專(zhuān)利名稱(chēng)：一種葡萄芽變的快速區(qū)分方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葡萄芽變的快速區(qū)分方法，屬于生物學(xué)分子標(biāo)記領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
芽變(budsport、bud mutation)是體細(xì)胞突變(somatic mutation)的一種。芽變選種作為葡萄育種的一種方式，與其它育種方式(實(shí)生選種、雜交育種、輻射誘變育種、原生質(zhì)體融合育種等)相比，有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。其變異性狀在田間容易被發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)嫁接繁殖被保存下來(lái)而沒(méi)有童期的干擾，可較快地進(jìn)行鑒定和推廣應(yīng)用。芽變是細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的突變，只有梢端組織分生層的細(xì)胞發(fā)生突變時(shí)才有可能成為一個(gè)芽變。組織發(fā)生層學(xué)說(shuō)是目前解釋芽變的主要學(xué)說(shuō)，被子植物梢端分生組織都有幾個(gè)相互區(qū)分的細(xì)胞層，叫組織發(fā)生層，分別用L M Lu、Lm表示。植物的組織即由這三層細(xì)胞分別衍生而成，各個(gè)組織發(fā)生層按不同的方式進(jìn)行細(xì)胞分裂，并且衍生為特定的組織。L !層細(xì)胞進(jìn)行垂周分裂，形成一層細(xì)胞，衍生為表皮和果肉。L工工層細(xì)胞進(jìn)行垂周分裂，形成
1-3層細(xì)胞，衍生為皮層的外層及孢原組織。Lm層細(xì)胞既有平周分裂，又有垂直分裂和斜向分裂，形成多層細(xì)胞，衍生為皮層的中內(nèi)層、輸導(dǎo)組織和髓心組織(中柱)。在正常情況下，這三層細(xì)胞具有相同的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。如果層間或?qū)觾?nèi)不同部分之間含有不同的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，經(jīng)細(xì)胞分裂、分化發(fā)育后，形成具有兩種或多種遺傳結(jié)構(gòu)的細(xì)胞組織使植物的某一器官表現(xiàn)出兩種或多種不同性狀即嵌合體。葡萄植株的細(xì)胞，在受到外界環(huán)境條件變化的刺激后，常會(huì)發(fā)生突然變異，變異后的芽發(fā)育成枝并開(kāi)花結(jié)果時(shí)，其枝芽及果實(shí)的性狀都與原株發(fā)生了變化。葡萄植株發(fā)生芽變后，其突變性狀是多種多樣的，但必須進(jìn)行仔細(xì)的現(xiàn)察和對(duì)比，一般情況下芽變的主要特征有以下幾個(gè)方面芽變后的葉片肥大，葉厚，色澤變深，枝條節(jié)間變短，生長(zhǎng)勢(shì)變強(qiáng)，也有的葉片無(wú)毛或裂刻深淺、葉緣的鋸齒及尖銳程度發(fā)生了變化，還有的葉脈顏色、凹凸度發(fā)生 了變化；花蕾的數(shù)量、大小發(fā)生了變化，有的穂梗變得短粗；果粒、果穗變大，成熟后果粒色澤變深或變淺；樹(shù)體的萌芽期、花期、果實(shí)成熟期提早或延遲；樹(shù)體抗寒性增強(qiáng)，也有的枝條扦插不易生根，但嫁接成活率無(wú)大變化。除發(fā)生芽變這一類(lèi)屬于遺傳物質(zhì)的突變外，還普遍存在著可能由于一般的環(huán)境條件(包括砧木、肥水、土壤及各種氣象和其他生態(tài)因子)或一系列栽培措施的影響而出現(xiàn)的飾變。這些飾變是非遺傳物質(zhì)的變異，是不可能遺傳給下一代的。傳統(tǒng)的芽變鑒定主要通過(guò)形態(tài)學(xué)的觀察比較，但是有些情況下，芽變和飾變的性狀特征非常相似，僅通過(guò)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察無(wú)法有效判斷植株的突變性狀是否屬于植株芽變。而且傳統(tǒng)的芽變鑒定通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察比較，受環(huán)境和經(jīng)驗(yàn)影響較大，效率不高。所以準(zhǔn)確鑒定芽變具有重要的意義，可快速獲得一些具有優(yōu)良性狀的新材料，提高育種效率。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在植物基因組中分布廣泛，拷貝數(shù)多，異質(zhì)性高，在種內(nèi)和種間表現(xiàn)出較高的序列差異性和豐富的插入多態(tài)性(Applications of retrotransposons asgenetic tools in plant biology. Trends Plant Sci, 2001, 6 (3) : 127-134.);活性反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子常在宿主基因組中產(chǎn)生新的插入位點(diǎn)，從而改變宿主基因組大小和組成，用來(lái)在譜系中建立系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，并產(chǎn)生插入突變(Plant retrotransposons. Annu RevGenet, 1999，33(1) :479-532.);反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入、DNA甲基化和表達(dá)差異等被認(rèn)為是果樹(shù)變異的主要原因。研究表明反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子能導(dǎo)致果樹(shù)芽變，Yao等發(fā)現(xiàn)RaeIme等單性結(jié)實(shí)的蘋(píng)果品種是由于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入內(nèi)含子的MdPI基因造成的(Parthenocarpicapple fruit production conferred by transposon insertion mutations in aMADS-boxtranscription factor. ProcNatlAcad SciUSA,2001, 98(3):1306-1311.),Tignon等在對(duì)喬納金蘋(píng)果和它的兩個(gè)紅色突變進(jìn)行差異顯示分析時(shí)獲得一個(gè)與Tyl-copia類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的RT基因非常相似的一個(gè)片段(Identification of Copia —like retrotransposable element by apple. Acta Hortic 546, 2001:515 - 520.)； Kobayashi等發(fā)表論文表明紅葡萄芽變品種RubyOkuyama和FlameMuscat均是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子缺失產(chǎn)生的(Retrotransposon-induced mutations in grape skin color. Science, 20
04,304(5673) :982-982.) ;Breto等證實(shí)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是造成甜橙基因組變異的原因(TheDiversification of Citrus Clementina Hort. ex Tan. , a Vegetatively PropagatedCrop Species. Mol Phylogen Evol, 2001, 21 (2) :285-293.) 因此，利用反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子標(biāo)記區(qū)分葡萄芽變具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種葡萄芽變的快速區(qū)分方法。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種葡萄芽變的快速區(qū)分方法，包括以下步驟提取親本葡萄植株及對(duì)應(yīng)的疑似芽變葡萄植株的DNA，用iPBS引物分別對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分芽變，親本及疑似芽變品種電泳條帶有差異，疑似芽變品種為芽變。所述的提取葡萄植株的DNA可以從葡萄植株的葉片、根、莖、果實(shí)或花中提取。所述的葡萄植株的DNA提取方法，包括以下步驟I)研缽預(yù)冷后，放入葉片、聚乙烯基吡咯烷酮和液氮，研磨成細(xì)粉放入離心管并-20°C 冷藏 30min ；2)將熱的CTAB提取緩沖液裝入步驟I)的離心管中，使葉片組織均勻分散在緩沖液中，65°C水浴90min,每隔5min輕輕顛倒搖勻一次；3)將步驟2)的離心管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻，4000r/m離心IOmin ；4)取上清液，加入等體積的氯仿異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻，4000r/m 離心 IOmin ；5)取上清液，加入2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，搖勻，-20°C靜置2h，4°C下4000r/m離心IOmin ；6)棄上清液，加入70%乙醇蓋住沉淀，漂洗2次再加入70%乙醇，4°C靜置5h ；7)棄乙醇，風(fēng)干5h，每管加入300 ii LTE緩沖液，充分溶解后，加入5 y L的RNase，37°C水浴7h，得到葡萄植株的DNA。所述的iPBS 引物是序列表 SEQ ID NO: U SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3 或 SEQ IDNO:4的核苷酸序列的引物。
所述的PCR 擴(kuò)增體系包括無(wú)菌 ddH20、I XBuffer、2. Ommol L^1Mg2+>
0.3mmol L^dNTPs.O. I u mol L-1 引物、DNAl. Ong/y L、Taq 酶 0. 05U u L'所述的PCR擴(kuò)增程序是94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，72°C充分延伸lOmin，其中，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)30次。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子廣泛存在于果樹(shù)基因組中，可以通過(guò)改變等位基因或調(diào)控基因表達(dá)以改變園藝學(xué)性狀(成熟期和果皮色澤)。本發(fā)明鑒定芽變所采用的方法iPBS就是基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的一種分子標(biāo)記。與常規(guī)分子標(biāo)記技術(shù)比較，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子最大的優(yōu)勢(shì)在于它能覆蓋全基因組，提供的信息更豐富，可作為高通量標(biāo)記分析，具有很大的發(fā)展?jié)摿Α１景l(fā)明以3組葡萄品種和其對(duì)應(yīng)的早熟芽變葡萄品種為原料，利用iPBS分子標(biāo)記有效區(qū)分了芽變葡萄品種，同時(shí)本發(fā)明無(wú)需預(yù)知反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的相關(guān)序列，具有較強(qiáng)的通用性，為有效選擇變異奠定了理論基礎(chǔ)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、用途廣泛，節(jié)約了大量的人力和 物力，便于推廣。


圖I為引物序列2220、2224、2229、2231的iPBS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為引物序列2256、2295、2298、2373的iPBS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3 為引物 GretlFa、GretlRb, VinelRa, TvvlFa 的 IRAP-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式材料本發(fā)明選取3組親本葡萄品種及其對(duì)應(yīng)的早熟芽變葡萄品種，均來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，見(jiàn)表I。表13組葡萄品種
序號(hào)(親本葡萄品種一芽變葡萄品種)名稱(chēng)(親本葡萄品種一芽變葡萄品種)
15—163京亞一洛浦早生
~18—100巨峰一98-2
~162—161乍娜一90-1實(shí)施例1、DNA的提取I、將研缽預(yù)冷后，加入少量液氮，并充足預(yù)冷；2、取-20°C預(yù)冷的新鮮完好干凈葉片3g放入研缽中，加入半藥勺聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和適量液氮，研磨至細(xì)粉，裝入離心管，-20°C冷藏30min ;3、配制 CTAB 提取緩沖液稱(chēng)取 CTAB 2g 加蒸餾水 40ml，IM Tris_cl(pH8. 0)10ml，
0.5M EDTA (pH 8. 0)4ml和5M NaCl 28ml，待CTAB溶解后用蒸餾水定容到100ml，加熱，至沸騰后再加入2%的P -巰基乙醇；4、將熱的CTAB提取緩沖液裝入步驟2)的離心管中，每管5ml，并將葉片組織均勻分散在緩沖液中，然后放入65°C的恒溫水浴鍋中90min，每隔5min輕輕顛倒搖勻一次；5、取出離心管，冷卻至室溫，加入等體積的氯仿異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻使混合物成乳濁狀，4000r/m離心IOmin ；6、取上清液，加入等體積的氯仿異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻使混合物成乳濁狀，4000r/m離心IOmin ；7、取上清液，加入2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，搖勻，-20°C靜置2h ；8、取出并在 4°C下 4000r/m 離心 IOmin ；
9、棄上清液，加入70%乙醇蓋住沉淀，漂洗2次再加入70%乙醇，4°C靜置5h ；10、棄乙醇，風(fēng)干5h，每管加入300 u LTE緩沖液，充分溶解后，每管加入5 y L的RNase，在37°C的恒溫水浴鍋中水浴7h，得到葡萄植株的DNA。實(shí)施例2、iPBS-PCR 擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系及程序參考Kalendar等，如表2、表3所示，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，如表4所示。表2iPBS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種葡萄芽變的快速區(qū)分方法，其特征在于，包括以下步驟提取親本葡萄植株及對(duì)應(yīng)的疑似芽變葡萄植株的DNA，用iPBS弓丨物分別對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分芽變，親本及疑似芽變品種電泳條帶有差異，疑似芽變品種為芽變。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種葡萄芽變的快速區(qū)分方法，其特征在于，所述的提取葡萄植株的DNA可以從葡萄植株的葉片、根、莖、果實(shí)或花中提取。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種葡萄芽變的快速區(qū)分方法，其特征在于，所述的葡萄植株的DNA提取方法，包括以下步驟 1)研缽預(yù)冷后，放入葉片、聚乙烯基吡咯烷酮和液氮，研磨成細(xì)粉放入離心管并-20°C冷藏30min ； 2)將熱的CTAB提取緩沖液裝入步驟I)的離心管中，使葉片組織均勻分散在緩沖液中，65°C水浴90min,每隔5min輕輕顛倒搖勻一次； 3)將步驟2)的離心管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻，4000r/m離心IOmin ； 4)取上清液，加入等體積的氯仿異戊醇體積比為24:1的混合溶液，搖勻，4000r/m離心 IOmin ； 5)取上清液，加入2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，搖勻，-20°C靜置2h，4°C下4000r/m離心IOmin ； 6)棄上清液，加入70%乙醇蓋住沉淀，漂洗2次再加入70%乙醇，4°C靜置5h； 7)棄乙醇，風(fēng)干5h，每管加入300μ LTE緩沖液，充分溶解后，加入5μ L的RNase，37°C水浴7h，得到葡萄植株的DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種葡萄芽變的快速區(qū)分方法，其特征在于，所述的iPBS引物是序列表SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3或SEQ ID N0:4的核苷酸序列的引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種葡萄芽變的快速區(qū)分方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增體系包括無(wú)菌 ddH20、I XBuffer、2. Ommol · L 1Mg2^O. 3mmol · L MNTPs、。· I μ mo I .L1SI物、DNA1.0ng/yL、Taq 酶 0.05U · μ L'
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種葡萄芽變的快速區(qū)分方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增程序是94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，72°C充分延伸lOmin，其中，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)30次。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種葡萄芽變的快速區(qū)分方法，包括以下步驟提取親本葡萄植株及對(duì)應(yīng)的疑似芽變葡萄植株的DNA，用iPBS引物分別對(duì)DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分芽變，親本及疑似芽變品種電泳條帶有差異，疑似芽變品種為芽變。本發(fā)明以3組早熟芽變葡萄品種為原料，利用iPBS分子標(biāo)記有效區(qū)分了芽變葡萄品種，同時(shí)本發(fā)明無(wú)需預(yù)知反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的相關(guān)序列，具有較強(qiáng)的通用性，為有效選擇變異奠定了理論基礎(chǔ)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、用途廣泛，節(jié)約了大量的人力和物力，便于推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102965434SQ201210446959
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者郭大龍, 張國(guó)海, 侯小改, 張瀟玉, 郭明曉 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)