專利名稱：一種用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及微流控芯片，特別提供了一種海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
微流控芯片實驗室作為本世紀一項重要的科學技術(shù)已經(jīng)在包括化學、生物學、醫(yī)學等多個領(lǐng)域展現(xiàn)了其獨特的優(yōu)勢。因其同細胞尺寸匹配、環(huán)境同生理環(huán)境相近、傳熱傳質(zhì)快、通量高可以集成等特點而成為新一代細胞研究的重要平臺，隨著近二十年的發(fā)展，基于微流控芯片系統(tǒng)的細胞研究已經(jīng)有所突破，相關(guān)細胞操作已基本都可在芯片上實現(xiàn)。海洋微藻作為較原始的單細胞生物是海洋的基礎(chǔ)生產(chǎn)者，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的能流和物質(zhì)流循環(huán)中起到至關(guān)重要的作用，并通過其光合作用和代謝過程從而與全球變暖、酸雨等全球性環(huán)境問題相偶聯(lián)。此外，由于其品系特征突出、地理分布廣發(fā)、易于培養(yǎng)等優(yōu)勢 而被廣泛應(yīng)用于細胞工程、毒理研究、藥物篩選等領(lǐng)域。目前，上述研究領(lǐng)域的常規(guī)實驗室研究方法基本是通過前期微藻培養(yǎng)和后期生理檢測相結(jié)合，工作量大，實驗過程繁瑣并且細胞和試劑消耗大。微流控芯片與微藻尺寸匹配，適于構(gòu)建微小的理化環(huán)境，因此將以微藻作為對象的高通量的、實時觀測研究變?yōu)榭赡堋ｋS著研究的不斷深入，微流控芯片系統(tǒng)或可成為微藻研究的重要平臺技術(shù)之一，為以微藻為研究對象的相關(guān)領(lǐng)域的如生物工程、生態(tài)毒理及環(huán)境污染評價等方面提供技術(shù)與理論的支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過微流控芯片的制作和芯片上多種單元技術(shù)的靈活組合，將微藻的分批培養(yǎng)、半連續(xù)恒化培養(yǎng)和種群增殖行為的實時在線觀測過程集成在一塊芯片上完成，從而構(gòu)建一種適于高通量、細胞及試劑消耗量低，操作簡便的微流控芯片系統(tǒng)，為以微藻為研究對象的相關(guān)領(lǐng)域的如生物工程、生態(tài)毒理及環(huán)境監(jiān)測等方面提供技術(shù)與理論的支持。本發(fā)明提供了一種用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，該芯片系統(tǒng)由兩個基本單元構(gòu)成，第一個基本單元為微流控芯片；第二個基本單元為微流控芯片外圍設(shè)備。其中海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究微流控芯片單元由采用聚二甲基硅氧烷材料軟刻蝕及不可逆封接技術(shù)構(gòu)建的多層微流控芯片，分為三部分第一部分為芯片下層，具有通過軟刻蝕技術(shù)產(chǎn)生液體流路通道；第二部分為芯片上層，具有微藻培養(yǎng)室、細胞接種入口、培養(yǎng)液入口和廢液出口 ；第三部分為中間層，包括五塊微孔膜，位于芯片上層與下層之間，分別對應(yīng)于微藻培養(yǎng)室位置處。本發(fā)明提供的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，所述微流控芯片使用的材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)。本發(fā)明提供的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，所訴芯片微藻培養(yǎng)室以微孔膜為基底，并通過微孔膜與芯片下層流路通道聯(lián)通；其中，所選微孔膜為聚碳酸酯膜，其特征在于生物粘附性低，以其作為培養(yǎng)室基底，可減少細胞貼壁現(xiàn)象，較好的維持細胞的懸浮狀態(tài)，省略微藻常規(guī)實驗室培養(yǎng)中的搖瓶步驟；所選微孔膜孔徑為I微米，要求小于所培養(yǎng)微藻直徑，以便在更換培養(yǎng)液時對微藻細胞進行攔截。本發(fā)明提供的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，所述芯片下層液體流路通道的寬度為200微米，要求在與芯片上層微藻培養(yǎng)室對應(yīng)位置處有圓形液池結(jié)構(gòu)，該液池與微藻培養(yǎng)室直徑相同，該直徑尺寸為2厘米。本發(fā)明提供的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，所述微流控芯片外圍設(shè)備為微量注射泵，微量注射泵與微流控芯片上層的培養(yǎng)液入口處相連，分別以推進和抽取的方式實現(xiàn)培養(yǎng)液的平行供給和更換。本發(fā)明提供的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，所訴芯片微藻培養(yǎng)室可以實現(xiàn)分批培養(yǎng)和半連續(xù)恒化培養(yǎng)兩種微藻培養(yǎng)方式。
本發(fā)明提供的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，所述微藻培養(yǎng)單室同時也做為微藻實時觀測單元，可同時實現(xiàn)各種類型微藻的培養(yǎng)和微藻種群增殖行為的在線觀測。本發(fā)明提供的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，通過模集成芯片的制作和芯片上多種單元技術(shù)的靈活組合，將微藻的分批培養(yǎng)、半連續(xù)恒化培養(yǎng)和種群增殖行為的實時在線觀測過程集成在一塊芯片上完成；該系統(tǒng)基本由兩部分基本單元構(gòu)成第一個基本單元為海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究微流控芯片，第二個基本單元為海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究微流控芯片外圍設(shè)備。其中，用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究微流控芯片采用PDMS軟刻蝕及不可逆封接技術(shù)構(gòu)建的雙層微流控芯片芯片下層為液體流路層；芯片上層具有微藻培養(yǎng)室、細胞接種入口、培養(yǎng)液入口和廢液出口結(jié)構(gòu)；芯片上層與下層之間，在微藻培養(yǎng)室處以微孔膜隔開；微藻培養(yǎng)室為5X4細胞培養(yǎng)池陣列,可完成多組平行試驗；微藻培養(yǎng)室同時也做為微藻實時觀測單元可同時實現(xiàn)各種類型微藻的培養(yǎng)和微藻種群增殖實時在線觀測功能；微藻培養(yǎng)室以微孔膜作為基底，在維持細胞懸浮狀態(tài)、攔截細胞的同時，可以實現(xiàn)培養(yǎng)液的供給；培養(yǎng)液的添加是通過芯片上層中心處培養(yǎng)液入口外接微量注射泵，并以推進的方式維持培養(yǎng)液的平行供給。本發(fā)明提供的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，所述微流控芯片外圍設(shè)備是用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片實現(xiàn)各功能的外部支持及微藻種群增殖行為分析的檢測裝置，主要包括微量注射泵、熒光倒置顯微鏡及相關(guān)分析軟件等。本發(fā)明提供的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片，其優(yōu)點在于高通量、操作簡便和成本低，是一種進行海洋微藻培養(yǎng)、種群增殖研究和以微藻作為試驗對象的相關(guān)研究領(lǐng)域的新平臺。


圖I為微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖，其中，I為芯片上層，2為微孔膜(X5)，3為芯片下層，4為培養(yǎng)液入口，5為廢液出口(X5);圖2為微流控芯片平面俯視圖，其中4為培養(yǎng)液入口，5為廢液出口( X5)，6為細胞接種入口(5X2)，7為微藻培養(yǎng)室(5X4)，8為液體流路通道；
圖3亞心扁藻芯片分批培養(yǎng)種群增殖結(jié)果 圖4青島大扁藻芯片分批培養(yǎng)種群增殖結(jié)果 圖5三角褐指藻芯片分批培養(yǎng)種群增殖結(jié)果圖； 圖6小球藻芯片分批培養(yǎng)種群增殖結(jié)果 圖7紫球藻芯片分批培養(yǎng)種群增殖結(jié)果 圖8亞心扁藻芯片分批培養(yǎng)與半連續(xù)恒化培養(yǎng)種群增殖結(jié)果對照圖(a)分批培養(yǎng)(b)恒化培養(yǎng)；
具體實施例方式下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。實施例I
利用實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片系統(tǒng)，構(gòu)型如圖I和圖2所示，接種微藻，本實施例選用亞心扁藻，綠藻門，中國沿海常見優(yōu)勢種，接種密度為在IO4ceIVmL以上。培養(yǎng)方式為分批培養(yǎng)，即一次性添加培養(yǎng)液之后，培養(yǎng)期間不再更換營養(yǎng)成分，培養(yǎng)周期為9天。培養(yǎng)液采用f / 2營養(yǎng)液配方，培養(yǎng)條件為溫度20°C ±1°C，明暗周期12h :12 h，光源為白色日光燈，照度為60 μ mo I photon πΓ2. s'每24h對芯片培養(yǎng)室內(nèi)微藻進行顯微鏡拍照，為增加微藻辨識度，采用激光誘導熒光模式，Image Pro軟件細胞計數(shù)分析，在線觀測其種群增殖行為。其結(jié)果如圖3所示，亞心扁藻在芯片上細胞生長狀態(tài)良好，種群增殖趨勢與自然狀態(tài)下營養(yǎng)鹽一次性供給或常規(guī)分批培養(yǎng)方式的趨勢基本一致，呈現(xiàn)“S”形曲線。根據(jù)其增殖趨勢進行曲線擬合，發(fā)現(xiàn)與Richards模型呈現(xiàn)較好的符合關(guān)系，擬合優(yōu)度大于
O.99 ο實施例2
利用實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片系統(tǒng)，構(gòu)型如圖I和圖2所示，接種微藻，本實施例選用青島大扁藻，綠藻門，中國沿海常見優(yōu)勢種，接種密度為在IO4ceIVmL以上，分批培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為9天。培養(yǎng)液采用f / 2營養(yǎng)液配方，培養(yǎng)條件為溫度20°C 土1°C，明暗周期12h :12 h,光源為白色日光燈,照度為60 μ mo I photon πΓ2· s'每24h對芯片培養(yǎng)室內(nèi)微藻進行顯微鏡拍照，為增加微藻辨識度，米用激光誘導突光模式，Image Pro軟件細胞計數(shù)分析，在線觀測其種群增殖行為。其結(jié)果如圖4所示，亞心扁藻在芯片上細胞熒光明亮，生長狀態(tài)良好，根據(jù)其增殖趨勢進行曲線擬合，發(fā)現(xiàn)與Richards模型呈現(xiàn)較好的符合關(guān)系，擬合優(yōu)度大于0. 99。實施例3
利用實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片系統(tǒng)，構(gòu)型如圖I和圖2所示，接種微藻，本實施例選用三角褐指藻，硅藻門代表種，接種密度為在IO4ceIVmL以上，分批培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為9天。培養(yǎng)液采用f / 2營養(yǎng)液配方，培養(yǎng)條件為溫度20°C 土 1°C，明暗周期12h 12h,光源為白色日光燈,照度為60 μ mo I photon πΓ2. s'每24h對芯片培養(yǎng)室內(nèi)微藻進行顯微鏡拍照，為增加微藻辨識度，采用激光誘導熒光模式，Image Pro軟件細胞計數(shù)分析，在線觀測其種群增殖行為。其結(jié)果如圖5所示，三角褐指藻在芯片上細胞外觀基本呈現(xiàn)梭形和三出形，說明其生長狀態(tài)良好。實施例4
利用實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片系統(tǒng)，構(gòu)型如圖I和圖2所示，接種微藻，本實施例選用小球藻，綠藻門，常見藻種，在餌料科學、海洋天然產(chǎn)物提取等方面都有著光泛的應(yīng)用。接種密度為在104cell/mL以上。培養(yǎng)方式為分批培養(yǎng),即一次性添加培養(yǎng)液之后，培養(yǎng)期間不再更換營養(yǎng)成分，培養(yǎng)周期為9天。每24h對芯片培養(yǎng)室內(nèi)微藻進行顯微鏡拍照，為增加微藻辨識度，采用激光誘導熒光模式，Image Pro軟件細胞計數(shù)分析，在線觀測其種群增殖行為。其結(jié)果如圖6所示，培養(yǎng)期間小球藻在芯片上
持續(xù)維持增殖狀態(tài)，細胞生長狀態(tài)良好，對其進行Richards模型擬合，擬合度大于
O.99 ο 實施例5
利用實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片系統(tǒng)，構(gòu)型如圖I和圖2所示，接種微藻，本實施例選用紫球藻，紅藻門唯一單細胞藻類，其細胞活性物質(zhì)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和美容行業(yè)。接種密度為在104cell/mL以上。培養(yǎng)方式為分批培養(yǎng),即一次性添加培養(yǎng)液之后，培養(yǎng)期間不再更換營養(yǎng)成分，培養(yǎng)周期為9天。每24h對芯片培養(yǎng)室內(nèi)微藻進行顯微鏡拍照，為增加微藻辨識度，采用激光誘導熒光模式，Image Pro軟件細胞計數(shù)分析，在線觀測其種群增殖行為。其結(jié)果如圖7所示，紫球藻在芯片上細胞生長狀態(tài)良好，少有結(jié)團現(xiàn)象，根據(jù)其增殖趨勢進行曲線擬合，發(fā)現(xiàn)與Richards模型呈現(xiàn)較好的符合關(guān)系，擬合優(yōu)度大于O. 99。實施例6
利用實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片系統(tǒng)，構(gòu)型如圖I和圖2所示，接種微藻，本實施例選用亞心扁藻。接種密度為在IO5ceIVmL以上，恒化培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為15天，每隔24h更換培養(yǎng)室1/2體積培養(yǎng)液,培養(yǎng)液米用f / 2營養(yǎng)液配方，培養(yǎng)條件為溫度20 °C ±1°C,明暗周期12h :12 h,光源為白色日光燈,照度為60 μ mo I photon IiT2-S'每24h對芯片培養(yǎng)室內(nèi)微藻進行顯微鏡拍照，為增加微藻辨識度，采用激光誘導熒光模式，Image Pro軟件細胞計數(shù)分析，在線觀測其種群增殖行為。其結(jié)果如圖8所示，亞心扁藻在芯片分批培養(yǎng)條件下，種群增殖呈“S”曲線，尤其到培養(yǎng)后期，種群增殖開始進入遲滯狀態(tài)；亞心扁藻在芯片半連續(xù)恒化培養(yǎng)條件下，種群增殖一直保持線性趨勢。說明所構(gòu)建培養(yǎng)室可以實現(xiàn)海洋微藻的高密度培養(yǎng)和長期培養(yǎng)，為芯片平臺的進一步應(yīng)用創(chuàng)造條件。
權(quán)利要求
1.一種用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，其特征在于該微流控芯片系統(tǒng)將海洋微藻的接種、分批培養(yǎng)、半連續(xù)恒化培養(yǎng)、海洋微藻種群增殖行為的在線監(jiān)測過程集成在一塊功能芯片上完成；該系統(tǒng)由兩個基本單元構(gòu)成第一個基本單元為海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究微流控芯片，第二個基本單元為海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究微流控芯片外圍設(shè)備； 其中海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究微流控芯片單元由采用聚二甲基硅氧烷材料軟刻蝕及不可逆封接技術(shù)構(gòu)建的多層微流控芯片，分為三部分第一部分為芯片下層，具有通過軟刻蝕技術(shù)產(chǎn)生液體流路通道；第二部分為芯片上層，具有微藻培養(yǎng)室、細胞接種入口、培養(yǎng)液入口和廢液出口 ；第三部分為中間層，包括五塊微孔膜，位于芯片上層與下層之間，分別對應(yīng)于微藻培養(yǎng)室位置處。
2.按照權(quán)利要求I所述的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片，其特征在于所述芯片上層與下層使用的材料為聚二甲基硅氧烷。
3.按照權(quán)利要求I所述的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片，其特征在于所述微藻培養(yǎng)室以微孔膜為基底，并通過微孔膜與芯片下層流路通道聯(lián)通。
4.按照權(quán)利要求I或3所述的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片，其特征在于所述微孔膜為聚碳酸酯膜，孔徑為I微米。
5.按照權(quán)利要求I所述的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片，其特征在于所述芯片下層液體流路通道的寬度為200微米，要求在與芯片上層微藻培養(yǎng)室對應(yīng)位置處有圓形液池結(jié)構(gòu)，該液池與微藻培養(yǎng)室直徑相同，該直徑尺寸為4厘米。
6.按照權(quán)利要求I所述的海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，其特征在于所述微流控芯片外圍設(shè)備由微量注射泵連接培養(yǎng)液入口，并分別以推進和抽取的方式實現(xiàn)培養(yǎng)液的平行供給和更換。
7.按照權(quán)利要求I所述的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片，其特征在于所述芯片微藻培養(yǎng)室可以實現(xiàn)分批培養(yǎng)和半連續(xù)恒化培養(yǎng)兩種微藻培養(yǎng)方式。
8.按照權(quán)利要求I或7所述的用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，其特征在于所述微藻培養(yǎng)單室同時也做為微藻實時觀測單元，可同時實現(xiàn)各種類型微藻的培養(yǎng)和微藻種群增殖行為的在線監(jiān)測。
全文摘要
本發(fā)明目的在于提供一種用于海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究的微流控芯片系統(tǒng)，通過規(guī)模集成芯片的制作和芯片上多種單元技術(shù)的靈活組合，將海洋微藻的接種、分批培養(yǎng)、半連續(xù)恒化培養(yǎng)、海洋微藻種群增殖行為的在線監(jiān)測過程集成在一塊功能芯片上完成；該系統(tǒng)由兩個基本單元構(gòu)成第一個基本單元為海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究微流控芯片，第二個基本單元為海洋微藻培養(yǎng)和增殖行為研究微流控芯片外圍設(shè)備。其優(yōu)點在于高通量、操作簡便和低成本，是一種進行海洋微藻培養(yǎng)、種群增殖研究和以微藻作為試驗對象的相關(guān)研究領(lǐng)域的新平臺。
文檔編號C12M1/00GK102876562SQ201210368780
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者鄭國俠, 李雅杰, 王云華, 魏俊峰 申請人:大連大學