專利名稱：家蠶BmNPV多角體晶體固定蝎毒素蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)、蛋白質(zhì)分析技術(shù)，尤其涉及一種家蠶BmNPV多角體晶體固定蝎毒素蛋白的方法。
背景技術(shù)：
蝎毒素蛋白是由細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有對昆蟲具有毒性的蛋白質(zhì)，可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲的殺滅，但該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，在環(huán)境中易被分解而失去活性。家蠶桿狀病毒中的核型多角體病毒在感染宿主后的晚期能夠產(chǎn)生大量的多角體蛋白，并聚合形成一種獨特的超大分子蛋白質(zhì)結(jié)晶——多角體。目前的研究表明多角體的功能主要保護包埋在多角體內(nèi)部的病毒粒子，使之長時間保存活性。
本發(fā)明利用這一現(xiàn)象，利用野生型病毒表達多角體，同時構(gòu)建了表達蝎毒素蛋白基因的病毒載體，將兩種病毒同時感染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，這樣野生型病毒產(chǎn)生多角體，在細(xì)胞內(nèi)會將蝎毒素蛋白包埋和固定入多角體內(nèi)部。這樣解決了蝎毒素蛋白容易失活的缺點，為開發(fā)蝎毒素蛋白作為生物殺蟲劑創(chuàng)造了條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶BmNPV多角體晶體固定蝎毒素蛋白的方法。它利用基因工程表達技術(shù)，構(gòu)建含有蝎毒素蛋白基因的重組病毒，并利用家蠶培養(yǎng)細(xì)胞作為宿主，重組病毒與野生型病毒共感染細(xì)胞，使蝎毒素蛋白被固定于多角體內(nèi)部。為了達到上述目的，本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案為
本發(fā)明家蠶BmNPV多角體晶體固定蝎毒素蛋白的方法包括
(1)按以下方法進行蝎毒素蛋白基因的克隆
以從蝎子抽提的總RNA為模板，利用RT-PCR擴增反應(yīng)得到蝎毒素蛋白BmK基因；所述PCR擴增所用的引物設(shè)計如下正向引物為含有酶切位點的5’ GGATCCATGGATGGATATATAAG 3’，反向引物為含有歷/ dIII酶切位點的5’AAGCTTTTACTTTTTTCCACCGC 3’ ；所述RT-PCR擴增反應(yīng)為一個循環(huán),94° C模板變性3分鐘；接著30個循環(huán)，94° C變性50秒，55° C退火30秒，72° C延伸I分鐘；最后I個循環(huán),72。C延伸10分鐘；
利用1%瓊脂糖凝膠電泳對所述蝎毒素蛋白ifc成基因進行PCR產(chǎn)物分析和純化，隨后將目的PCR產(chǎn)物克隆進TA載體pCR2. I，得到pCR2. I-BmK基因，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認(rèn)所述PCR2. I-BmK基因的順序的正確性；
(2)用限制性內(nèi)切酶和歷/ (1111消化所述pCR2.基因得到基因片段，然后將谷〃成基因片段克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHisa得到重組的轉(zhuǎn)移載體；
按以下方法將所述重組的轉(zhuǎn)移載體與家蠶野生型核型多角體病毒BmNPV DNA共轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，并通過同源重組產(chǎn)生含有蝎毒素蛋白基因的重組桿狀病毒
在聚苯乙烯錐形管中按1:15的質(zhì)量比加入所述重組的轉(zhuǎn)移載體的DNA和家蠶BmNPV的DNA,并在加入脂質(zhì)體Iipofectin后混勻，最后加入滅菌蒸懼水直至聚苯乙烯錐形管內(nèi)混合物的總體積與其中的所述脂質(zhì)體Iipofectin的體積比為20 7 ;將所述混合物在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的家蠶培養(yǎng)細(xì)胞；然后將該共轉(zhuǎn)染后的家蠶培養(yǎng)細(xì)胞先用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，再用含有10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基在27°C條件下培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒儲存原液，對所述病毒儲存原液進行空斑篩選而獲得含有蝎毒素蛋白基因的重組桿狀病毒；
(3)使用家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，接種所述含有蝎毒素蛋白基因的重組桿狀病毒和野生型病毒BmNPV,在27°C下感染三天以進行感染表達，后通過離心收集家蠶培養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有的有益效果是
本發(fā)明解決了蝎毒素蛋白在蛋白游離狀態(tài)下容易被分解而失活的缺點，利用野生型病毒產(chǎn)生的多角體將重組蝎毒素蛋白固定在其內(nèi)部，使蝎毒素蛋白受到保護。這樣的技術(shù)為開發(fā)蝎毒素蛋白作為生物殺蟲劑創(chuàng)造了條件。


圖I :桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHisa的圖譜；
圖2 :在家蠶培養(yǎng)細(xì)胞中病毒表達產(chǎn)生的多角體(普通顯微鏡下觀察)；
圖3 =SDS-PAGE電泳分析多角體蛋白。
具體實施例方式以下實施例涉及的相關(guān)材料及其來源如下
(I)家蠶野生型病毒BmNPV :由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院蠶蜂研究所提供。(2) RNA抽提試劑盒購于Qiagene。(3) DNA 處理和 PCR 擴增試劑盒購于 Tkfcara OffietZicaJ1S (Kyoto, Japan)。(4) TA克隆試劑盒、桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlue BacHisa和Iipofectin :均為美國In vi trogen公司產(chǎn)品。(5) DNA 測序試劑盒購于/ 1 Applied Biosysterns。(6)胎牛血清FCS、家蠶培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100 :均為GibcoBRL的產(chǎn)品。
以下以具體實施例詳細(xì)說明本發(fā)明家蠶BmNPV多角體晶體固定蝎毒素蛋白的方法，它包括如下部分
(I)竭毒素蛋白ifcz/T基因的克隆
以蝎子抽提的總RNA為模板，利用RT-PCR擴增得到蝎毒素蛋白基因；所述PCR擴增所用的引物設(shè)計如下正向引物為含有酶切位點的5’ GGATCCATGGATGGATATATAAG3’ ；反向引物為含有歷fldIII酶切位點的5’AAGCTTTTACTTTTTTCCACCGC 3’。所述RT-PCR擴增反應(yīng)為一個循環(huán)，94° C模板變性3分鐘；接著30個循環(huán)，94° C變性50秒，55° C退火30秒，72° C延伸I分鐘；最后I個循環(huán)，72° C延伸10分鐘。利用I %瓊脂糖凝膠電泳對所述蝎毒素蛋白基因進行PCR產(chǎn)物分析，并用Qiagene的PCR純化試劑盒純化，隨后將目的PCR產(chǎn)物克隆進TA載體pCR2. 1，得到pCR2. I-BmK基因，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認(rèn)PCR2. I-BmK克隆基因順序的正確性。pCR2. I-BmK基因的序列如SEQ ID NO: I所示。(2)含有蝎毒素蛋白基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶和歷/ (1111消化pCR2. 基因得到基因片段，然后將基因片段克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHisa得到重組的轉(zhuǎn)移載體，桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHisa的圖譜參見圖I。按以下方法將所得到的重組的轉(zhuǎn)移載體與家蠶野生型核型多角體病毒BmNPV DNA共轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，并通過同源重組產(chǎn)生含有蝎毒素蛋白基因的重組桿狀病毒
在聚苯乙烯錐形管中加入I μ g轉(zhuǎn)移載體DNA和15 μ g家蠶BmNPV DNA,并加入14U I脂質(zhì)體Iipofectin后混勻，最后加入滅菌蒸懼水直至聚苯乙烯錐形管內(nèi)混合物的總體積達到40 μ I ;將該混合物在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的家蠶培養(yǎng)細(xì)胞；然后將該共轉(zhuǎn)染后的家蠶培養(yǎng)細(xì)胞先用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，再用含有10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基在27°C條件下培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒儲存原液以用來 篩選重組病毒；重組病毒通過三輪空斑篩選，獲得濃度為IO8 pfu/ml的病毒溶液，該病毒溶液命名為含有蝎毒素蛋白基因的重組桿狀病毒。(3)家蠶培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)表達
使用家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，接種以上得到的含有蝎毒素蛋白基因的重組桿狀病毒和野生型病毒BmNPV，在27°C下感染三天以進行感染表達，后通過離心收集家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，從而在家蠶BmNPV多角體晶體內(nèi)固定蝎毒素蛋白。(4)多角體晶體固定蝎毒素蛋白的分析鑒定將上述離心收集到的家蠶培養(yǎng)細(xì)胞樣品進行超聲波破碎，釋放細(xì)胞內(nèi)的多角體，然后利用蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳的技術(shù)，對固定入多角體內(nèi)的重組蝎毒素蛋白進行鑒定。在家蠶培養(yǎng)細(xì)胞中病毒表達產(chǎn)生的多角體參見圖2。經(jīng)過溶解多角體蛋白并通過電泳分析，如圖3所示，在多角體蛋白條帶，還能檢測到一條分子量較小、大小約為13.8 KDa的蛋白條帶，與預(yù)測的重組蝎毒素蛋白分子量大小一致，證明這是重組蝎毒素蛋白BmK，這說明除多角體蛋白外，多角體內(nèi)還含有蝎毒素蛋白，這一結(jié)果表明利用多角體固定蝎毒素蛋白成功。
權(quán)利要求
1.一種家蠶BmNPV多角體晶體固定蝎毒素蛋白的方法，其特征在于包括 (1)按以下方法進行蝎毒素蛋白基因的克隆 以從蝎子抽提的總RNA為模板，利用RT-PCR擴增反應(yīng)得到蝎毒素蛋白BmK基因；所述PCR擴增所用的引物設(shè)計如下正向引物為含有酶切位點的5’ GGATCCATGGATGGATATATAAG 3’，反向引物為含有歷/ dIII酶切位點的5’AAGCTTTTACTTTTTTCCACCGC 3’ ；所述RT-PCR擴增反應(yīng)為一個循環(huán),94° C模板變性3分鐘；接著30個循環(huán)，94° C變性50秒，55° C退火30秒，72° C延伸I分鐘；最后I個循環(huán),72。C延伸10分鐘； 利用1%瓊脂糖凝膠電泳對所述蝎毒素蛋白ifc成基因進行PCR產(chǎn)物分析和純化，隨后將目的PCR產(chǎn)物克隆進TA載體pCR2. I，得到pCR2. I-BmK基因，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認(rèn)所述PCR2. I-BmK基因的順序的正確性； (2)用限制性內(nèi)切酶和歷/ (1111消化所述pCR2.基因得到基因片段，然后將谷〃成基因片段克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHisa得到重組的轉(zhuǎn)移載體； 按以下方法將所述重組的轉(zhuǎn)移載體與家蠶野生型核型多角體病毒BmNPV DNA共轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，并通過同源重組產(chǎn)生含有蝎毒素蛋白基因的重組桿狀病毒 在聚苯乙烯錐形管中按1:15的質(zhì)量比加入所述重組的轉(zhuǎn)移載體的DNA和家蠶BmNPV的DNA,并在加入脂質(zhì)體Iipofectin后混勻，最后加入滅菌蒸懼水直至聚苯乙烯錐形管內(nèi)混合物的總體積與其中的所述脂質(zhì)體Iipofectin的體積比為20 7 ;將所述混合物在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的家蠶培養(yǎng)細(xì)胞；然后將該共轉(zhuǎn)染后的家蠶培養(yǎng)細(xì)胞先用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，再用含有10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基在27°C條件下培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒儲存原液，對所述病毒儲存原液進行空斑篩選而獲得含有蝎毒素蛋白基因的重組桿狀病毒； (3)使用家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，接種所述含有蝎毒素蛋白基因的重組桿狀病毒和野生型病毒BmNPV,在27°C下感染三天以進行感染表達，后通過離心收集家蠶培養(yǎng)細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠶BmNPV多角體晶體固定蝎毒素蛋白的方法，包括(1)進行蝎毒素蛋白BmK基因的克隆；(2)用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII消化所述pCR2.1-BmK基因得到BmK基因片段，然后將BmK基因片段克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHisa得到重組的轉(zhuǎn)移載體；將所述重組的轉(zhuǎn)移載體與家蠶野生型核型多角體病毒BmNPVDNA共轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，并通過同源重組產(chǎn)生含有蝎毒素蛋白基因的重組桿狀病毒；(3)使用家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，接種所述含有蝎毒素蛋白基因的重組桿狀病毒和野生型病毒BmNPV，在27℃下感染三天以進行感染表達，后通過離心收集家蠶培養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明解決了蝎毒素蛋白容易失活的缺點，為開發(fā)蝎毒素蛋白作為生物殺蟲劑創(chuàng)造了條件。
文檔編號C12N15/866GK102911968SQ20121036863
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者王國寶, 沈運旺, 吳小鋒 申請人:浙江大學(xué)