專利名稱：利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽 CecropinB2 的方法。
背景技術：
抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物體內(nèi)經(jīng)誘導產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，具有廣譜抗菌活性，對細菌有很強的殺傷作用，尤其是對某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了人們的重視。隨著生物科技不斷發(fā)展，抗菌肽作為新型抗生素及新型藥物，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等領域發(fā)揮著重要作用。至今為止，已從自然生物中分離得到上千種抗菌肽，其中ceCTopins類抗菌肽是目前研究最清楚、效果最顯著的抗菌肽，已發(fā)現(xiàn)有A、B、C、D、E五種結構，這類抗菌肽還具有耐酸，耐熱，耐堿以及不易產(chǎn)生耐藥性等特點， 在微生物，動植物方面有廣泛應用。
近年來，Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)得到廣泛應用，該系統(tǒng)根據(jù)F因子載體的原理，改變了傳統(tǒng)的昆蟲重組桿狀病毒的構建方法，構建一種新桿狀病毒穿梭載體Bacmid， 該系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢(1)重組率有顯著提高，幾乎可達100% (2)通過藍白斑篩選重組病毒有篩選優(yōu)勢，不會產(chǎn)生野生型和非重組型病毒污染的問題，也不再需要傳統(tǒng)繁瑣的空斑篩選分析來純化重組病毒(3)大大地縮短了重組病毒構建所需要的時間，可以由原來的4-6 周或更長減少到僅7-10天。因此，該技術可以快速、同時產(chǎn)生多種重組病毒。這是一種最快速簡捷地生產(chǎn)重組病毒的方法。
隨著抗生素的大量廣泛用于飼料中和人們對食品和環(huán)境質(zhì)量的要求越來越高，人們對抗生素的副作用認識日益加深，而抗菌肽具廣譜抗菌作用，對畜禽具促生長、保健和治療疾病的功能，屬無毒副作用、無殘留、無致細菌耐藥性的一類環(huán)保型制劑?？蓱蒙锕こ痰募夹g方法生產(chǎn)抗病菌的轉(zhuǎn)基因動植物產(chǎn)品，同時可以通過基因工程的技術方法大量的表達抗菌肽，使之成為新一代肽類抗菌藥的來源，具有出廣闊的應用前景。
利用家蠶桿狀病毒作為表達載體時，應用最多的是將外源目的基因替代polh基因，利用Pph帶動目的基因高效表達。產(chǎn)生的重組病毒由于沒有多角體蛋白外殼的保護，只能通過皮下注射的方式接種家蠶，導致效率低下，因此可利用雙啟動子表達載體構建可同時表達polh基因和BmCecB2基因的表達載體，獲得的重組病毒，可經(jīng)口接種家蠶，在家蠶體中表達抗菌肽，此方法與人工皮下注射家蠶相比，其優(yōu)點省時省力，提高了生產(chǎn)效率，有利于規(guī)?；a(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法。
本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)的。
一種利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽Cecr0pinB2的方法， 步驟包括
將如序列表所示BmCecB2基因及polh基因分別克隆到啟動子表達載體以構建重組雙啟動子表達載體；將重組雙啟動子表達載體轉(zhuǎn)化到DHlOBac感受態(tài)細胞中，提取質(zhì)粒， 獲得重組穿梭載體Bacmid ；Bacmid在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細胞,獲得重組病毒多角體；重組病毒多角體定量后以經(jīng)口接種五齡家蠶幼蟲的方式，在家蠶幼蟲中表達， 獲得具有抑菌活性的抗菌肽。
進一步地，上述雙啟動子表達載體為pFastBacDUAL。
進一步地，上述BmCecB2基因及polh基因分別插入雙啟動子表達載體 pFastBacDUAL的PplO和Pph的MCS的下游處構建重組雙啟動子表達載體。
進一步地,上述重組穿梭載體Bacmid是通過將mini_Tn7轉(zhuǎn)座子從雙啟動子表達載體轉(zhuǎn)位到穿梭載體Bacmid上mini_attTn7祀位點,得到Gen抗性,再通過通過涂布于含有Kan，Gen, Tet, IPTG，X-gal的LB平板上進行藍白斑篩選，挑選白斑過夜振蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取獲得的。
進一步地，上述在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導是指重組Bacmid及脂質(zhì)體，分別加入無血清的Bm細胞培養(yǎng)基，將兩種溶液混勻，室溫靜置，另取生長良好的Bm細胞，加入無血清的 Bm細胞培養(yǎng)基及重組Bacmid/脂質(zhì)體復合物，培養(yǎng)一段時間，吸掉上清,加入含有10%血清的Bm細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察。
進一步地，上述定量的重組病毒多角體的濃度為2X107NPB/ml。
進一步地，上述重組病毒多角體的添食量為每頭蠶7 μ I。
本發(fā)明的有益效果
利用雙啟動子表達載體，在家蠶Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)中獲得的重組病毒，可經(jīng)口添食家蠶，使家蠶抗菌肽Cecropin B基因在家蠶體中表達，與人工注射家蠶相比，省時省力，提高了生產(chǎn)效率。由于桿狀病毒宿主域僅限于家蠶，不會感染其他動物，因此，高效表達抗菌肽后，可以將蠶體磨粉后添加到飼料中，無需純化，作為飼料添加劑，有望成為替代抗生素的產(chǎn)品之一，具有很好的市場應用前景。


圖1為本發(fā)明利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽Cecr0pinB2 的方法的流程示意圖2為重組雙啟動子pFastBac Dual表達載體的示意圖3為BmCecB2基因及polh基因表達產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE檢測示意圖；其中M為蛋白質(zhì)分子標準，Γ2分別為正常家蠶第六天和第七天的血液，3 4分別為經(jīng)口添食重組病毒的家蠶第六天和第七天的血液，5飛分別為經(jīng)口舔食野生型桿狀病毒的家蠶第六天和第七天的血液，箭頭所指為目的條帶；
圖4為BmCecB2抑菌活性檢測示意圖2分別為添食重組病毒的家蠶第六天和第七天的血液,3為添食野生型病毒的家蠶血液，4為正常家蠶的血液，5表示Amp，6表示無菌水。
具體實施方式
下面根據(jù)附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
本發(fā)明的整體的方法流程如圖1所示。
實施例1
(I)構建雙啟動子表達載體分別以合成好的PET-32a-BmCecB2和野生型病毒株基因組DNA為模板，合成BmCecB2基因及polh基因，分別插入到雙啟動子表達載體 pFastBacDUAL的PplO和Pph的MCS的下游,設計合成引物如下
CecB-F (5，-CATGCCATGGCGCCGGAACCGCGTTGGAAA-3，)
CecB-R(5’ ~CGGGGTACCTCATTATTTACCGATGGCTTTCG~3，)
Polh-F (5，~CGCGGATCCATGCCGAATTATTCATACA~3，)，
Polh-R(5’-CCCAAGCTTTTAATACGCCGGACCAGTGAACAG-3，)
插入的酶切位點為，BmCecB2(Nco Ι/Κρη I), polh (BamH I/Hind III)
(2)重組穿梭載體Bacmid :用上述雙啟動子表達載體轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細胞， 將已構建好的重組雙啟動子表達載體轉(zhuǎn)化到E. coli DHlOBac感受態(tài)細胞中，37°C振蕩培養(yǎng) 4h,重組穿梭載體Bacmid是通過將mini_Tn7轉(zhuǎn)座子從雙啟動子表達載體轉(zhuǎn)位到穿梭載體 Bacmid上min1-attTn7祀位點而產(chǎn)生的，并且得到了 Gen抗性。通過涂布于含有Kan,Gen, Tet, IPTG，X-gal的LB平板上進行藍白斑篩選。挑選白斑過夜振蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取重組穿梭載體Bacmid,用M13引物進行PCR驗證。重組雙啟動子pFastBac Dual表達載體如圖2所示。
注PCR反應體系(25 μ L 反應體系)10 X Taq Buffer 2. 5 μ I, dNTPs1. 5 μ 1，混合引物(M13F+M13R) I μ I, Taq polymerase 0. 2 μ I, ddH20 up to25 μ I,模板(rBacmid) I μ I。
PCR 擴增條件93°C預變性 3min，94°C變性 45s，55°C 復性 45s，72°C延伸 4min，進行35個循環(huán)。
(3)獲得重組病毒
取重組穿梭載體Bacmid(7 10 μ g)及脂質(zhì)體8 μ I,并分別加入無血清的Bm細胞培養(yǎng)基補充體積至100 μ 1，將兩種溶液混勻，室溫靜置20min，另取生長良好的Bm細胞，用無血清的Bm細胞培養(yǎng)基洗2 3次，再加入800 μ I無血清的Bm細胞培養(yǎng)基及準備好的重組 Bacmid/脂質(zhì)體復合物200 μ 1，28°C培養(yǎng)3 5h后，吸掉上清，加入2ml含有10%血清的Bm 細胞培養(yǎng)基，28°C繼續(xù)培養(yǎng)60h后，在顯微鏡下觀察Bm細胞是否有感染的癥狀，吸取細胞上清，獲得重組病毒粒子，復感家蠶細胞，獲得重組病毒。
(4)家蠶抗菌肽Cecropin B2在家蠶體中表達
將重組病毒液定量至2X 107NPB/ml并準備五齡第一天的家蠶幼蟲，第一區(qū)經(jīng)口添食重組病毒液，每頭蠶添食7 μ 1，分別以相同濃度的野生型桿狀病毒和飼水區(qū)作為對照。每天觀察家蠶的感染情況，并分別在第6天，第7天后收集蠶血，純化多角體，并從中抽提病毒 DNA，PCR 驗證(引物為 CecB-F/CecB-R)。
實施例2
家蠶抗菌肽Tricine-SDS-PAGE 鑒定
樣品處理取感染的家蠶血液,放入100°C煮 沸5min, IlOOOrpm離心5min,上清加 2X上樣緩沖液(4%SDS，12%甘油，50mM Tris, 2%巰基乙醇，O. 01%溴酚藍，6M Hcl調(diào)PH調(diào)到6. 8)，煮沸5分鐘。
Tricine-SDS-PAGE :制備15%濃度的分離膠(尿素)，10%濃度的中間膠及4%的濃縮膠；樣品處理后上樣電泳，固定液(50%甲醇，10%醋酸)固定30min，考馬斯亮藍染色lOmin， 再用脫色液脫色。
Tricine-SDS-PAGE檢測結果如圖3所示，其中polh蛋白的分子量為29KD， BmCecB2分子量為4.9KD。分析結果說明多角體與家蠶抗菌肽cecropin B均得到了表達。
實施例3
家蠶抗菌肽Cecropin B抑菌活性檢測
取家蠶血液，經(jīng)超聲破碎細胞后離心取上清，進行瓊脂糖孔穴擴散實驗。將大腸桿菌懸浮液(0D_=0. 3) 400 μ 1，與55°C的LB固體培養(yǎng)基IOOmL混勻后鋪平板待其凝固后，用滅過菌的打孔器(直徑5mm)打孔，孔中滴加200ul待測的表達上清，37°C培養(yǎng)16h，以同體積的滅菌水為陰性對照，Amp為陽性對照，第2天測量抑菌直徑。根據(jù)抑菌圈的大小判定抗菌肽的活性。
活性檢測結果如圖4所示，結果表明家蠶 抗菌肽cecropin B基因在家蠶體內(nèi)得到表達，有明顯的抑菌活性，抑菌直徑為10_，以Amp (100mg/ml)和無菌水作為陰性和陽性對照，通過加樣正常家蠶的血液和添食野生型病毒的家蠶血液排除本底水平表達。
上述實施例只為說明本發(fā)明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此領域技術的人士能夠了解本發(fā)明內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽Cecr0pinB2的方法，其特征在于，步驟包括將如序列表所示BmCecB2基因及polh基因分別克隆到啟動子表達載體以構建重組雙啟動子表達載體；將重組雙啟動子表達載體轉(zhuǎn)化到DHlOBac感受態(tài)細胞中，提取質(zhì)粒，獲得重組穿梭載體Bacmid ；Bacmid在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細胞,獲得重組病毒多角體；重組病毒多角體定量后以經(jīng)口接種五齡家蠶幼蟲的方式，在家蠶幼蟲中表達，獲得具有抑菌活性的抗菌肽。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法,其特征在于,所述雙啟動子表達載體為pFastBacDUAL。
3.根據(jù)權利要求2所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法，其特征在于，所述BmCecB2基因及polh基因分別插入雙啟動子表達載體pFastBacDUAL的Pp 10和Pph的MCS的下游處構建重組雙啟動子表達載體。
4.根據(jù)權利要求1所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法,其特征在于,所述重組穿梭載體Bacmid是通過將mini_Tn7轉(zhuǎn)座子從雙啟動子表達載體轉(zhuǎn)位到穿梭載體Bacmid上mini_attTn7祀位點,得到Gen抗性,再通過通過涂布于含有Kan，Gen, Tet, IPTG，X-gal的LB平板上進行藍白斑篩選，挑選白斑過夜振蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取獲得的。
5.根據(jù)權利要求1所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法,其特征在于,所述在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導是指重組Bacmid及脂質(zhì)體,分別加入無血清的Bm細胞培養(yǎng)基，將兩種溶液混勻，室溫靜置，另取生長良好的Bm細胞，加入無血清的Bm細胞培養(yǎng)基及重組Bacmid/脂質(zhì)體復合物，培養(yǎng)一段時間，吸掉上清,加入含有10%血清的Bm細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察。
6.根據(jù)權利要求1所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法，其特征在于，所述定量的重組病毒多角體的濃度為2X107NPB/ml。
7.根據(jù)權利要求1所述的利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法，其特征在于，所述重組病毒多角體的添食量為每頭蠶7 μ I。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法。步驟包括將BmCecB2基因及polh基因分別克隆到啟動子表達載體以構建重組雙啟動子表達載體；將重組雙啟動子表達載體轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細胞中，提取質(zhì)粒，獲得重組穿梭載體Bacmid；Bacmid在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細胞，獲得重組病毒多角體；重組病毒多角體定量后以經(jīng)口接種五齡家蠶幼蟲的方式，在家蠶幼蟲中表達，獲得具有抑菌活性的抗菌肽本發(fā)明的有益效果在于經(jīng)口添食家蠶，使家蠶抗菌肽Cecropin B基因在家蠶體中表達，與人工注射家蠶相比，省時省力，提高了生產(chǎn)效率。
文檔編號C12N15/866GK102994551SQ201210504848
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權日2012年11月30日
發(fā)明者徐家萍, 李昕琦, 杜暢, 王文兵, 高娟, 王成林 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學