van Duuren JB, Brehmer B, Mars AE, Eggink G,Dos Santos VA, Sanders JP.A limited LCA of bio—adipic acid !Manufacturing thenylon-6,6 precursor adipic acid using the benzoic acid degradation pathway fromdifferent feedstocks.Biotechnol Bioeng.2011 108(6):1298-306) ?統(tǒng)計(jì)表明，全球己二酸消耗量超過(guò)300萬(wàn)噸，其中尼龍66纖維占37%，尼龍66樹(shù)脂占25%，聚氨酯占25%。我國(guó)的消耗量超過(guò)了 50萬(wàn)噸。我國(guó)的己二酸需求量每年都在增長(zhǎng)，聚氨酯生產(chǎn)企業(yè)的需求量每年增長(zhǎng)在10%以上。
[0003]當(dāng)前己二酸的生產(chǎn)主要是以環(huán)己烷為原料的硝酸氧化法，占全球生產(chǎn)能力的90%以上。該法中硝酸的使用嚴(yán)重腐蝕設(shè)備，而且產(chǎn)生的副產(chǎn)物氮氧化物被認(rèn)為是引起全球變曖和臭氧減少的原因之一，給環(huán)境造成了極大的污染。因此，研究開(kāi)發(fā)新的清潔無(wú)害己二酸生產(chǎn)工藝越來(lái)越受到人們的重視。微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)己二酸有幾十年的研究經(jīng)歷，不動(dòng)桿菌、短桿菌、假單胞菌和黃色桿菌等屬微生物可以轉(zhuǎn)化苯甲酸、兒荼酚、環(huán)己醇、環(huán)己烷等化合物生產(chǎn)己二酸(Cheng Q, Thomas SMiKostichka K，Valentine JRiNagarajan V.Geneticanalysis of a gene cluster for cyclohexanol oxidation in Acinetobactersp.strain SE19 by in vitro transosition.J Bacteriol.2000 182(17):4744-4751.)，這些生物轉(zhuǎn)化不需要化學(xué)催化劑、氧化劑以及溶劑，是潔凈無(wú)害的生產(chǎn)工藝。但是微生物的轉(zhuǎn)化生廣能力和效率有待進(jìn)一步提1?。
[0004]然而，化學(xué)法和微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)己二酸所需的苯類(lèi)原料需要來(lái)自于石油資源，是不可再生的。因此利用可再生的生物質(zhì)資源代替石油資源來(lái)生產(chǎn)己二酸是可持續(xù)發(fā)展的需要。近年來(lái)，隨著工業(yè)生物技術(shù)的快速進(jìn)步，特別是基因合成與遺傳改造、代謝工程與合成生物學(xué)以及系統(tǒng)生物學(xué)等的快速進(jìn)步發(fā)展(Keasling JD.Manufacturingmolecules through metabolic engineering.Science.2010330(6009):1355-8;Na D， Kim TY, Lee SY.Construction and optimization of synthetic pathways inmetabolic engineering.Curr Opin Microbiol.201013 (3):363-70 ;Dhamankar H，Prather KL.Microbial chemical factories:recent advances in pathway engineeringfor synthesis of value added chemicals.Curr Opin Struct Biol.2011 21(4):488-94 ；Du J，Shao Z，Zhao H.Engineering microbial factories for synthesis ofvalue-added products.J Ind Microbiol Biotechnol.201138(8):873-90)，設(shè)計(jì)、合成生產(chǎn)己二酸及其前體化合物的實(shí)用人工細(xì)胞工廠，從可再生的生物質(zhì)資源生物制造己二酸引起了人們的極大關(guān)注(Burgard AP，Pharkya Osterhout RE.Microorganismsfor the production of adipic acid and other compounds.US Patent US7799545B2 ；Fruchey OS，Manzer LE, Dunuwila D，Keen BT, Albin BA，Clinton NA，DombekBD.Processes for producing adipic acid from fermentation broths containingdiammonium adipate.US Patent Application Publication，US 2011/0269993A1 ；BurgardAP, Pharkya Osterhout RE.Microorganisms and methods for the biosynthesis ofadipate, hexamethylenediamine and 6-aminocaproic acid..US Patent ApplicationPublication，US2010/0317069A1 ；Wu L, Trefzer AC，de Wilddeman S，van den Berg,B.Adipate ester or thioester synthesis.W0/2009/113853.)。
[0005]美國(guó)密歇根州立大學(xué)John Frost研究組通過(guò)來(lái)源于不同的微生物的3-脫氫莽草酸脫水酶(3-dehydroshikimate dehydratase，AroZ)，原兒荼酸脫羧酶(Protocatechuatedecarboxylase，AroY)和兒荼酌I，2_雙氧化酶(Catechol-1，2-dioxygenase，CatA)組成的異源合成途徑。把異源合成途徑轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌后催化3-脫氫莽草酸轉(zhuǎn)化為順，順-粘康酸，初步打通了從來(lái)源于可再生資源的葡萄糖到順，順-粘康酸的生化合成通道(FrostJW, Draths KM.Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources.USPatent 5487987，1996 ;Niu W,Draths KM,Frost JW.Benzene-free synthesis of adipicacid.Biotech Prog.2002 18:201-212.)。發(fā)酵液中的順，順-粘康酸可以以鉬為催化劑、在低壓室溫下化學(xué)氫化轉(zhuǎn)化為己二酸，該步轉(zhuǎn)化率在95%以上(Niu W，Draths KM，F(xiàn)rostJW.Benzene-free synthesis of adipic acid.Biotech Prog.2002 18:201-212 ;ThomasJM,Raja R，Johnson BF,Or Connell TJ,Sankar GiKhimyak T.Bimetallic nanocatalystsfor the conversion of muconic acid to adipic acid.Chem Commun(Camb).2003(10):1126-7.)。然而John Frost等人開(kāi)發(fā)己二酸生物合成途徑需要添加昂貴的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)來(lái)進(jìn)行順，順-粘康酸生產(chǎn)。IPTG的使用會(huì)從而增加過(guò)程費(fèi)用，限制將來(lái)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006]對(duì)于己二酸等大宗化學(xué)品而言，由于價(jià)值相對(duì)不高，提高合成和生產(chǎn)效率是影響其生產(chǎn)成本降低、產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)的根本前提。由于順，順-粘康酸到己二酸的轉(zhuǎn)化過(guò)程非常容易實(shí)現(xiàn)，而且轉(zhuǎn)化效率高、成本較低。因此要通過(guò)順，順-粘康酸實(shí)現(xiàn)的己二酸生產(chǎn)，關(guān)鍵是怎樣有效提高葡萄糖到順，順-粘康酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率。根據(jù)合成途徑的碳流量分析表明，I摩爾葡萄糖在理論上可以生產(chǎn)出0.75摩爾的順，順-粘康酸，即理論糖酸轉(zhuǎn)化率為0.60g/g。目前報(bào)道最高轉(zhuǎn)化率只有理論轉(zhuǎn)化率的33 %，其他原料葡萄糖由于異源合成途徑的代謝不平衡、乙酸等副產(chǎn)物積累、能量代謝以及分支途徑的分流等原因而被損失浪費(fèi)掉了。所以必須消除這些碳硫(carbon flow)的損失,引導(dǎo)更多的碳硫流向目標(biāo)產(chǎn)物合成的方向,提高產(chǎn)物的產(chǎn)率(轉(zhuǎn)化率)。另外，在細(xì)胞內(nèi)代謝途徑往往不是獨(dú)立的，而是存在于復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)中，受到各種各樣的調(diào)控，影響著目標(biāo)產(chǎn)物的過(guò)量積累。為了使細(xì)胞工廠能夠定向、高效地積累人們所需要的目標(biāo)生物產(chǎn)品和生物過(guò)程，就必須去干擾、改變或修飾細(xì)胞原有的調(diào)控體系，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。針對(duì)以上問(wèn)題，為了提高己二酸及其前體化合物的(生物)合成能力和效率，必須從代謝調(diào)控與細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題出發(fā)，深入發(fā)掘和研究各種重要影響因素，通過(guò)優(yōu)化改造提高目標(biāo)產(chǎn)品的生產(chǎn)效率。
[0007]己二酸及其前體物的生物制造將具有污染少、產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，極具發(fā)展前景。但是高效、經(jīng)濟(jì)性地實(shí)現(xiàn)己二酸及其前體物的生物制造，仍然有一系列的關(guān)鍵技術(shù)，其中高性能生產(chǎn)菌株的選育改造是實(shí)現(xiàn)己二酸及其前體物生物制造的核心，其他包括發(fā)酵工藝的優(yōu)化和產(chǎn)物的綠色分離純化等也需要進(jìn)一步的研究和開(kāi)發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一株能夠生產(chǎn)己二酸前體物順，順-粘康酸的大腸埃希氏菌和發(fā)酵法生產(chǎn)順，順-粘康酸的方法及應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明所提供的順,順-粘康酸生產(chǎn)酵母菌為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)TIB-LEc340已于2012年8月16日藏保于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng) CGMCC)，保藏號(hào)為 CGMCC No 6435。
[0010]利用組合代謝工程策略引入由來(lái)自不同微生物的3-脫氫莽草酸脫水酶，原兒茶酸脫羧酶和兒茶酚I，2-雙氧化酶組成的異源代謝途徑催化芳香族氨基酸合成途徑的中間產(chǎn)物3-脫氫莽草酸經(jīng)原兒茶酸、兒茶酚轉(zhuǎn)化為順，順-粘康酸，把合成途徑轉(zhuǎn)入莽草酸脫氫酶(AroE)突變、芳香族氨基酸合成途徑阻斷的大腸埃希氏菌AB2834 (Escherichia coliAB2834)中，構(gòu)建了能從葡萄糖生產(chǎn)順，順-粘康酸大腸埃希氏菌。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)目的提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)己二酸前體物-順，順-粘康酸的方法。
[0012]本發(fā)明所提供的生產(chǎn)順,順-粘康酸的方法,是發(fā)酵大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB-LEc340 CGMCC No 6435 得到順，順-粘康酸。
[0013]利用大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 生產(chǎn)順，順-粘康酸的培養(yǎng)基，包括碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽。所述碳源可為質(zhì)量百分含量1-20%的葡萄糖和/或蔗糖和/或淀粉和/或糖蜜和/或生物質(zhì)水解糖液；所述氮源可為質(zhì)量百分含量為0.1% -3%的玉米漿和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆柏和/或豆餅粉和/或花生柏和/或銨鹽和/或硝酸鹽和/或尿素；所述無(wú)機(jī)鹽包括質(zhì)量百分含量^ 0.1% -0.8% Na2HPO4,0.05-0.5% KH2PO4,0.01% -0.1% NaCl, 0.005% -0.1 % MgSO4 和
0.005-0.05% CaCl20為了提高順，順-粘康酸的產(chǎn)量，所述培養(yǎng)基中還含有質(zhì)量百分含量為0.001-0.008%的莽草酸。
[0014]本發(fā)明的發(fā)酵大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 在30°C _40°C發(fā)酵16小時(shí)-120小時(shí)，得到的發(fā)酵液中順，順-粘康酸粘康酸的含量最高可達(dá)52g/L，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0015]具體實(shí)施
[0016]以下為列舉的實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明。
[0017]實(shí)施例1 3-脫氫莽草酸脫水酶基因，原兒茶酸脫羧酶基因和兒茶酚1，2_雙氧化酶基因的優(yōu)化設(shè)計(jì)合成
[0018]分別根據(jù)Klebsiella pneumoniae A170-40的3_脫氫莽草酸脫水酶基因aroZ、原兒茶酸脫羧酶基因aroY和Acinetobacter calcoaceticus的兒茶酌.1，2_雙氧化酶基因catA的序列，通過(guò)密碼子優(yōu)化獲得適合大腸埃希氏菌密碼子偏好性的新基因aroZ-jCat，aroY-jCat和catA-jCat (附圖1-3)，然后利用DNA化學(xué)合成的方法獲得這些設(shè)計(jì)優(yōu)化的基因，可用于異源合成途徑的創(chuàng)建。
[0019]實(shí)施例2 3-脫氫莽草酸脫水酶，原兒茶酸脫羧酶和兒茶酚1，2-雙氧化酶組成的異源表達(dá)模塊組裝
[0020]通過(guò)合適的限制性?xún)?nèi)切酶，把人工設(shè)計(jì)合成的組成型啟動(dòng)子P3 (TCTAGAATATGTTATCTCTGGCGGTGTTGACATTTCCGTTTTTTCATGATATAATCGCTCCTGAGCGGATAACAATTTCAAGGAGGACAGCTCCATCAT)、上述設(shè)計(jì)合成的新基因aroZ-jCat, aroY-jCat和catA-jCat以及人工設(shè)計(jì)合成的終止子 T1(CCGGCTTATCGGTCAGTTTCACCTGAITTACGTAAAAACCCGCTTCGGCGGGITITTGCTITTGGAGGGGCAGAAAGATGAATGACTGTCCACGACGCTATACCCAAAAGAAA)連接起來(lái)組成的異源表達(dá)模塊CCMA。P3，aroZ-jCat，aroY-jCat，catA-jCat 和 Tl 之間的限制性?xún)?nèi)切酶分別是 Ndel，SacI，NheI，XhoI。另外分別在aroY-jCat和catA-jCat基因的起始密碼子ATG前加入RBS結(jié)合區(qū)(AAGAAGGAGATATAGTA)。CCMA模塊的示意圖和序列分別見(jiàn)附圖4和5。
[0021]實(shí)施例3 大腸埃希氏菌(Escherichia coli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 的構(gòu)建
[0022]將上述構(gòu)建3-脫氫莽草酸脫水酶，原兒茶酸脫羧酶和兒茶酚1，2_雙氧化酶異源表達(dá)模塊CCMA的DNA序列兩端分別加上ClaI和SalI限制性酶切位點(diǎn)，然后把該DNA片段插入質(zhì)粒PACYC184的相應(yīng)位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pACYC-CCMA(附圖6)。然后把重組質(zhì)粒pACYC-CCMA轉(zhuǎn)入莽草酸脫氫酶(AroE)突變的大腸埃希氏菌AB2834(Escherichia coliAB2834)中，獲得目標(biāo)菌種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)TIB-LEc340 CGMCC No 6435。
[0023]實(shí)施例4 大腸埃希氏菌(Escherichia coli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)順，順-粘康酸
[0024]大腸埃希氏菌( Escherichiacoli) TIB_LEc340 CGMCC No 6435 接種裝有 25mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為7.0，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖2%，NH4Cl 0.5%,NaCl 0.1%,Na2HPO4 0.3%,KH2PO4 0.1%,MgSO4.7Η20 0.05%,CaCl 0.01%,莽草酸0.004%。在37°C、220r/min的搖床發(fā)酵24小時(shí)后，離心分離菌體，按常規(guī)方法測(cè)定上清液中含有順，順-粘康酸為1.5g/l。
[0025]實(shí)施例5 大腸埃希氏菌(Escherichia coli) TIB-LEc340 CGMCC No 6435 的 5L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)順，順-粘康酸
[0026]大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 接種裝有 500mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為7.0，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖2%，蛋白胨l%，NaCl 0.5%，在37°C、220r/min的搖床培養(yǎng)16小時(shí)后，把500mL培養(yǎng)液接種有5000mL發(fā)酵培養(yǎng)基7.5L發(fā)酵罐(NBS BioFlo?115)中，該培養(yǎng)基含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖 15%，NH4Cl 1.5%, NaCl 0.5%, Na2HPO4 0.3%, KH2PO4 0.1%, MgSO4.7H20
0.05%, CaCl 0.01%，莽草酸0.006%。，通過(guò)5M的NaOH實(shí)時(shí)控制pH為7左右。在35°C，通氣量為1:1的條件下發(fā)酵84小時(shí)后，離心分離菌體，按常規(guī)方法測(cè)定上清液中含有丙酮酸為52g/l。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]附圖1:根據(jù)Klebsiella pneumoniae A170-40的3_脫氫莽草酸脫水酶基因密碼子優(yōu)化的新基因aroZ-jCat序列
[0028]附圖2:根據(jù)Klebsiella pneumoniae A170-40的原兒茶酸脫羧酶基因密碼子優(yōu)化的新基因aroY-jCat序列
[0029]附圖3:根據(jù)Acinetobacter calcoaceticus的兒茶酌.I, 2_雙氧化酶基因密碼子優(yōu)化的新基因catA-jCat序列
[0030]附圖4:3_脫氫莽草酸脫水酶，原兒茶酸脫羧酶和兒茶酚1，2-雙氧化酶組成的異源表達(dá)模塊CCMA示意圖
[0031]附圖5:3_脫氫莽草酸脫水酶，原兒茶酸脫羧酶和兒茶酚1，2-雙氧化酶組成的異源表達(dá)模塊CCMA序列
[0032]附圖6:重組質(zhì)粒pAC`YC-CCMA圖譜
【權(quán)利要求】
1.一株能夠發(fā)酵生產(chǎn)順，順-粘康酸的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)TIB_LEc340CGMCC No 6435。
2.根據(jù)權(quán)利I要求，菌的含有經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的附圖3-脫氫莽草酸脫水酶基因aroZ-jCat，原兒茶酸脫羧酶基因aroY-jCat和兒茶酚1，2_雙氧化酶基因catA-jCat及人工設(shè)計(jì)的組成型啟動(dòng)子P3和終止子Tl。
3.根據(jù)權(quán)利I要求，菌的生長(zhǎng)及發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和莽草酸，pH6.5-7.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述，其特征在于:所述碳源為質(zhì)量百分含量為1%-20%的葡萄糖和/或蔗糖和/或淀粉和/或糖蜜和/或生物質(zhì)水解糖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述，其特征在于:所述氮源為質(zhì)量百分含量為0.1% -3%的玉米漿和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆柏和/或豆餅粉和/或花生柏和/或銨鹽和/或硝酸鹽和/或尿素。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述，其特征在于:所述無(wú)機(jī)鹽包括質(zhì)量百分含量為0.1% -0.8%的 Na2HPO4 和 / 或 0.05-0.5 % 的 KH2PO4 和 / 或 0.01 % -0.1 % 的 NaCl 和 / 或 0.005 % -0.1%的 MgSO4 和 / 或 0.005-0.05% 的 CaCl2。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述，其特征在于:所述莽草酸添加的范圍是質(zhì)量百分含量0.001% -0.008%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7所述,其特征在于:大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB-LEc340 CGMCC No 6435 的生長(zhǎng)和發(fā)酵溫度為 30_40°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述,其特征在于:大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)TIB-LEc340 CGMCC No 6435 的發(fā)酵時(shí)間為 16 小時(shí)-120 小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株在順，順-粘康酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求2、3、4、5、6、7、8或9所述的配方和方法在大腸埃希氏菌(Escherichia coli)TIB_LEc340 CGMCC No 6435 順，順-粘康酸的生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK103667166SQ201210362308
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月21日
【發(fā)明者】王欽宏, 吳元慶, 陳五九, 張媛媛, 彭彥峰, 元飛, 馬延和 申請(qǐng)人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所