專利名稱：一種產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程和微生物育種的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株及其制備方法。
背景技術(shù)：
低聚果糖是果糖基經(jīng)β (2 — I)糖苷鍵連接而成的，聚合度為2 9的功能性低聚糖，屬于食品原料。低聚果糖按結(jié)構(gòu)分為蔗-果型低聚果糖和果-果型低聚果糖，其中蔗-果型低聚果糖主要由在蔗糖的果糖(F)殘基上通過β (2 — I)糖苷鍵連接I 4個果糖基(F)所形成的蔗果三糖(GF2 )、蔗果四糖(GF3 )、蔗果五糖(GF4 )和蔗果六糖(GF5 )的混合物。果糖基轉(zhuǎn)移酶能催化蔗糖生成蔗果低聚糖。其酶促反應(yīng)機理最早由K. H. Jung等 報道，當(dāng)以蔗糖為底物時，最初只有蔗果三糖(GF2)和葡萄糖(G)生成2GF — GF2+G，但隨著反應(yīng)進行下去，蔗果三糖(GF2)和蔗果四糖(GF3)也可以作為反應(yīng)底物，其反應(yīng)分別是2GF2 — GF3+G ；2GF3 — GF4+G (GF4 代表蔗果五糖)。K. H. Jung等用一個反應(yīng)方程式來描述FTase的酶促反應(yīng)GFn+GFn — GFn+1+GFn-l。以蔗糖為原料生產(chǎn)低聚果糖，果糖基轉(zhuǎn)移酶是必需的催化劑。果糖基轉(zhuǎn)移酶存在于植物以及微生物中。據(jù)文獻報道，植物中的果糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性很弱，產(chǎn)率低，且受到季節(jié)限制，而來自微生物的果糖基轉(zhuǎn)移酶比植物的催化活性高，且耐高溫，可催化較高濃度的蔗糖進行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，使用方便。目前，在亞洲國家，工業(yè)上主要是采用微生物果糖基轉(zhuǎn)移酶作用于蔗糖，進行分子內(nèi)轉(zhuǎn)移果糖基反應(yīng)來生產(chǎn)低聚果糖。具有果糖基合成酶活性的微生物包括絲狀真菌、酵母菌和細菌。與植物來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶不同，多數(shù)微生物來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶往往同時具有轉(zhuǎn)果糖基活性(Ut)和水解活性(Uh)，這些酶即可以轉(zhuǎn)化蔗糖為低聚果糖，又可以催化水解蔗糖和低聚糖進行可逆反應(yīng)，使低聚果糖降解。生產(chǎn)上常采用Ut/Uh值作為篩選高產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶微生物的依據(jù)。研究表明，不同微生物來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對分子質(zhì)量、米氏常數(shù)、最適作用溫度、最適pH及基質(zhì)特異性方面存在一定差異，如來源于節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)的果糖基轉(zhuǎn)移酶的分子質(zhì)量為52kDa,最適溫度為55 ,最適pH6. 5,而來源于微桿菌(Microbacterium sp.)的果糖基轉(zhuǎn)移酶的分子質(zhì)量46kDa,最適溫度48°C,最適pH6. O。而同一微生物所產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶在不同PH下，Ut/Uh值不同，如來源于黑曲霉的果糖基轉(zhuǎn)移酶在pH4. O 5. O和pH8. O時低聚果糖產(chǎn)量最高，而在pH5. O 8. O范圍內(nèi)的水解酶活力最高。由此可見，自然進化的微生物酶并不能保證在每一種條件下都能進行有效地催化，常常受到包括對非天然底物的催化緩慢、酶的穩(wěn)定性低、在反應(yīng)相中活力低、復(fù)合酶中反應(yīng)體系不可選(如果糖基轉(zhuǎn)移酶)等因素的限制，難以滿足實際生產(chǎn)的需要。為了修改酶的特性而更適用于實際生產(chǎn)，各研究者采取不同的技術(shù)方法、從不同角度對現(xiàn)有酶進行改造，以期獲得比天然酶更高的活力或不同的催化活性，提高酶的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供所述的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株的制備方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株，名稱為米曲霉scut209 (Aspergillus oryzae scut209),保藏于位于中國武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年4月10日，保藏編號為CCTCC N0:M2012106 ；所述的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的菌落形態(tài)為疏松放線狀，中部突起，顏色初呈乳白色，后漸變?yōu)閹S褐色至淡綠褐色；所述的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)酶的能力達到34987U/g細胞， 比出發(fā)菌株提高了 78. 5%，具備較高工業(yè)應(yīng)用價值；所述的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株的制備方法，包含以下步驟(I)將出發(fā)菌株的孢子置于距離30w紫外燈25cm處，照射lOmin，紅光下涂布于含質(zhì)量百分比1.0%LiCl的PDA平板，30°C下培養(yǎng)2天，通過果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力篩選比出發(fā)菌株活力高的菌株；(2)收集步驟(I)篩選得到的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力最高的6株菌株任意的孢子，分別制備得到原生質(zhì)體；然后將6株菌株的原生質(zhì)體分為兩組，每組含3株菌株；將兩組原生質(zhì)體分別于8(TC下熱滅活I(lǐng)Omin和30W紫外燈下25cm處滅活I(lǐng)Omin ;然后按照體積比I: I的比例混合；于30°C,在原生質(zhì)體融合溶液的介導(dǎo)下原生質(zhì)體融合5min后,用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋，將稀釋液涂布于再生培養(yǎng)基，30°C下避光培養(yǎng)2d;將再生培養(yǎng)基平板上的再生單菌落分別接種于斜面培養(yǎng)基，30°C下培養(yǎng)，得到再生菌株孢子；(3)將步驟(3)得到的再生菌株孢子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 30°C、150 200r/min培養(yǎng)2天，通過檢測果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力進行篩選，得到Fl代；(4)將Fl的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力最高的6株菌株任意的孢子，重復(fù)步驟(2 ) (4)，重復(fù)3次，得到產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株；步驟(I)中所述的出發(fā)菌株為產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的米曲霉，優(yōu)選為米曲霉(Aspeigillus oryzae) BLB-21,菌種保藏號 CMGCC No. 2951 ；步驟(I)中所述的出發(fā)菌株的孢子的濃度優(yōu)選為IO5 IO7個/mL;步驟(2)中所述的原生質(zhì)體的制備步驟優(yōu)選為收集生長旺盛，孢子呈灰黑色的孢子，將其濃度調(diào)整為IO5 IO7個/mL ;采用25mmol/L β -巰基乙醇+5mmol/LEDTA-2Na的溶液體系處理20min，離心；用無菌水洗滌離心收集的孢子，在O. 6mol/L、pH7. O的山梨醇溶液+質(zhì)量體積比2. 5%溶菌酶+質(zhì)量體積比2. 0%蝸牛酶+質(zhì)量體積比I. 5%纖維素酶組成的復(fù)合酶體系中，于35 37°C下進行酶解4 6h，制得原生質(zhì)體；步驟(2)中所述的原生質(zhì)體融合溶液的組成為質(zhì)量百分比30%的聚乙二醇6000、O. 01mol/LCaCl2 和 O. 02mol/L MgCl2 ；步驟(2)中所述的滲透壓穩(wěn)定劑優(yōu)選為O. 6mol/L、pH7. O的山梨醇溶液；步驟(2)中所述的再生培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為質(zhì)量百分比3. 0%的白砂糖、質(zhì)量百分比3. 6%的營養(yǎng)肉湯和質(zhì)量百分比2. 0%的瓊脂；步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為質(zhì)量百分比5. 0%的白砂糖、質(zhì)量百分比的豆柏粉、質(zhì)量百分比O. 3%的玉米粉和水。本發(fā)明的原理本發(fā)明通過基因組改組技術(shù)(Genome Shuffling)來改變菌株中果糖基轉(zhuǎn)移酶的性質(zhì)，以提高Ut/Uh比值，增加單位酶活力的低聚果糖產(chǎn)量?；蚪M改組技術(shù)是一門新興的分子選育技術(shù)，它運用循環(huán)的基因組改組，在不需要弄清楚基因組序列數(shù)據(jù)或網(wǎng)絡(luò)信息的情況下，即可以在全基因組的不同位置上同時發(fā)生改組，產(chǎn)出優(yōu)勢后代?；蚪M改組是整個基因組的定向進化，通過改組使分散的優(yōu)點集中，是一個利用傳統(tǒng)的育種方式結(jié)合了多個親本的優(yōu)點雜交過程。采用基因組改組技術(shù)進行菌種選育，篩選出最佳生產(chǎn)菌種，通過液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后提取出果糖基轉(zhuǎn)移酶，進而研究其最適反應(yīng)溫度、最適pH、最適底物濃度等，以求果糖基轉(zhuǎn)移酶的最大產(chǎn)量化。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果本發(fā)明所提供的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶 的菌株產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)酶的能力達到34987U/g細胞，比出發(fā)菌株提高了 78. 5%，具備有工業(yè)應(yīng)用的價值。


圖I是初始菌株的果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)能力的HPLC測定圖譜。圖2是紫外與氯化鋰復(fù)合誘變菌株的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力檢測結(jié)果圖。圖3是原生質(zhì)體融合第4代菌株的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力檢測結(jié)果圖。圖4 是米曲霉(Aspergillus oryzae) scut209 的菌落形態(tài)圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例中所用的果糖基轉(zhuǎn)移酶活力測定方法為果糖基轉(zhuǎn)移酶或產(chǎn)酶菌體作用于蔗糖，首先生成蔗果三糖(Ι-kestose);蔗果三糖含量測定方法采用HPLC法，試驗方法按GB/T23528-20096. 5 執(zhí)行。酶活力單位定義在酶供應(yīng)者標(biāo)識的最佳酶化反應(yīng)的條件下，將蔗糖轉(zhuǎn)化為低聚果糖，每分鐘產(chǎn)生Iymol蔗果三糖所需酶量為一個酶活力單位(U)；
IOx 1000x67'；
_活力(U/g) = 0.504 xt xW =330.69* GF2/W.............................(I)式中10----10%(w/w)鹿糖溶液中的鹿糖總量，g ;GF2——蔗果三糖的百分含量，% ;O. 504----1 μ mo I 鹿果三糖=0. 504mg ；t----反應(yīng)時間，60min;W----菌絲質(zhì)量，g。高效液相色譜(HPLC)檢測參數(shù)為=Cosmosil色譜糖柱；流動相乙腈-水(75%，v/y);流速:1. OmL/min ;示差折光檢測器(RI) :Waters2410 ;監(jiān)測器靈敏度:4 ;柱溫:30°C；進樣體積IO μ L0實施例I(I)出發(fā)菌株孢子懸液的制備實施方案以米曲霉(Aspeigillusoryzae)BLB_21(菌種保藏號CMGCC No. 2951;已在申請?zhí)枮?00910018452. I、名稱為“一種米曲霉菌種及其制備高純度低聚半乳糖的方法”中公開)為初始菌株。在本發(fā)明實驗條件下，初始菌株經(jīng)過三次斜面培養(yǎng)基(白砂糖5. 0%w/w,豆柏粉2. 0%w/w,玉米粉O. 3%w/w,瓊脂2. 0%w/w ；以下所用的斜面培養(yǎng)基同此處)活化培養(yǎng)后，接種于IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基(白砂糖5. 0%w/w,豆柏粉2. 0%w/w,玉米粉O. 3%w/w以及水，下同)中，30°C下?lián)u瓶培養(yǎng)2天后過濾取出，進行菌絲體的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力測定，其測定結(jié)果如表I和圖I所示。表I初始菌株果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)能力HPLC測定的數(shù)據(jù)分析
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株,其特征在于名稱為米曲霉scut209 (Aspergillusoryzae scut209)，保藏于位于中國武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年4月10日，保藏編號為CCTCC N0:M2012106o
2.權(quán)利要求I所述的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株的制備方法，其特征在于包含以下步驟 (1)將出發(fā)菌株的孢子置于距離30w紫外燈25cm處，照射lOmin，紅光下涂布于含質(zhì)量百分比1.0%LiCl的PDA平板，30°C下培養(yǎng)2天，通過果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力篩選比出發(fā)菌株活力高的菌株； (2)收集步驟(I)篩選得到的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力最高的6株菌株任意的孢子，分別制備得到原生質(zhì)體；然后將6株菌株的原生質(zhì)體分為兩組，每組含3株菌株；將兩組原生質(zhì)體分別于8(TC下熱滅活I(lǐng)Omin和30W紫外燈下25cm處滅活I(lǐng)Omin ;然后按照體積比I: I的比例混合；于30°C,在原生質(zhì)體融合溶液的介導(dǎo)下原生質(zhì)體融合5min后,用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋，將稀釋液涂布于再生培養(yǎng)基，30°C下避光培養(yǎng)2d;將再生培養(yǎng)基平板上的再生單菌落分別接種于斜面培養(yǎng)基，30°C下培養(yǎng)，得到再生菌株孢子； (3)將步驟(3)得到的再生菌株孢子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 30°C、150 200r/min培養(yǎng)2 天，通過檢測果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力進行篩選，得到Fl代； (4)將Fl的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力最高的6株菌株任意的孢子，重復(fù)步驟(2) (4)，重復(fù)3次，得到產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株的制備方法，其特征在于步驟(I)中所述的出發(fā)菌株的孢子的濃度為IO5 IO7個/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的原生質(zhì)體的制備步驟為收集生長旺盛，孢子呈灰黑色的孢子，將其濃度調(diào)整為IO5 IO7個/mL ;采用25_ο1/1β -巰基乙醇+5mmol/LEDTA-2Na的溶液體系處理20min，離心；用無菌水洗滌離心收集的孢子，在O. 6mol/L、pH7. O的山梨醇溶液+質(zhì)量體積比2. 5%溶菌酶+質(zhì)量體積比2. 0%蝸牛酶+質(zhì)量體積比I. 5%纖維素酶組成的復(fù)合酶體系中，于35 37°C下進行酶解4 6h，制得原生質(zhì)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的原生質(zhì)體融合溶液的組成為質(zhì)量百分比30%的聚乙二醇6000、0. 01mol/LCaCl2和O.02mol/L MgCl2。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的滲透壓穩(wěn)定劑為O. 6mol/L、pH7. O的山梨醇溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的再生培養(yǎng)基的組成為質(zhì)量百分比3. 0%的白砂糖、質(zhì)量百分比3. 6%的營養(yǎng)肉湯和質(zhì)量百分比2. 0%瓊脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為質(zhì)量百分比5. 0%的白砂糖、質(zhì)量百分比的豆柏粉、質(zhì)量百分比O. 3%的玉米粉和水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株及其制備方法。本發(fā)明首先通過氯化鋰和紫外誘變篩選菌株，再通過基因組改組技術(shù)來改變菌株中果糖基轉(zhuǎn)移酶的性質(zhì)，最終得到本發(fā)明提供的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株。該菌株名稱為米曲霉scut209，保藏于位于中國武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年4月10日，保藏編號為CCTCC NOM 2012106。其產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)酶的能力高，達到34987U/g細胞，具備了較高的工業(yè)應(yīng)用價值。
文檔編號C12N1/14GK102899256SQ20121037466
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者張毅, 曾憲經(jīng), 林曉珊, 何小妮, 陳子健 申請人:量子高科(中國)生物股份有限公司, 華南理工大學(xué)