專利名稱：一種能穩(wěn)定保存的人NT-proBNP制劑及其制備方法
一種能穩(wěn)定保存的人NT-proBNP制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能穩(wěn)定保存的人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ制劑及其制備方法，以及能高產(chǎn)量重組表達(dá)人NT-proBNP的方法，屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
利鈉肽(NP)家族現(xiàn)在越來越受到重視，大多數(shù)人類利鈉肽家族是由心臟分泌的，并起到控制水鹽平衡、維持壓力調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)等作用。心血管利鈉肽內(nèi)分泌組分包括ANP、BNP、CNP、DNP和VNP。盡管分型各不相同，但是大多數(shù)種類的利鈉肽在相同種屬間的進(jìn)化是相當(dāng)保守的。在種屬內(nèi)存在差異的(哺乳動(dòng)物)只有BNP及其氨基末端前體BNP (NT-proBNP)0B型利鈉肽除了具有利鈉肽共有的那些功能外，還可能具有抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、抗心肌纖維化、強(qiáng)松弛性等作用。BNP主要在心臟表達(dá)，尤以心房表達(dá)更加豐富。另外，BNP的釋放受到壓力和容量?jī)煞N因素調(diào)節(jié)，進(jìn)而能預(yù)示出心室容積擴(kuò)大、左室舒張末期壓增大，心室超負(fù)荷以及心臟損傷程度等一系列心血管異常情況。NT-proBNP是在BNP前體(proBNP)形成BNP過程中產(chǎn)生的一種無生物活性的蛋白，在代謝過程中，產(chǎn)生的BNP與NT-proBNP含量相同，所以NT-proBNP與BNP同樣可以作為一種心臟標(biāo)志物。但是NT-proBNP缺乏主動(dòng)清除機(jī)制，NT-proBNP在體液中的半衰期要長(zhǎng)，濃度更大，更容易檢測(cè)，并且檢測(cè)樣本更容易獲得，因此其已經(jīng)成為一種主要的心臟檢測(cè)指標(biāo)。2011年9月29日，世界心臟聯(lián)盟在第12個(gè)“世界心臟日”上提到心血管病是威脅人類健康的“第一殺手”，每年全球有1710萬人死于心血管疾病，約占全球死亡人數(shù)的1/3。2010年中國(guó)心血管病報(bào)告指出，我國(guó)人群心血管病(心臟病、腦卒中)的發(fā)病和死亡率呈持續(xù)上升階段。估計(jì)全國(guó)心血管病2. 3億人，全年死于心血管病300萬人，占總死亡原因的41%，居各種死因的首位。大多數(shù)的心血管病都是可以通過減少誘因，早期診斷等手段進(jìn)行預(yù)防的。1991年DzauV等提出的心血管病時(shí)間鏈，自此，人們開始認(rèn)識(shí)到心血管病不是一種獨(dú)立的突然發(fā)生的病癥，而是許多相互聯(lián)系的因素不斷發(fā)展的過程。心力衰竭處于心血管事件鏈的末期，早期診斷對(duì)于心衰來說，尤為重要。目前心衰常用的診斷方法主要有幾種，但是都有各自的局限性。癥狀判斷如呼吸困難、水鈉潴留等在診斷時(shí)不能特異性診斷。輔助檢查如心電圖、胸片、肺功能等缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的判斷標(biāo)準(zhǔn)，因此對(duì)結(jié)果的闡述具有主觀性。實(shí)驗(yàn)室檢查如血小板計(jì)數(shù)，甘油三酯等，雖然客觀但不便于檢測(cè)心衰的預(yù)后和治療。影像學(xué)檢查如心臟超聲是心衰診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但不同中心檢查的結(jié)果沒有可比性，而且價(jià)格高不便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及常規(guī)檢查。自2006年11月12-15日在伊利諾伊州芝加哥舉辦的美國(guó)心臟協(xié)會(huì)科學(xué)會(huì)議上許多新生物標(biāo)記檢測(cè)帶頭人進(jìn)行講座并闡述了 NT-proBNP的臨床意義后，NT-proBNP檢測(cè)在世界范圍內(nèi)推廣起來，許多醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室被要求進(jìn)行NT-proBNP的檢測(cè)。NT-proBNP免疫檢測(cè)的問世，解決了以上診斷方法的很多問題。ΝΤ-ρι·οΒΝΡ檢測(cè)客觀、能夠?qū)崿F(xiàn)定量、重復(fù)性好、特異性高、敏感快速，所以該診斷檢測(cè)自問世以來，被譽(yù)為“劃時(shí)代的心衰標(biāo)志物”。NT-proBNP不僅可以用于心衰治療，目前許多文獻(xiàn)報(bào)道NT-proBNP可以用于心肌損傷、血栓、炎癥、血脂狀態(tài)、2型糖尿病等其他疾病診斷，未來具有良好的應(yīng)用前景。2000年11月22日，美國(guó)FDA首次批準(zhǔn)了 Biosite Diagnostics公司的BNP輔助診斷試劑盒。2002年11月19日，首個(gè)NT-proBNP免疫檢測(cè)試劑盒由羅氏診斷公司制造并上市。雖然NT-proBNP檢測(cè)已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但是目前并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)品。NT-proBNP標(biāo)準(zhǔn)品是目前國(guó)內(nèi)診斷市場(chǎng)亟待解決的一個(gè)問題。由于NT-proBNP目前已經(jīng)作為生化檢驗(yàn)中重要的一種檢測(cè)指標(biāo)，因此NT-proBNP標(biāo)準(zhǔn)品目前在臨床應(yīng)用廣泛，ΝΤ-ρι·οΒΝΡ標(biāo)準(zhǔn)品的用量非常大，目前常用的表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)、真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。然而，真核表達(dá)系統(tǒng)投資巨大，表達(dá)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)條件要求高。并且ΝΤ-ρι·οΒΝΡ氨基酸結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，并沒有復(fù)雜的翻譯后加工過程，所以選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是經(jīng)濟(jì)實(shí)用，表達(dá)產(chǎn)率高，純化工藝簡(jiǎn)單的一種生產(chǎn) 策略。目前，市面上的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ標(biāo)準(zhǔn)品大多是采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后再純化的產(chǎn)品。因其需求量大，因此需要能高產(chǎn)量重組表達(dá)NT-proBNP的方法。NT-proBNP標(biāo)準(zhǔn)品的瓶頸在于其穩(wěn)定性，要做到一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品要求NT-proBNP要穩(wěn)定兩年以上，而天然的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ具有73個(gè)氨基酸，分子量小，易降解，半衰期僅為24小時(shí)。隨著生物技術(shù)在診斷領(lǐng)域的發(fā)展，引進(jìn)了許多新的多肽獲得方法。本發(fā)明則利用了基因工程的方法表達(dá)NT-proBNP，并在前期基因設(shè)計(jì)綜合考慮NT-proBNP的結(jié)構(gòu)特性，得到了重組的NT-proBNP多肽。重組NT-proBNP與天然的NT-proBNP具有相同的氨基酸，并且具有相同的免疫原性。本發(fā)明獲得的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ與之前國(guó)內(nèi)授權(quán)的專利(一種用作ΝΤ-ρι·οΒΝΡ免疫診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品的重組蛋白及制備方法與應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)?00810069299. 0)及與易維京等報(bào)道的《人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ的高效原核表達(dá)及免疫學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的研究》(第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)第30卷第6期)相比，本發(fā)明制備的NT-ProBNP，為完全天然構(gòu)象的重組人NT-ProBNP，而易維京等制備的重組NT-ProBNP是非天然的83個(gè)氨基酸構(gòu)象的NT-proBNP，其中存在的多余氨基酸可能會(huì)影響蛋白的構(gòu)象、免疫原性及蛋白的生化物理性質(zhì)等。因此提供能高產(chǎn)量重組表達(dá)人NT-proBNP的方法和穩(wěn)定的人NT-proBNP制劑具有廣泛的社會(huì)需求。本發(fā)明在采用大腸桿菌表達(dá)天然構(gòu)象的重組人NT-PioBNP時(shí)，首先對(duì)重組表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，例如選擇了大腸桿菌偏好的密碼子，對(duì)大腸桿菌的培養(yǎng)條件，例如培養(yǎng)過程中所采用的碳源、氮源、無機(jī)鹽和手菌時(shí)間等進(jìn)行了篩選和優(yōu)化。采用經(jīng)過篩選優(yōu)化的條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)每升菌可以收獲60g菌體，最終可獲得50-60mg目的蛋白。與目前文獻(xiàn)報(bào)道相比,本發(fā)明的重組表達(dá)方法大大提高了 NT-proBNP的產(chǎn)量。在將NT-proBNP純化后，為了保持NT-proBNP的穩(wěn)定性，防止NT-proBNP降解，本發(fā)明對(duì)保存NT-proBNP蛋白的條件進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，篩選發(fā)現(xiàn)含0. 1%BSA, 20%甘油和10%甘露醇的PH7. 4的PBS緩沖液能夠穩(wěn)定保護(hù)ΝΤ-ρι·οΒΝΡ，防止其發(fā)生降解。目的蛋白保存在穩(wěn)定保護(hù)劑中，分別在三種不同溫度下，采用羅氏公司的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ檢測(cè)試劑盒監(jiān)測(cè)其活性，加入保存緩沖液的NT-proBNP生物活性100天下降了 12. 7%，儲(chǔ)存在_20°C和_80°C，在100天內(nèi)，生物活性沒有降解，仍然維持在原水平。

發(fā)明內(nèi)容
[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的在于提供一種能穩(wěn)定保存的人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ制劑及其制備方法，以及能高產(chǎn)量重組表達(dá)人NT-proBNP的方法。[技術(shù)方案]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種能穩(wěn)定保存的人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ制劑，其特征在于，其中的NT-proBNP保存在含O. 1%BSA, 20%甘油和10%甘露醇的PH7. 4的PBS緩沖液中，NT-proBNP的氨基酸序列如SEQ No. I。在本發(fā)明中，表示濃度的“％”如無特殊說明，均指質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)，例如“含O. 1%BSA, 20%甘油和10%甘露醇的PH7. 4的PBS緩沖液”是指“PH7. 4的總量為IOOml的PBS緩沖液中含有O. Ig BSA、20g甘油和IOg甘露醇”。
本發(fā)明的另一目的是提供制備能穩(wěn)定保存的人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ制劑的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟在大腸桿菌中重組表達(dá)人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ，分離和純化得到人NT-proBNP后，將人NT-proBNP加入到含0. 1%BSA, 20%甘油和10%甘露醇的PH7. 4的PBS緩沖液中，制備得到能穩(wěn)定保存的人NT-proBNP制劑，在表達(dá)人NT-proBNP時(shí)，采用大腸桿菌偏好的密碼子，其中編碼人NT-proBNP的核苷酸序列如SEQ No. 2。在表達(dá)人NT-proBNP時(shí)，培養(yǎng)大腸桿菌采用的碳源是1%甘油，氮源是0. 5%酵母粉，0. 5%蛋白胨和1%NH4C1，無機(jī)鹽添加物為5mM硫酸鎂，收菌時(shí)間為4小時(shí)。本發(fā)明的NT-proBNP穩(wěn)定制劑的制備保存方法，可以獲得穩(wěn)定的NT-proBNP重組蛋白。其與天然ΝΤ-ρι·οΒΝΡ具有相同的氨基酸序列并具有生物學(xué)活性，可以用現(xiàn)有的診斷試劑盒檢測(cè)，重組蛋白可用作NT-proBNP檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中表達(dá)序列的優(yōu)化是指按照大腸桿菌密碼子偏好性對(duì)人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化；其中表達(dá)載體是指pET32a載體，并保留pET32a載體中自帶的組氨酸標(biāo)簽、硫氧還蛋白和腸激酶切位點(diǎn)部分，故菌體表達(dá)的融合蛋白為Trx-NT-pix)BNP ;其中表達(dá)方式是指高效融合蛋白可溶表達(dá)；其中表達(dá)菌種是指大腸桿菌BL21 (DE3)宿主菌。根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選方案，其中純化方法是指通過鎳柱親和層析(HisTrap FF)可將融合蛋白純化出來。融合蛋白通過超濾濃縮更換酶切緩沖液,帶標(biāo)簽的腸激酶在常溫酶切16小時(shí)，可完全切開。酶切結(jié)束后立即加入緩沖液A和IOmM咪唑，在此環(huán)境下，過鎳柱親和層析，流下來的組分即為ΝΤ-ρι·οΒΝΡ。通過超濾濃縮，濃縮ΝΤ-ρι·οΒΝΡ后保存在ΡΗ6-8的保存緩沖液B中。其中緩沖液A系統(tǒng)指的是在tris、磷酸鹽及醋酸鹽緩沖液中，最終確定采用醋酸鹽緩沖系統(tǒng)(PH7. 4)。根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選方案，其中保存緩沖液B是指在多種穩(wěn)定保護(hù)劑中篩選得到的能夠使ΝΤ-ρι·οΒΝΡ保持穩(wěn)定而不發(fā)生降解的配方。經(jīng)過篩選確定的穩(wěn)定保護(hù)劑配方為以質(zhì)量體積比計(jì)含0. 1%BSA, 20%甘油和10%甘露醇的PBS緩沖液(PH7. 4)。未添加保護(hù)劑的重組NT-proBNP儲(chǔ)存在4°C半衰期為4天，加入保存緩沖液B的NT-proBNP生物活性100天下降了 12. 7%，儲(chǔ)存在-20°C和_80°C，在100天內(nèi)，生物活性沒有降解，仍然維持在原水平。這也充分表明本發(fā)明中的重組ΝΤ-ρι·οΒΝΡ制劑能夠作為免疫診斷試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品使用的廣泛應(yīng)用前景。本發(fā)明的另一目的是提供一種在大腸桿菌中重組表達(dá)制備人NT-proBNP蛋白的方法，其特征在于，在表達(dá)人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ時(shí)，采用大腸桿菌偏好的密碼子，使用的編碼人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ的核苷酸序列如SEQ No. 2。培養(yǎng)大腸桿菌培養(yǎng)大腸桿菌采用的碳源是1%甘油，氮源是O. 5%酵母粉，O. 5%蛋白胨，1%NH4C1，無機(jī)鹽添加物為5mM硫酸鎂，收菌時(shí)間為6小時(shí)。本發(fā)明的NT-proBNP重組蛋白與天然NT-proBNP具有相同的氨基端序列，編碼ΝΤ-ρι·οΒΝΡ重組蛋白的核苷酸序列是采用大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。依據(jù)這一發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種ΝΤ-ρι·οΒΝΡ重組蛋白的發(fā)酵工藝研究方法及發(fā)酵工藝，主要包含以下步驟菌種生長(zhǎng)曲線的確定，選擇生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，獲得最佳接種時(shí)間；蔗糖、葡萄糖、甘油三種常用碳源在三個(gè)水平上進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化，確定發(fā)酵碳源；·
有機(jī)氮源酵母粉、蛋白胨與無機(jī)氮源氯化銨不同比例組合優(yōu)化表達(dá)，確定發(fā)酵氮源；硫酸鎂、磷酸鹽兩種常用無機(jī)鹽表達(dá)優(yōu)化，確定發(fā)酵無機(jī)鹽成分；將菌種接種至優(yōu)化好的培養(yǎng)基中，做出生長(zhǎng)曲線，確定發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間；選擇不同濃度的IPTG表達(dá)優(yōu)化，確定誘導(dǎo)劑濃度；誘導(dǎo)不同時(shí)間表達(dá)優(yōu)化，確定誘導(dǎo)時(shí)間；在不同溫度下誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化，確定誘導(dǎo)溫度；NT-proBNP 發(fā)酵工藝；NT-proBNP重組蛋白表達(dá)量的鑒定。上述發(fā)酵工藝研究方法中，在2YT基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，先確定菌種生長(zhǎng)曲線，分別對(duì)碳源、氮源、無機(jī)鹽、發(fā)酵時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化進(jìn)而確定NT-proBNP發(fā)酵工藝。所述的2YT基礎(chǔ)培養(yǎng)基是現(xiàn)有產(chǎn)品，例如常州普洛立德生物科技有限公司銷售的2YT培養(yǎng)基產(chǎn)品。上述發(fā)酵工藝中，主要包括以下步驟①NT-proBNP菌種以0. 1%接種量接種至2YT培養(yǎng)基中，37°C，200rpm過夜培養(yǎng)作為種子；②接種至以質(zhì)量體積比計(jì)含1%甘油、I. 5%酵母粉、0. 5%蛋白胨，1%氯化銨、0. 5%氯化鈉、5mM硫酸鎂、50ug/ml氨芐的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在37°C、PH6. 7-7. I菌體生長(zhǎng)階段通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓和通氣量控制溶氧不低于30%，使菌體密度達(dá)到30左右時(shí)開始降溫；③在發(fā)酵過程中，補(bǔ)料大約為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1/3，補(bǔ)料培養(yǎng)基成分為15%酵母粉、15%甘油、0. 3%氯化銨、5mM硫50ug/ml酸酸鎂；補(bǔ)料速度在菌體生長(zhǎng)階段分兩個(gè)階段補(bǔ)，生長(zhǎng)Ih復(fù)蘇后慢速補(bǔ)料補(bǔ)1/3，生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期快速補(bǔ)料1/2，誘導(dǎo)時(shí)期慢速補(bǔ)料1/6 ；④待溫度降至30°C，加入終濃度0. 2mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4_6h后，放罐離心收集菌體。上述重組蛋白表達(dá)量鑒定中，主要利用菌體收集后，超聲破菌提出總蛋白，通過SDS-PAGE電泳跑出電泳圖，再通過IMAGE軟件進(jìn)行圖片灰度分析，得到重組蛋白的表達(dá)量。[有益效果]
本發(fā)明得到的NT-proBNP制劑中的重組人NT-ProBNP具有天然構(gòu)象，活性高，在穩(wěn)定保護(hù)制劑中穩(wěn)定性強(qiáng)，有利于其作為免疫診斷標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用。而且，本發(fā)明所采用的重組表達(dá)方法的表達(dá)產(chǎn)量高，為大量獲得重組人NT-PioBNP提供了有力保障。穩(wěn)定抗原的獲得為下一步制備特異性抗體提供了可能，也為組裝一個(gè)新的NT-proBNP免疫診斷試劑盒提供了一個(gè)廣闊的前景。

圖I :轉(zhuǎn)化后的BL21 (DE3)表達(dá)菌株中提取的質(zhì)粒的酶切圖譜；圖2 :采用不同碳源培養(yǎng)大腸桿菌后，收獲的總蛋白的電泳圖譜；圖3 :采用不同氮源培養(yǎng)大腸桿菌后，收獲的總蛋白的電泳圖譜；圖4:采用不同無機(jī)鹽培養(yǎng)大腸桿菌后，收獲的總蛋白的電泳圖譜；
圖5 :培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，采用不同的培養(yǎng)時(shí)間，收獲的總蛋白的電泳圖譜；圖6 :重組表達(dá)人NT-proBNP蛋白時(shí)，不同菌體部分的電泳圖譜；圖7 :純化人NT-proBNP蛋白時(shí)，收集的多個(gè)不同階段的組分的電泳圖譜；圖8 :第一次鎳柱純化后的人NT-proBNP蛋白在多個(gè)不同酶切條件下的酶切圖譜；圖9 :第二次鎳柱純化后，得到的純的NT-proBNP的電泳圖譜。圖10 :包含穩(wěn)定保護(hù)劑的NT-proBNP制劑在不同條件下的活性變化。圖中橫坐標(biāo)軸表示檢測(cè)的天數(shù)，縱坐標(biāo)表示測(cè)出的樣品中NT-proBNP的含量。圖11 :不同純化方案表達(dá)目的蛋白后的活性比較。
具體實(shí)施方式實(shí)施例一目的基因的合成及克隆、轉(zhuǎn)化、雙酶切鑒定優(yōu)化好的如上所述的編碼人NT-proBNP的核苷酸序列由上基因海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，在合成得到核苷酸序列后將序列克隆至pET32a載體中。轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)表達(dá)菌株將感受態(tài)自-80°C冰箱中取出，放置于冰上解凍。解凍后加入I μ g合成好的質(zhì)粒，冰浴30min，42°C熱擊60_90s，冰上放置2min(此過程不要移動(dòng))，加入900ul LB培養(yǎng)基，37°C 160rpm搖45min后，取出100 μ I涂布于氨芐抗性的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)過夜，待長(zhǎng)出單克隆菌落后，調(diào)取單克隆培養(yǎng)，保存菌種。雙酶切鑒定接種部分菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),收獲菌體并從菌體中提取質(zhì)粒。將提取出來的質(zhì)粒用Nco I和EcoR I雙酶切進(jìn)行鑒定，應(yīng)該在300bp和5000bp左右時(shí)分別出現(xiàn)兩個(gè)條帶。通過凝膠電泳顯示的結(jié)果與理論推斷結(jié)果相一致，表明優(yōu)化后的如上所述的編碼人NT-proBNP的核苷酸序列已經(jīng)成功插入pET32a載體中。結(jié)果如圖I所示。實(shí)施例二轉(zhuǎn)化了 NT-proBNP的BL21 (DE3)菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化菌種生長(zhǎng)曲線的確定分別按1%和0. 1%的甘油菌于LB培養(yǎng)基中，每隔一段時(shí)間測(cè)定0D_，分別做出生長(zhǎng)曲線，以確定合適的接種量。最終選用0. 1%作為最佳接種量，種子過夜振蕩培養(yǎng)。碳源的確定0. 1%的甘油菌接入LB培養(yǎng)基(AmplOO μ g/ml)，37°C，210rpm過夜震蕩培養(yǎng)。以1%的接種量分別接入15ml培養(yǎng)基中(在2YT培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別取蔗糖，葡萄糖，甘油三因素的兩個(gè)濃度O. 5%和1%，AmplOO μ g/ml，搖床震蕩培養(yǎng)37°C，220rpm。培養(yǎng)至0D600>0.8(約3-4h)，加入ImM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。4h后收集菌體測(cè)定收菌OD值。并破菌取總蛋白進(jìn)行電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，從左至右按照電泳圖順序用Bandscan軟件進(jìn)行表達(dá)量分析，有明顯表達(dá)條帶的泳道3、5、7、9、12、14表達(dá)量分別為74. 2%,70. 6%,72. 6%、74%、74. 4%, 72. 7%。圖2所示的電泳圖中上樣順序從左至右分別為marker、空白孔、2YT基礎(chǔ)培養(yǎng)基中未誘導(dǎo)、2YT基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加誘導(dǎo)劑、在基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加O. 5%葡萄糖時(shí)未誘導(dǎo)、添加O. 5%葡萄糖時(shí)加誘導(dǎo)劑、添加1%葡萄糖時(shí)未誘導(dǎo)、添加1%葡萄糖時(shí)加誘導(dǎo)劑、添加O. 5%蔗糖時(shí)未誘導(dǎo)、添加O. 5%蔗糖時(shí)加誘導(dǎo)劑、添加1%蔗糖時(shí)誘導(dǎo)、添加O. 5%甘油時(shí)未誘導(dǎo)、添加O. 5%甘油時(shí)加誘導(dǎo)劑、添加1%甘油時(shí)未誘導(dǎo)、添加1%甘油時(shí)加誘導(dǎo)劑。可以看出ΝΤ-ρι·οΒΝΡ在1%甘油作為發(fā)酵碳源時(shí)表達(dá)量最高，故最終確定以1%甘油作為發(fā)酵碳源。氮源的確定接種培養(yǎng)方式同2，培養(yǎng)基以1%甘油作為發(fā)酵碳源，其中所含有的氮源分別按照以下組分做組合:(1)0. 5%酵母粉，O. 5%蛋白胨，O. 5%NH4C1 ; (2 ) O. 5%酵母粉，1%蛋白胨，O. 5%NH4C1 ；(3) 1%酵母粉，O. 5%蛋白胨，O. 5%NH4C1 ； (4) 1%酵母粉，1%蛋白胨，·O. 5%NH4C1 ; (5) O. 5% 酵母粉，O. 5% 蛋白胨，1%NH4C1 ; (6) O. 5% 酵母粉，1% 蛋白胨，1%NH4C1 ；(7)1%酵母粉，O. 5%蛋白胨，1%NH4C1 ； (8)1%酵母粉，1%蛋白胨，1%NH4C1。電泳結(jié)果如圖3所示，從左至右按照電泳圖順序用Bandscan軟件進(jìn)行表達(dá)量分析，有明顯表達(dá)條帶的泳道2、4、6、8、10、12、13、14 表達(dá)量分別為 79. 1%、75· 8%,74. 5%,77%,79. 2%,76. 4%,75. 1%、74· 3%。圖3所示的電泳結(jié)果上樣順序從左至右分別為Marker、采用I號(hào)培養(yǎng)基時(shí)誘導(dǎo)前、采用I號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后、2號(hào)誘導(dǎo)前、2號(hào)誘導(dǎo)后、3號(hào)誘導(dǎo)前、3號(hào)誘導(dǎo)后、4號(hào)誘導(dǎo)前、4號(hào)誘導(dǎo)后、5號(hào)誘導(dǎo)前、5號(hào)誘導(dǎo)后、6號(hào)誘導(dǎo)前、6號(hào)誘導(dǎo)后、7號(hào)誘導(dǎo)后、8號(hào)誘導(dǎo)后?？梢钥闯龃_定(5) O. 5%酵母粉，O. 5%蛋白胨，1%NH4C1為氮源最佳。無機(jī)鹽的確定接種方式同2,培養(yǎng)基在通過碳源和氮源篩選已確定的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加入無機(jī)鹽，其中添加的無機(jī)鹽分別為硫酸鎂(MgSO4)和磷酸鹽(PB )，其中MgSO4終濃度為和5mM。PB (pH7. 2)的終濃度為10mM，30mM和50mM。電泳結(jié)果如圖4所示，從左至右按照電泳圖順序用Bandscan軟件進(jìn)行表達(dá)量分析，各泳道表達(dá)量分別為77. 6%, 45. 1%、81· 2%, 69. 2%, 79. 4%, 73. 8%。圖4A電泳圖上樣順序從左至右為Marker、含ImM MgSO4時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)物、含3mM MgSO4時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)物、含5mM MgSO4時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)物、含IOmM PB時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)物、含30mM PB時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)物。圖4B電泳圖上樣順序從左至右為Marker、含50mM PB時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)物?？梢钥闯鲎罱K確定5mM硫酸鎂作為無機(jī)鹽添加物最佳。培養(yǎng)條件優(yōu)化接種方式同2，采用通過上述篩選已確定的發(fā)酵培養(yǎng)基來進(jìn)行培養(yǎng)。測(cè)發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線，確定發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為6-8小時(shí)；設(shè)置IPTG誘導(dǎo)濃度為O. 2、O. 5、lmM，最終確定O. 2mM作為誘導(dǎo)濃度。時(shí)間設(shè)定為4、5、6小時(shí)，最終確定6小時(shí)作為收菌時(shí)間。結(jié)果如圖5所示，從左至右按照電泳圖順序用Bandscan軟件進(jìn)行表達(dá)量分析，各泳道表達(dá)量分別為 79. 6%,84. 3%,83. 5%,83. 1%、81· 9%,82. 8%,89. 8%,75. 1%、83· 7%。圖5所示的電泳結(jié)果上樣順序從左至右分別為Marker、0. 2mM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)、O. 2mM IPTG 誘導(dǎo) 5 小時(shí)、O. 2mM IPTG 誘導(dǎo) 6 小時(shí)、O. 5mM IPTG 誘導(dǎo) 4 小時(shí)、O. 5mM IPTG 誘導(dǎo)5小時(shí)、0.5mM IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)、ImM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)、ImM IPTG誘導(dǎo)5小時(shí)、ImM IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)。可以看出6小時(shí)作為收菌時(shí)間最佳。實(shí)施例三重組人NT-proBNP蛋白的表達(dá)和純化采用經(jīng)過實(shí)施例2篩選優(yōu)化后的培養(yǎng)條件來培養(yǎng)包含人NT-proBNP序列的載體pET32a轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌株BL21 (DE3)。在培養(yǎng)過程中以1%的接種量進(jìn)行接種，以1%甘油作為發(fā)酵碳源，氮源是O. 5%酵母粉，O. 5%蛋白胨，1%NH4C1，無機(jī)鹽添加物為5mM硫酸鎂，收菌時(shí)間為6小時(shí)。表達(dá)后的菌體高壓均質(zhì)破菌離心，電泳結(jié)果顯示，該菌株及載體組合實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的高效可溶表達(dá)，結(jié)果如圖6所示。電泳結(jié)果上樣順序從左至右依次為菌體破碎上清、菌體破碎沉淀、菌體總蛋白、Marker0取上清過鎳親和層析柱(HisTrap Fast Flow)，采用緩沖液A系統(tǒng)(10_20mMPBS、100-800mM Nacl、10_30mM咪唑，PH6-7. 4)作為平衡緩沖液，梯度洗脫16%，40%，100%線性洗 脫，目的重組蛋白在40%咪唑時(shí)被完全洗脫下來，結(jié)果如圖7。電泳結(jié)果上樣順序從左至右依次為500mM咪唑洗脫組分、200mM咪唑洗脫組分3、200mM咪唑洗脫組分2、200mM咪唑洗脫組分I、80mM咪唑洗脫組分、上樣過程中的穿透液、上
樣總蛋白。得到的融合蛋白通過超濾膜包換到酶切緩沖液中，按照比例加入腸激酶，酶切條件也是通過摸索得出，選擇3個(gè)溫度梯度，6個(gè)時(shí)間梯度摸索酶切條件，最終確定室溫酶切16小時(shí)。酶切結(jié)果如圖8所示，酶切結(jié)束后立即加入保存緩沖液B，并準(zhǔn)備上鎳柱。電泳結(jié)果上樣順序從左至右依次為Marker、酶切結(jié)果1、2、3。第二次鎳柱純化，與第一次所用緩沖液相同，采用10%、30%、80%、500%梯度洗脫，30%之前均能洗脫下目的蛋白，電泳結(jié)果如圖9所示，可以得到純的NT-proBNP。發(fā)酵表達(dá)，每升菌可以獲得60g菌體，每升菌體可獲得50-60mgNT-proBNP。超濾濃縮去除咪唑，將NT-proBNP保存在含0. 1%BSA, 20%甘油和10%甘露醇的PBS緩沖液(PH7. 4)中。該條件的選擇是在多次不同組合條件下選出的最有穩(wěn)定性保護(hù)作用的，采用Roche全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)ΝΤ-ρι·οΒΝΡ的生物活性，具體數(shù)據(jù)見下表，未添加保護(hù)劑的重組NT-proBNP儲(chǔ)存在4°C半衰期為4天，加入保護(hù)緩沖液B的NT-proBNP儲(chǔ)存在4°C生物活性100天下降了 12. 7%，儲(chǔ)存在-20°C和_80°C，100天內(nèi)，生物活性沒有變化，還是維持在原水平。此外，本申請(qǐng)還將帶標(biāo)簽蛋白、不帶標(biāo)簽蛋白進(jìn)行表達(dá)，以及加入保護(hù)劑和不加保護(hù)劑的穩(wěn)定性進(jìn)行了對(duì)比分析研究。圖11顯示了不同表達(dá)純化保存方案對(duì)ΝΤ-ρι·οΒΝΡ的穩(wěn)定性影響，其中方法I是直接表達(dá)ΝΤ-ρι·οΒΝΡ，不加保護(hù)劑，表達(dá)出來的蛋白很快就降解了 ；方法2是在連接標(biāo)簽蛋白的情況下表達(dá)NT-proBNP，表達(dá)出來的蛋白不加保護(hù)劑；方法3 :直接表達(dá)NT-proBNP，表達(dá)純化后加入保護(hù)劑之后的情況；方法4 :融合標(biāo)簽蛋白的情況下表達(dá)ΝΤ-ρι·οΒΝΡ，表達(dá)出來的蛋白加入保護(hù)劑之后的情況。
權(quán)利要求
1.一種能穩(wěn)定保存的人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ制劑，其特征在于，其中的ΝΤ-ρι·0ΒΝΡ保存在含O. 1-1%BSA, 20-50%甘油和5-20%甘露醇的PH7. 0-8. O的PBS緩沖液中，其中的NT-proBNP是與標(biāo)簽蛋白進(jìn)行融合表達(dá)后經(jīng)酶切去除標(biāo)簽蛋白后得到的純?chǔ)?ρι·οΒΝΡ，其氨基酸序列如 SEQ No. I。
2.權(quán)利要求I所述的能穩(wěn)定保存的人NT-proBNP制劑用于制備檢測(cè)NT-proBNP的標(biāo)準(zhǔn)品的用途。
3.權(quán)利要求I所述的能穩(wěn)定保存的人NT-proBNP制劑的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟在大腸桿菌中重組表達(dá)人NT-proBNP，其中NT-proBNP與標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)，經(jīng)分離、酶切和純化得到人NT-proBNP后，將人NT-proBNP加入到以質(zhì)量體積比計(jì)含O. 1-P/oBSA, 20-50%甘油和5-20%甘露醇的PH7. 0-8. O的PBS緩沖液中，制備得到能穩(wěn)定保存的人NT-proBNP制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的能穩(wěn)定保存的人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ制劑的制備方法，其特征在于在表達(dá)人NT-proBNP時(shí)，采用大腸桿菌偏好的密碼子，其中編碼人NT-proBNP的核苷酸序列如SEQ No. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的能穩(wěn)定保存的人NT-proBNP制劑的制備方法，其特征在于在表達(dá)人NT-proBNP時(shí)，培養(yǎng)大腸桿菌采用的碳源是以質(zhì)量體積比計(jì)1%甘油，氮源是以質(zhì)量體積比計(jì)0. 5%酵母粉，0. 5%蛋白胨和1%NH4C1，無機(jī)鹽添加物是5mM硫酸鎂，收菌時(shí)間為6小時(shí)。
6.一種在大腸桿菌中重組表達(dá)制備人NT-proBNP蛋白的方法,其特征在于在表達(dá)人NT-proBNP時(shí)，采用大腸桿菌偏好的密碼子，將NT-pix)BNP與標(biāo)簽蛋白一起融合表達(dá)，使用的編碼人NT-proBNP的核苷酸序列如SEQ No. 2。
7.根據(jù)權(quán)利要求7所述的在大腸桿菌中重組表達(dá)人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ蛋白的方法，其特征在于培養(yǎng)大腸桿菌采用的碳源是以質(zhì)量體積比計(jì)1%甘油，收菌時(shí)間為6小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的在大腸桿菌中重組表達(dá)人NT-proBNP蛋白的方法，其特征在于培養(yǎng)大腸桿菌采用的氮源是以質(zhì)量體積比計(jì)0. 5%酵母粉，0. 5%蛋白胨和1%NH4C1。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的在大腸桿菌中重組表達(dá)人NT-proBNP蛋白的方法，其特征在于培養(yǎng)大腸桿菌采用的無機(jī)鹽添加物為5mM硫酸鎂。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的在大腸桿菌中重組表達(dá)人NT-proBNP蛋白的方法，其特征在于培養(yǎng)大腸桿菌采用的碳源是以質(zhì)量體積比計(jì)1%甘油，氮源是0. 5%酵母粉，0. 5%蛋白胨，1%NH4C1，無機(jī)鹽添加物為5mM硫酸鎂，收菌時(shí)間為6小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能穩(wěn)定保存的人NT-proBNP制劑及其制備方法，以及能高產(chǎn)量重組表達(dá)人NT-proBNP的方法，具體涉及利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)制備重組人B型利鈉肽前體(NT-proBNP)，通過制備過程和條件的優(yōu)化，獲得了一個(gè)能高產(chǎn)量表達(dá)人NT-proBNP的制備工藝，通過加入穩(wěn)定保護(hù)劑獲得了能夠穩(wěn)定保存的人NT-proBNP制劑。本發(fā)明加入穩(wěn)定保護(hù)劑后制備的天然人NT-proBNP制劑能在-20℃和-80℃條件下穩(wěn)定存在，生物活性沒有降低。為NT-proBNP作為臨床診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品及抗體制備提供了穩(wěn)定的原料來源。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102879589SQ20121036456
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日 公開號(hào)201210364564.發(fā)明者許秀麗, 田亞平, 劉培, 郝慶欽 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院