來源于強(qiáng)烈火焰菌的小熱激蛋白hsp基因、表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種來源于強(qiáng)烈火焰菌的小熱激蛋白HSP基因、表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用。所述基因的堿基序列如SEQ?ID?No1所示，通過構(gòu)建包含該基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體，經(jīng)試驗(yàn)表明，該HSP基因能夠在梭菌中穩(wěn)定高效表達(dá)，有效提高了梭菌對(duì)丁醇的耐受性。同時(shí)，利用厭氧發(fā)酵，還表明該HSP基因能夠大幅度提高梭菌的產(chǎn)丁醇能力。
【專利說明】來源于強(qiáng)烈火焰菌的小熱激蛋白HSP基因、表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種來源于強(qiáng)烈火焰菌(Pyrococcus furiosus)的小熱激蛋白HSP基因、包含該基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，以及它們?cè)谔岣咚缶亩〈寄褪苄院退缶〈籍a(chǎn)量中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]上世紀(jì)70年代的石油危機(jī)，促使人們重新認(rèn)識(shí)到丙酮-丁醇發(fā)酵工業(yè)的重要性，開發(fā)利用可再生能源由此成為許多國(guó)家提高能源安全、減排溫室氣體、應(yīng)對(duì)氣候變化的重要措施。目前市場(chǎng)上的生物燃料以燃料乙醇和生物柴油最為常見。生物丁醇作為一種重要的化工原料，是一種極具潛力的第二代新型生物燃料(Durre2007, Biotechnol J), 丁醇比乙醇作為生物燃料具有如下眾多優(yōu)勢(shì):1)能量含量高，與乙醇相比可多走30%的路程；2)丁醇的揮發(fā)性只有乙醇的1/6倍，汽油的1/13.5，與汽油混合對(duì)水的寬容度大，對(duì)潮濕和低水蒸氣壓力有更好的適應(yīng)能力；3) 丁醇可在現(xiàn)有燃料供應(yīng)和分銷系統(tǒng)中使用，而乙醇則需要通過鐵路、船舶或貨車運(yùn)輸；4)與其他生物燃料相比，腐蝕性較小，比乙醇、汽油安全；5)與現(xiàn)有的生物燃料相比，生物丁醇與汽油的混合比更高，無需對(duì)車輛進(jìn)行改造，就可以使用幾乎100%濃度的丁醇，而且混合燃料的經(jīng)濟(jì)性更高；6) 丁醇可以通過不消耗糧食、不占用耕地、不增加環(huán)境壓力為前提下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。如果丁醇占生物燃料市場(chǎng)的20%，全球市場(chǎng)將超過200億美元。
[0003]2006年,美國(guó)杜邦(Dupont)公司和英國(guó)石油(BP)公司聯(lián)合宣布建立合作伙伴關(guān)系，共同開發(fā)生產(chǎn)并向市場(chǎng)推出新一代生物燃料一生物丁醇，以滿足全球日益增長(zhǎng)的燃料需求。BP公司從2008年開始利用丙酮-丁醇發(fā)酵梭菌進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)，目標(biāo)是在2010年利用進(jìn)一步改進(jìn)的方法生產(chǎn)丁醇。美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究所(USDA-ARS) 2004年立項(xiàng)利用拜氏梭菌轉(zhuǎn)化纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)生物丁醇，2009年完成。美國(guó)綠色生物有限公司(GBL)和專業(yè)級(jí)公司EKB公司合作，投資85.5萬歐元?jiǎng)?chuàng)新丁醇發(fā)酵工藝技術(shù)，計(jì)劃開發(fā)生產(chǎn)生物燃料丁醇用于交通運(yùn)輸，將其生產(chǎn)成本降低。
[0004]早期的丁醇發(fā)酵工業(yè)因其成本高，不敵于石油化工產(chǎn)品而衰落，這也是當(dāng)今限制其大規(guī)模發(fā)展的瓶頸所在。造成丁醇發(fā)酵成本高的主要原因是傳統(tǒng)丁醇發(fā)酵產(chǎn)量、產(chǎn)率低，以及丁醇對(duì)菌體的毒害作用。因此，目前世界各國(guó)正在投入大量資金和技術(shù)用于提高丁醇發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)量和產(chǎn)率，以降低丁醇規(guī)模化生產(chǎn)的成本。
[0005]大多數(shù)微生物通過3種途徑來應(yīng)對(duì)有毒物質(zhì)脅迫，第一種方法是通過改變細(xì)胞膜的組份來緩解有毒物質(zhì)的傷害；第二種方法為泵出有毒物質(zhì)，一旦前兩種失效，細(xì)菌還可以在細(xì)胞內(nèi)直接降解有毒物質(zhì)。細(xì)菌在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，發(fā)展了一套針對(duì)有毒物質(zhì)的應(yīng)答系統(tǒng)，一旦接觸有毒物質(zhì)，就能誘導(dǎo)一些基因的表達(dá)，熱激蛋白(HSPs)就是最常見的誘導(dǎo)蛋白。熱激蛋白作為分子伴侶，在蛋白的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和折疊上均起重要作用。家族I熱激蛋白在外來脅迫下，可以保護(hù)蛋白，使之能夠正常折疊(俞峻1998，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展)。[0006]HSP屬于應(yīng)急反應(yīng)性蛋白，高溫應(yīng)激可誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)形成。HSP是分子伴侶的一種，在蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程中，起到促進(jìn)需要折疊的多肽鏈折疊為天然空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)。對(duì)大腸桿菌中蛋白質(zhì)折疊的研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中參與蛋白質(zhì)折疊的HSP包括HSP70, HSP40和GreE三族。其中HSP70有基因dna K編碼，故HSP70又被稱為Dna K。它有兩個(gè)主要功能域:一個(gè)是存在于N-端的高度保守的ATP酶結(jié)構(gòu)域，能結(jié)合和水解ATP ;另一個(gè)是存在于C-端的多肽鏈結(jié)合域。蛋白質(zhì)的折疊需要這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的相互作用。
[0007]HSP促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的基本過程是HSP70反應(yīng)循環(huán)，在大腸桿菌中，Dna J首先與未折疊或部分折疊的多肽鏈結(jié)合，將多肽鏈導(dǎo)向Dna K-ATP復(fù)合物，并與Dna K結(jié)合。DnaJ激活Dna K的ATP酶，使其水解ATP生成ADP，產(chǎn)生穩(wěn)定的Dna J-Dna K-ADP-多肽復(fù)合物。在Grp E的作用下，ATP與復(fù)合物中的ADP交換，使復(fù)合物變?yōu)椴环€(wěn)定而迅速解離，釋放出被完全折疊或完成部分折疊的蛋白質(zhì)，其中尚未完成折疊的蛋白質(zhì)既可以進(jìn)入新一輪HSP70反應(yīng)循環(huán)，又可以進(jìn)入Gro EL反應(yīng)循環(huán)，最后完成折疊過程(張玉秀1999，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展)。
[0008]熱應(yīng)激蛋白(HSPs)普遍存在于從細(xì)菌到高等真核生物包括人的整個(gè)生物界，可以被氨基酸類似物、重金屬離子、病毒感染等多種逆境因素誘導(dǎo)。HSPs賦予細(xì)胞或生物從各種應(yīng)激中恢復(fù)的能力，并保護(hù)它們免遭逆境因素的損害。其中表現(xiàn)最為明顯的是熱耐受能力的形成，即當(dāng)細(xì)胞或生物接觸非致死溫度后，表現(xiàn)對(duì)致死溫度的存活率明顯提高。利用這點(diǎn)，我們可以開發(fā)出原來不夠耐受熱的生物使它更加耐受熱源。同樣可以使不夠耐受低溫的生物更加耐受低溫。
[0009]由于丁醇分子的極性性質(zhì)，其與梭菌的細(xì)胞膜相互作用抑制了梭菌的跨膜運(yùn)輸系統(tǒng)及其酶活，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解，正是由于丁醇的這種毒性嚴(yán)重抑制了發(fā)酵的順利進(jìn)行。因此，導(dǎo)致發(fā)酵總?cè)軇┝康貌坏教岣撸〈籍a(chǎn)量更是不足。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種來源于強(qiáng)烈火焰菌的小熱激蛋白HSP基因(PfHSPS)、表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中的不足。
[0011]本發(fā)明在不改變氨基酸序列的前提下，按照梭菌的偏愛密碼合成來自強(qiáng)烈火焰菌(Pyrococcus furiosus)的小熱激蛋白HSP基因(Genbank AF256212),并設(shè)計(jì)引物，利用PTDS方法(Xiong2004，Nucleic Acids Res)人工合成并克隆該基因，經(jīng)序列測(cè)定，其堿基序列如SEQ ID NOl所示，命名為PfHSPS基因。
[0012]然后，本發(fā)明又構(gòu)建了包含上述PfHSPS基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體PPFHSP，從而利用該表達(dá)載體中的來自梭菌CAC2546基因(NC_003030 )的啟動(dòng)子控制PfHSPS基因的表達(dá)，利用來自枯草桿菌168 (ATCC)的PYK基因(NC_000964)終止子終止該P(yáng)fHSPS的轉(zhuǎn)錄。
[0013]所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體是以pS0S94載體(Desail999,Appl EnvironMicrobiol)為基礎(chǔ)載體，將氯霉素抗性基因表達(dá)單元，梭菌CAC2546基因(NC_003030)啟動(dòng)子,PfHSPS基因的開放閱讀框和枯草桿菌pyruvate kinase (PYK, NC_000964)基因終止子(PYK)連接后替換pS0S94載體中的ctfAB及abc表達(dá)單元構(gòu)建而成的，該載體約6720bp。具體構(gòu)建方法如下:[0014]從pXYP251 (GenBank登錄號(hào)AY178046，含有中等強(qiáng)度原核PGm啟動(dòng)子和終止子為T1T2)載體中擴(kuò)增氯霉素表達(dá)單元。引物為cml:5’ -AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’ ；cm2:5’ -TCTAGATATA CGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3’。擴(kuò)增條件:94°C 30s,60°C 30s, 72°C 60s ；25 循環(huán)。
[0015]從梭菌C.acetobutylicum ATCC824 (美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，US7432090)中擴(kuò)增 CAC2546 基因啟動(dòng)子。引物為 cac 1:5 ’ -TCTAGAAAAGGAAAATATGATAAAAAATTTCA-3 ’ ；cac2:5，-GGATCCTAATATCGAAAATAG CTTAAAC-3，。擴(kuò)增條件:94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25循環(huán)。
[0016]從枯草桿菌Bacillus subtilis 168 (ATCC)基因中擴(kuò)增PYK終止子。引物為pykl:5 ’-GAGCTCTTACAGGTGAAMTGGAAGGGGA-3，；pyk2:5，-CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACA GGCGCCG-3，。擴(kuò)增條件:94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25 循環(huán)。
[0017]將上述三個(gè)PCR擴(kuò)增片斷回收后，平端連接，克隆并測(cè)序。獲得測(cè)序正確的基因，將氯霉素表達(dá)單元用HindIII和XbaI雙酶切；CAC2546基因啟動(dòng)子用BamHI和Xba I雙酶切;本發(fā)明的PfHSPS基因BamHI和Sac I雙酶切;枯草桿菌Bacillus subtilisl68(ATCC)的PYK基因終止子Nde I和Sac I雙酶切后依次克隆到pCAMBIA1301載體(http://www.cambia.0rg)。
[0018]克隆后將獲得的氯霉素表達(dá)單元、CAC2546基因啟動(dòng)子、PfHSPS基因和枯草桿菌PYK基因終止子整體替換PS0S94載體中的CtfAB及abc表達(dá)單元，即獲得含有本發(fā)明的PfHSPS基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體pPHlSP。
[0019]利用電擊法將上述含有PfHSPS基因的梭菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體導(dǎo)入梭菌中，通過紅霉素篩選轉(zhuǎn)化子，利用含丁醇培養(yǎng)基驗(yàn)證了本發(fā)明合成的PfHSPS基因能夠在梭菌中穩(wěn)定聞效表 達(dá)，提聞了梭菌對(duì)丁醇的耐受:性。
[0020]同時(shí)，本發(fā)明還利用厭氧發(fā)酵，驗(yàn)證了所述PfHSPS基因?qū)λ缶岣叨〈及l(fā)酵產(chǎn)量的能力。試驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明的PfHSPS基因能夠大幅度提高梭菌的產(chǎn)丁醇能力，較原始圃種提聞了 29.2%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為含有PfHSPS基因的梭菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建圖譜。
[0022]圖2為HSP轉(zhuǎn)化子和原始菌種丁醇耐受性比較。
[0023]圖3和圖4為HSP轉(zhuǎn)化子和原始菌種發(fā)酵后產(chǎn)物和生長(zhǎng)情況比較。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1來自強(qiáng)烈火焰菌(Pyrococcus furiosus)的小熱激蛋白HSP基因的合成
[0025]在不改變氨基酸序列的前提下，按照梭菌偏愛密碼子合成來自強(qiáng)烈火焰菌(Pyrococcus furiosus)的HSP基因(Genbank AF256212),設(shè)計(jì)引物，并人工合成。引物如下，引物長(zhǎng)度為50-60bp。
[0026]Pfhsp1:GGATCCATGGTTAGAAGAATTAGAAGATGGGATATTTGGGACCCATTTGATCTTATTAGA
[0027]Pfhsp2:AAAATTCATCAAACATTGCATCAATTTCCTCTTGAATTTCTCTAATAAGATCAAATGGGT
[0028]Pfhsp3:TGCAATGTTTGATGAATTTTTTAGTAGACCAAGACTTTGGACTTATAGAAGATGGAGTGA[0029]Pfhsp4:TCTCCAAACTTCTCCAACTCTCTCTTCATACATTGCTGGTTCACTCCATCTTCTATAAGT
[0030]Pfhsp5:GAGTTGGAGAAGTTTGGAGAGAACCATTTGTTGATATTTTTGATAATGGAGATGAGTTTG[0031 ] Pfhsp6:ATATCTTCTTTTCTAACTCCTGGAAGTTCTGCTGTAATAACAAACTCATCTCCATTATCA
[0032]Pfhsp7:GGAGTTAGAAAAGAAGATATTAAAGTTAGAGTTACTGAGGATACTGTTTATATTGAGGCA
[0033]Pfhsp8:CTGCTCCTTCTCTTTCAAGTTCTTTCTCTCTCTTAACAGTTGCCTCAATATAAACAGTAT
[0034]Pfhsp9:ACTTGAAAGAGAAGGAGCAGTTAGAATTGAGAGATATTTTACTGGTTATAGAAGAGCTAT
[0035]pfhsplO:TGCCTTTGCCTTCTCTGGAATAACTTCTTCTGGAAGTCTAATAGCTCTTCTATAACCAGT
[0036]pfhspll:TTCCAGAAGAAGTTATTCCAGAGAAGGCAAAGGCAAAGTATAATAATGGAGTTCTTGAGA
[0037]pfhspl2:TCACTCTCCTTCTTAGTTGGATGCTTCTTTGGAACTCTAATCTCAAGAACTCCATTATTA
[0038]pfhspl3:GAGCTCTTATTCAACTTTAACTTCAAATCCTTCACTCTCCTTCTTAGTTGG
[0039]利用PCR進(jìn)行強(qiáng)烈火焰菌HSP擴(kuò)增，在100 μ I反應(yīng)體系中，pfhsp2~pfhspl2共11個(gè)引物的添加量為2ng，外側(cè)引物pfhspl和pfhspl3添加量為30ng，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)熱Imin -M0C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s，共 25 個(gè)循環(huán)后，72°C延伸 lOmin，使用的 Taq DNA 聚合酶為KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)。
[0040]PCR結(jié)束后，1%瓊脂糖膠回收，取10 μ I直接與Sma I酶切的pUC18載體平端相連。16°C連接lh，高效轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)中。獲得陽性克隆，并進(jìn)行序列測(cè)定，其堿基序列如SEQ IDNO I所示，該陽性克隆即為本發(fā)明的小熱激蛋白HSP基因，命名為PfHSPS基因。
[0041]實(shí)施例2含有PfHSPS基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建
[0042]以pS0S94 載體(Desail999, Appl Environ Microbiol)為基礎(chǔ)載體,將氯霉素抗性基因表達(dá)單元，梭菌CAC2546基因(NC_003030)啟動(dòng)子，實(shí)施例1得到的PfHSPS基因的開放閱讀框和枯草桿菌pyruvate kinase (PYK, NC_000964)基因終止子(PYK)連接后替換PS0S94載體中的ctfAB及abc表達(dá)單元，構(gòu)建由強(qiáng)啟動(dòng)子控制的含有PfHSPS基因表達(dá)單元的梭菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體ρΡΠΒΡ(參看圖1)，該載體約6720bp。具體構(gòu)建步驟如下:
[0043]從pXYP251 (GenBank登錄號(hào)AY178046，含有中等強(qiáng)度原核PGm啟動(dòng)子和終止子為T1T2)載體中擴(kuò)增氯霉素表達(dá)單元。引物為cml:5’ -AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’ ；cm2:5’ -TCTAGATATA CGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3’。擴(kuò)增條件:94°C 30s,60°C 30s, 72°C 60s ；25 循環(huán)。
[0044]從梭菌C.acetobutylicum ATCC824 (美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，US7432090)中擴(kuò)增 CAC2546 基因啟動(dòng)子。引物為 cac 1:5 ’ -TCTAGAAAAGGAAAATATGATAAAAAATTTCA-3 ’ ；cac2:5，-GGATCCTAATATCGAAAATAG CTTAAAC-3，。擴(kuò)增條件:94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25循環(huán)。
[0045]從枯草桿菌Bacillus subtilisl68 (ATCC)基因中擴(kuò)增PYK終止子。引物為pyk1:5’ -GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3，；pyk2:5，-CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACA GGCGCCG-3，。擴(kuò)增條件:94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25 循環(huán)。 [0046]將上述三個(gè)PCR擴(kuò)增片斷回收后，平端連接，克隆并測(cè)序。獲得測(cè)序正確的基因，將氯霉素表達(dá)單元用HindIII和XbaI雙酶切；CAC2546基因啟動(dòng)子用BamHI和Xba I雙酶切；實(shí)施例1得到的PfHSPS基因BamHI和Sac I雙酶切;枯草桿菌Bacillus subtilisl68(ATCC)的PYK基因終止子Nde I和Sac I雙酶切后依次克隆到pCAMBIA1301載體(http://www.cambia.0rg)。
[0047]克隆后將獲得的氯霉素表達(dá)單元、CAC2546基因啟動(dòng)子、PfHSPS基因和枯草桿菌PYK基因終止子整體替換PS0S94載體中的CtfAB及abc表達(dá)單元，即獲得本發(fā)明的含有PfHSPS基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體pPHlSP。
[0048]實(shí)施例3轉(zhuǎn)化質(zhì)粒處理及轉(zhuǎn)化方法
[0049]上述實(shí)施例2構(gòu)建的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體pPFHSP含有氨芐青霉素和紅霉素抗性，可以在大腸桿菌中復(fù)制，又可以通過紅霉素篩選轉(zhuǎn)化的梭菌。將該穿梭表達(dá)載體利用pANl質(zhì)粒上(Mermelsteinl993, Appl Environ Microbiol)的甲基化酶甲基化,其含有來自枯草桿菌的S3T甲基轉(zhuǎn)移酶基因，可以實(shí)現(xiàn)梭菌載體的甲基化保護(hù)，從而避免質(zhì)粒在梭菌中被Cac824I限制性內(nèi)切酶切段，因?yàn)樵撁盖形稽c(diǎn)在梭菌中廣泛存在。
[0050]用于質(zhì)粒擴(kuò)增的大腸桿菌必須要采用甲基化酶缺失的菌種，因?yàn)楫?dāng)將某些胞嘧啶甲基化的DNA轉(zhuǎn)化到常見的E.coli菌株中時(shí)，轉(zhuǎn)化效率會(huì)明顯降低。原因可能來自于E.coli自身的限制系統(tǒng)。本發(fā)明利用了甲基化酶mcrBC缺失的菌種(T0P10, Invitrogen,Carlsbad, CA，USA)作為質(zhì)粒擴(kuò)增的大腸桿菌菌種。
[0051]將pANl和上述構(gòu)建的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化到T0P10菌種中，利用抗氯霉素(CM)和抗氨芐青霉素(AP)雙抗生素篩選這兩個(gè)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子，堿法小量抽提質(zhì)粒DNA。
[0052]轉(zhuǎn)化方法如下:梭菌C.acetobutylicum824利用60mT, CGM培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600=0.5，冰置10分鐘，7000g4 V離心10分鐘；用預(yù)冷的電擊緩沖液(270mM葡萄糖和686mM NaH2PO4, pH=7.4) 洗三次；最后一次用ImL預(yù)冷的電擊緩沖液懸浮沉淀；分裝制備的梭菌感受態(tài)細(xì)胞，每80ul感受態(tài)加入Iug的質(zhì)粒DNA ;混勻后轉(zhuǎn)入4mm的電擊杯中；電擊條件:(2.5kV，電阻無窮大，25uF)；電擊結(jié)束后立即加入ImL預(yù)冷的2YTG培養(yǎng)基(16g/L蛋白胨，10g/L酵母膏，4g/L NaCl,和5g/L葡萄糖)；混勻轉(zhuǎn)入L 5mL eppendorf管,放置厭氧環(huán)境中37°C培養(yǎng)4h ;將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有40ug/mL紅霉素的2YTG固體平板上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選。厭氧培養(yǎng)2天后，獲得大量HSP轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率為5 X 105/ug DNA。
[0053]實(shí)施例4轉(zhuǎn)化子丁醇耐性檢測(cè)
[0054]在平板上挑取梭菌C.acetobutylicum824及獲得的HSP轉(zhuǎn)化子，分別接種到IOmL液體RCM培養(yǎng)基中，并在75°C水浴中熱激lOmin，然后37°C厭氧培養(yǎng)；當(dāng)菌體生長(zhǎng)至OD600=0.8時(shí)，將菌體轉(zhuǎn)接至40mL液體CGM培養(yǎng)基中，37 °C厭氧培養(yǎng)；當(dāng)菌體生長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期OD6tltl=L 0±0.05時(shí)(大約12h);培養(yǎng)物被均分成4等份(IOmL/份)，分別用0、6、12和18g/L 丁醇進(jìn)行脅迫處理，對(duì)梭菌在不同丁醇濃度脅迫下的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
[0055]試驗(yàn)結(jié)果參看圖2(824—原始菌種，HSP—本發(fā)明PfHSPS基因的轉(zhuǎn)化菌種)，可以看出:原始菌種一梭菌C.acetobutylicum824能在6g/L和12g/L 丁醇中生長(zhǎng),但在18g/L丁醇中幾乎不能生長(zhǎng)；HSP轉(zhuǎn)化菌種能在6g/L, 12g/L和18g/L 丁醇穩(wěn)定生長(zhǎng),雖能生長(zhǎng)也受到了部分抑制，但是總體生長(zhǎng)情況優(yōu)于原始菌種。這些結(jié)果清晰地展示出HSP轉(zhuǎn)化到梭菌后能夠耐受更高濃度的丁醇，有效地提高菌種在丁醇脅迫下的生長(zhǎng)表現(xiàn)。
[0056]實(shí)施例5梭菌的中試發(fā)酵
[0057]為了獲得HSP轉(zhuǎn)化菌種更多的生理學(xué)特征，我們進(jìn)行控制pH (pH < 5.0)分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。分別進(jìn)行了兩次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)取平均作為最終結(jié)果，小規(guī)模發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在BioStatB發(fā)酵罐(德國(guó)貝朗公司)中進(jìn)行。首先在平板上挑取梭菌及HSP轉(zhuǎn)化子單克隆分別接種到IOmL液體RCM培養(yǎng)基中，HSP轉(zhuǎn)化梭菌的培養(yǎng)基中補(bǔ)加20ug/l紅霉素，37°C厭氧培養(yǎng)；當(dāng)菌體生長(zhǎng)至0D_=0.8時(shí)，將菌體轉(zhuǎn)接至液體CGM培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)作為種子液；當(dāng)種子液菌體生長(zhǎng)至0D_=0.2時(shí)，按10%的接種量接種到含有4L液體CGM (80g/L葡萄糖)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)；通過充氮?dú)?流速50mL/min)維持發(fā)酵罐中厭氧環(huán)境；發(fā)酵起始pH大約是6.5，通過補(bǔ)加6mol氨水來控制菌體發(fā)酵pH維持在5.0。當(dāng)葡萄糖量降至初始量一半時(shí)，添加葡萄糖至初始濃度。
[0058]實(shí)施例6發(fā)酵后代謝產(chǎn)物的檢測(cè)
[0059]用Agilent6890氣相色譜儀測(cè)定發(fā)酵后代謝產(chǎn)物。
[0060]色譜條件:色譜柱:phenomenZB—WAXplus，檢測(cè)器:FID (220°C)進(jìn)樣量 0.2txL,進(jìn)樣口壓力:16.92psi，柱箱溫度:100°C，氫氣流量:30mL/min，正丙醇作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。
[0061]試驗(yàn)結(jié)果參看圖3和圖4，可以看出:1)HSP轉(zhuǎn)化菌種在發(fā)酵過程中丁醇的最高產(chǎn)量達(dá)到230mM，而原始菌種丁醇的產(chǎn)量最高僅為178mM，提高了 29.2% ;HSP轉(zhuǎn)化菌種在發(fā)酵過程中丙酮的最高產(chǎn)量是139mM，原始菌種丙酮的產(chǎn)量最高僅為94mM，提高了 47.8% ;發(fā)酵過程中HSP轉(zhuǎn)化菌種乙醇的最高產(chǎn)量是24.2mM，與原始菌種產(chǎn)量相當(dāng)；HSP轉(zhuǎn)化菌種溶劑總產(chǎn)量達(dá)到393.2mM，相對(duì)于原始菌株提高了 32.6%。兩個(gè)菌種的丁酸最高產(chǎn)量只有很小的差異，HSP菌種為71mM，稍微低于原始菌株的75.2mM。
[0062]2)原始菌株能夠快速利用葡萄糖，30個(gè)小時(shí)后生長(zhǎng)量達(dá)到最高(0D_達(dá)到8.4)，然而，隨著丁醇的產(chǎn)生，菌種在50小時(shí)后，生長(zhǎng)密度急劇下降(0D_為6.2)，丁醇產(chǎn)量慢慢減少，直到達(dá)到一定平衡，此時(shí)發(fā)酵液中的丁醇濃度對(duì)菌種的危害較小。而HSP轉(zhuǎn)化子在發(fā)酵過程中，從30-70小時(shí)內(nèi)菌種都處于高密度生長(zhǎng)狀態(tài)，丁醇產(chǎn)量在該段時(shí)間內(nèi)持續(xù)增加，直到接近原始菌種最高產(chǎn)量水平，此后，丁醇產(chǎn)量維持一段低增長(zhǎng)的時(shí)期，從80-110小時(shí)丁醇的產(chǎn)量又快速增長(zhǎng)，直到最高值，后期由于丁醇產(chǎn)量較高，對(duì)菌種有一定的毒害作用，造成菌體生長(zhǎng)密度急劇下降。
[0063]從上述發(fā)酵結(jié)果可以看出，由于HSP轉(zhuǎn)化菌能夠耐受更高濃度的丁醇，菌種能夠保持很長(zhǎng)時(shí)間的高密度生長(zhǎng)，從而保證丁醇產(chǎn)量的不斷增加。丙酮的產(chǎn)生規(guī)律和丁醇相似，HSP轉(zhuǎn)化菌種丙酮產(chǎn)量在110小時(shí)內(nèi)均在穩(wěn)定的增長(zhǎng)。
【權(quán)利要求】
1.一種來源于強(qiáng)烈火焰菌Pyrococcus furiosus的小熱激蛋白HSP基因,其堿基序列如SEQ ID NOl所示。
2.一種包含權(quán)利要求1所述的來源于強(qiáng)烈火焰菌的小熱激蛋白HSP基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體。
3.權(quán)利要求2所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體是以pS0S94載體為基礎(chǔ)載體，將氯霉素抗性基因表達(dá)單元，梭菌CAC2546基因啟動(dòng)子，權(quán)利要求I所述的小熱激蛋白HSP基因的開放閱讀框和枯草桿菌pyruvate kinase連接后替換PS0S94載體中的ctfAB及abc表達(dá)單元構(gòu)建而成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體，其特征在于，從PXYP251載體中擴(kuò)增氯霉素表達(dá)單元，引物為 cml:5’ -AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’ ；cm2:5，-TCTAGATATA CGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3，；擴(kuò)增條件:94 °C 30s,60 °C 30s,72°C 60s ；25 循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體，其特征在于，從梭菌C.acetobutylicum ATCC824 中擴(kuò)增 CAC2546 基因啟動(dòng)子，引物為 cacl:5，-TCTAGAAAAGGAAAATATGATAAAAAATTTCA-3’ ；cac2:5’ -GGATCCTAATATCGAAAATAGCTTAAAC-3’ ；擴(kuò)增條件:94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ;25 循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體,其特征在于，從枯草桿菌Bacillussubtilisl68 基 因中擴(kuò)增 PYK 終止子，引物為 pykl: 5’-GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3’ ；pyk2:5’ -CATATGTATAGCGGGTAACC CAACGGGATMGAAGACAGGCGCCG-3’ ；擴(kuò)增條件:940C 30s, 600C 30s, 72°C 30s ;25 循環(huán)。
7.權(quán)利要求1所述的來源于強(qiáng)烈火焰菌的小熱激蛋白HSP基因在梭菌高效表達(dá)中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的來源于強(qiáng)烈火焰菌的小熱激蛋白HSP基因在梭菌丁醇耐受性中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的來源于強(qiáng)烈火焰菌的小熱激蛋白HSP基因在提高梭菌丁醇發(fā)酵產(chǎn)量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/31GK103898127SQ201210585887
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月28日
【發(fā)明者】彭日荷, 姚泉洪, 田永生, 趙偉, 付曉燕, 朱波, 許晶, 高建杰, 韓紅娟, 王波, 王麗娟, 韓靜, 薛永 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院