專利名稱：一種埃里希氏菌的熒光定量pcr檢測(cè)和分型的引物、探針及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及埃里希氏菌感染的分子診斷的熒光定量PCR檢測(cè)和分型的引物、探針及試劑盒。
背景技術(shù)：
埃里希氏菌是生存在單核白細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞的胞漿內(nèi)的專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌。埃里希氏菌病經(jīng)蜱蟲(chóng)傳播，在世界范圍內(nèi)廣泛存在，引起人和多種動(dòng)物(牛、狗、羊)以發(fā)熱和貧血為主要特征的疫病。此病的臨床診斷主要依賴于流行病學(xué)和發(fā)病癥狀，結(jié)合血液涂片的顯微鏡觀察法檢出埃里希氏菌。臨床診斷的靈敏度較低，現(xiàn)有的血清學(xué)診斷方法不能區(qū)分感染后的康復(fù)者和臨床感染者。感染人畜的埃里希氏菌的重要的種包括犬型E. canis,人型E. chafeensis和E. ewingii,牛型E. ruminatium,羊型E. ovina,鼠型E. muris。不同種的埃里希氏菌感染宿主的專一性不強(qiáng)，而現(xiàn)有的分子診斷技術(shù)僅可以檢測(cè)單一種的埃里希氏菌。本發(fā)明建立了一套高靈敏度和高特異性、快速的檢測(cè)埃里希氏菌的、適合臨床使用的分子診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有分子診斷技術(shù)只能檢測(cè)單一種埃里希氏菌的不足，本發(fā)明提供一種快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、適合臨床使用的定量PCR檢測(cè)所有種的埃里希氏菌的引物、探針及試劑盒。本發(fā)明的原理和核心是科學(xué)地設(shè)計(jì)擴(kuò)增和檢測(cè)埃里希氏菌的特異、高效的引物和探針。在保證設(shè)計(jì)的引物高效擴(kuò)增埃里希氏菌、設(shè)計(jì)的探針特異檢測(cè)埃里希氏菌的同時(shí)，確保此引物和探針不擴(kuò)增和檢 測(cè)其它類似的微生物(anaplasma無(wú)形體、Bartonella巴爾通體、Rickettsia立克次氏體、Neorickettsia新立克次氏體、Coxiella考克斯氏菌、Mycoplasma支原體)。此外，本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針和不同種的埃里希氏菌的基因序列有不同程度的差異(有1-3個(gè)堿基的差異)，高分辨率熔點(diǎn)曲線技術(shù)會(huì)顯示不同種埃里希氏菌的熔解溫度的差異，這可以方便的用于基因分型。從GenBank (www. ncb1. nlm. nih. gov)獲取如下埃里希氏菌以及相關(guān)細(xì)菌的16SrDNA的序列后,用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法對(duì)所有序列進(jìn)行對(duì)齊無(wú)形體(基因序列號(hào)Anaplasma equi AF172167, Anaplasma platys M82801, AnaplasmaphagocytophiIum AY055469, Anaplasma bovis HQ913646, Anaplasma marginale AF309866和 AF414873),巴爾通體(Bartonella henselae AY513504),立克次氏體(Rickettsiarickettsia L36127)，考克斯氏菌(Coxiella burnetii D89798)，支原體(FR869692)，新立克次氏體(Neorickettsia helminthoeca U12457, Neorickettsia rickettsiaNR_029162),牛型埃里希氏菌(Ehrlichia orCowdria ruminatium U03776, U03777, CR925678, DQ647616),鼠型埃里希氏菌(Ehrlichia muris AB013008, AB196302),羊型埃里希氏菌(Ehrlichia ovina AF318946),犬型埃里希氏菌(Ehrlichia canis (GU810149),人型埃里希氏菌(Ehrlichia chafeensis AF147752, ECU60476 ；Ehrlichia ewingiiM73227, U96436)。引物和探針的選擇基于對(duì)齊序列的保守區(qū)和變異區(qū)。附圖1、2、3、和4顯示設(shè)計(jì)的引物和探針上游引物5’-GAGGATTTTATCTTTGTATTGTAGCTAA-3’ (SEQ ID NO.1)；下游引物5’-TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT-3’ (SEQ ID NO. 2)；探針-1:5，-ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC-6-FAM-3，(SEQ ID NO. 3)；探針-2:5‘-LCred640 GAAGGTCGTATCCCT CTTAACAGG-phos (磷酸)_3’ (SEQ IDNO. 4)本發(fā)明還公開(kāi)了埃里希氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)和分型試劑盒，該試劑盒由下列組成(I) 5x定量PCR反應(yīng)液；22 ill ; (2) 22 ill的5x的探針和引物混合液有濃度為5 u M的上游引物、5 ii M下游引物、I ii M的探針-1、I ii M的探針-2。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種埃里希氏菌分型方法，該方法包括以下步驟(I)用上述引物和探針PCR擴(kuò)增待測(cè)菌，擴(kuò)增出210bp條帶，且熒光檢測(cè)在640nm波長(zhǎng)增強(qiáng)的為埃里希氏菌陽(yáng)性樣本；(2) PCR完成后，對(duì)步驟(I)埃里希氏菌陽(yáng)性樣本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，根據(jù)熔解溫度對(duì)埃里希氏菌進(jìn)行分型，分型標(biāo)準(zhǔn)是E. chaffensis熔解溫度為一57. 5°C, E. ruminatium 溶解溫度為一56°C, E. canis/chafeensis/ovina/muris 的溶解溫度一63。。。

本發(fā)明能有效地檢測(cè)所有埃里希氏菌的種，并基于高分辨率熔點(diǎn)曲線技術(shù)，方便地區(qū)分 E. canis/ovina/muris/E. chafeensis, E. ewingii 和 E. ruminatium。和現(xiàn)有的傳統(tǒng)和分子診斷技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，具有很高的特異性和敏感，且可以方便的檢測(cè)所有種的埃里希氏菌，可廣泛的用于人和各種動(dòng)物(牛、狗、羊)和人的埃里希氏菌病的確診和治療判定，將會(huì)產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1 :埃里希氏菌熒光定量PCR的上游引物。上游引物(5 ’ -GAGGATTTTATCTTTGTATTGTAGCTAA-3 ’)和重要種的埃里希氏菌的 16S rDNA 序列顯不 100% 的吻合E. canis, E. chafeensis, E. ewingii, E. muris andE.ruminatium。圖2 :埃里希氏菌熒光定量PCR的下游引物。下游引物(5，-TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT-3’)和重要種的埃里希氏菌的16S rDNA序列顯示100%的吻合E. canis, E. chafeensis, E. ewingii, E. muris and E. ruminatium.下游引物的序列和顯示的序列成反義關(guān)系。圖3 :埃里希氏菌熒光定量PCR的6-FAM探針。此PCR 系統(tǒng)的 6-FAM 探針(5 ’ -ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC-6-FAM-3 ’)和重要種的埃里希氏菌的16S rDNA序列顯不100%的吻合E. canis, E. chafeensis, E. ewingii, E.muris and E. ruminatium。
圖4 :埃里希氏菌熒光定量PCR的LCred640探針。此PCR 系統(tǒng)的 LCred640 探針(5 ’ -LCred640 GAAGGTCGTATCCCTCTTAACAGG-phos-3’ )和重要種的埃里希氏菌的16S rDNA序列顯示不同程度的吻合一個(gè)喊基的不同(E. canis, E. muris, E. chafeensis), 二個(gè)喊基的不同(E. ewingii)和三個(gè)喊基的不同(E. ruminatium)。圖5 :埃里希氏菌的熔解溫度PCR完成后，對(duì)不同種的埃里希氏菌(E. canis, E. chaffensis and E. ruminatium)的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，觀察不同種埃里希氏菌的熔解溫度。LCRed640 探針和 E. canis/chafeensis/ovina/muris, E. chaffensis and E. ruminatium 的16S rDNA的序列顯示不同程度的差異。因此，高分辨率熔解曲線分析顯示，E. chaffensis(—57. 5°C )和 E. ruminatiumC — 56°C )的溶角軍溫度低于 E. canis/chafeensis/ovina/muris的熔解溫度(一 63 °C)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明引物和探針(即埃里希氏菌PCR特異性的確定)從三個(gè)方面保證本發(fā)明的PCR系統(tǒng)的特異性i)從GenBank獲取相關(guān)埃里希氏菌及相關(guān)細(xì)菌的16S rDNA序列，用于埃里希氏菌的科學(xué)合理設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的二個(gè)引物和二個(gè)探針，被用于GenBank的BLAST搜尋，確認(rèn)本發(fā)明的引物和探針擴(kuò)增所有種的埃里希氏菌，而不擴(kuò)增其它類似的細(xì)菌；ii)用本發(fā)明的技術(shù)對(duì)不同株的埃里希菌和其他細(xì)菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，觀察不同擴(kuò)增對(duì)象在PCR過(guò)程中熒光強(qiáng)度(640nm)的變化，和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳的條帶的大小。結(jié)果顯示，僅埃里希氏菌的DNA被有效的擴(kuò)增，熒光在640nm波長(zhǎng)增強(qiáng)，顯示陽(yáng)性；而其它類似的細(xì)菌的PCR擴(kuò)增的F2/F1熒光呈水平趨勢(shì)，沒(méi)有顯示隨著PCR循環(huán)的增加而出現(xiàn)熒光強(qiáng)度的增加；此外，埃里希氏菌的16S rDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳顯示預(yù)期的210bp的條帶，其他類似的細(xì)菌核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物在`電泳沒(méi)有上述條帶；iii)對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果和GenBank的序列進(jìn)行比較。如上所述，合理設(shè)計(jì)的埃里希氏菌熒光qPCR被實(shí)驗(yàn)證實(shí)為，擴(kuò)增所有種的埃里希氏菌，而不擴(kuò)增其他類似的細(xì)菌，具有極高的特異性。本發(fā)明的埃里希氏菌熒光FRET-qPCR檢測(cè)方法所用引物和探針的核苷酸序列如下上游引物5’-GAGGATITTATCTTTGTAITGTAGCTAA-3’ ；下游引物5，-TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT-3，；探針-1:5’ -ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC-6-FAM-3’ ；探針-2:5 ‘-LCred640 GAAGGTCGTATCCCT CTTAACAGG-phos-3J使用上述引物和探針進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程如下1.制備 PCR 用的標(biāo)準(zhǔn)定量試劑(standard)。由 Intergrated DNA Technology 合成犬型埃里希氏菌(E. canis)的16S rDNA的序列，此序列涵蓋PCR的2IObp的擴(kuò)增區(qū)域。依據(jù)合成物的分子量和絕對(duì)重量以及PicoGreen的DNA定量技術(shù)，計(jì)算合成物所含的16SrDNA的基因拷貝數(shù)目。隨后，對(duì)合成物進(jìn)行稀釋，制備每10 u I合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝的16SrDNA，作為PCR用的標(biāo)準(zhǔn)定量試劑。2.制備待檢樣品的DNA模板。疑似埃里希氏菌感染者的全血(400 ill)保存在EDTA試管中用于 DNA 提取，純化的 DNA 洗脫在 IOOiil TltlEtll (含 IOmM Tris-HCl1O.1mM EDTA,PH8. 5)用于PCR模板。3. PCR擴(kuò)增體系。20 U I的擴(kuò)增體系包含10 U I的樣品DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑(standard)、IxPCR緩沖液、Iii M上游引物、Iii M下游引物、0. 2 ii M的探針-1和0. 2 y M探針-2、2個(gè)單位的商業(yè)化Taq酶、200 ii M dNTP。4. PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)。PCR擴(kuò)增包括18個(gè)溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)(high-stringency step-down)和 25 個(gè)欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐还猥@得循環(huán)(relaxed-stringencyfluorescence acquisition)。18個(gè)溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)6xl5sec@95° C, 60seci74° C;9xl5seci95° C, 60seci72° C; 3xl5seci95° C, 10seci70° C, 15seci72° C. 25個(gè)欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán)25xl5sec@95° C，8sec@58。C, 10seci65° C, andl5seci72° C。5.高分辨率熔解曲線分析。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，立即實(shí)施高分辨率熔解曲線分析，溫度從38° C上升到75° C，以每秒0.2° C/秒的速度遞增。數(shù)據(jù)分析是分析640nm:530nm(F2/Fl)的熒光強(qiáng)度的比例。F2/F1的第一衍生值(_d(F2/F1)/dt)被讀為該DNA的熔解溫度。6. PCR結(jié)果的判定和定量分析。DNA模板的制備過(guò)程均設(shè)有DNA提取的陰性和陽(yáng)性對(duì)照，隨后的PCR擴(kuò)增對(duì)象包括待測(cè)樣品的DNA模板、DNA提取的陰性和陽(yáng)性對(duì)照、定量的標(biāo)準(zhǔn)試劑(每10 ill standard含104，103，102，IO1拷貝的埃里希氏菌16S rDNA)。本發(fā)明的PCR擴(kuò)增效率高，有效地?cái)U(kuò)增含IO1拷貝的埃里希氏菌16S rDNA的standard。實(shí)施例1 :埃里希氏菌的分子鑒定對(duì)經(jīng)過(guò)臨床診斷、血涂片的顯微鏡觀察和血清學(xué)確診的10個(gè)患埃里希氏菌的犬進(jìn)行分子診斷。操作的流程如上所述，400 Ul的EDTA全血提取DNA用于PCR擴(kuò)增。所有10個(gè)樣品均為埃里希菌PCR 陽(yáng)性，具有特征的63-64° C熔解溫度(如圖5所示)。基因測(cè)序證實(shí)PCR的結(jié)果。實(shí)施例2 :犬埃里希氏菌感染的分子流行病學(xué)調(diào)查對(duì)279只來(lái)自加勒比海島國(guó)(St. Kitts)的犬進(jìn)行體檢(血常規(guī)、生化試驗(yàn))、臨床檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)(IDEXX SNAP4DX)和本發(fā)明的埃里希氏菌PCR檢測(cè)。僅4%的犬的血涂片顯微鏡檢查為陽(yáng)性，而本發(fā)明檢測(cè)犬的陽(yáng)性率約為19%。SNAP4DX檢測(cè)表明，約24%的犬有抗埃里希氏菌的抗體。通過(guò)對(duì)犬的健康狀況和不同診斷方法的對(duì)比表明，血涂片顯微鏡觀察法的靈敏度有限，不能檢測(cè)相對(duì)健康但是血常規(guī)異常的埃里希氏菌的亞臨床感染者；血清學(xué)檢測(cè)方法不能區(qū)分感染后經(jīng)治療后的康復(fù)犬和感染犬。本發(fā)明的埃里希氏菌的熒光定量PCR技術(shù)，能準(zhǔn)確地診斷臨床和亞臨床感染者，而且有效的區(qū)分感染后經(jīng)治療后的康復(fù)犬和埃里希氏菌的感染犬。
Unt it led. S T 2 5
SEQUENCE LISTING
<110>揚(yáng)州大學(xué)
<120> 一種埃ffl希R:菌的熒光定ftPCR檢測(cè)和分型的引物、探針及Ut劑盒
<130>
1(0- 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> I
<211>28 <212> DNA <213> 人TJt:列
<400> I
gaggatttta tctttgtatt gtagctaa28
<210>2<211>23
<212>DNA
<213>人丄序列
<400> 2
tglaaggtcc agccgaactg act23
<210> 3
<211>27 <212> DNA <213> 人工序列
<400> 3
acgcgaaaaa ccttaccact ttttgac27
<2104
<211>24
<2I2>DNA <213>人丁序列
<400> 權(quán)利要求
1.一種埃里希氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)和分型的引物及探針，其特征在于檢測(cè)引物為 上游引物5 ’ -GAGGATTTTATCTTTGTATTGTAGCTAA-3，； 下游引物5’ -TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT -3’ ； 檢測(cè)探針為探針-1 :5’ - ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC- 6-FAM -3’ ； 探針-2:5 LCred640 - GAAGGTCGTATCCCT CTTAACAGG-phos -3’。
2.—種埃里希氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)和分型試劑盒，包括5倍定量PCR反應(yīng)液22Ul,以及22 的5倍引物和探針的混合液；所述引物和探針混合液含濃度為5 PM的上游引物、5 PM下游引物、I PM的探針-1、I PM的探針-2。
3.一種埃里希氏菌分型方法，包括以下步驟 (1)用權(quán)利要求1所述引物和探針PCR擴(kuò)增待測(cè)菌，擴(kuò)增出210bp條帶，且熒光檢測(cè)在640nm波長(zhǎng)增強(qiáng)的為埃里希氏菌陽(yáng)性樣本； (2)PCR完成后，對(duì)步驟(I)埃里希氏菌陽(yáng)性樣本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，根據(jù)熔解溫度對(duì)埃里希氏菌進(jìn)行分型，分型標(biāo)準(zhǔn)是么chaffensis熔解溫度為一`57. 5°C, E. r 應(yīng)應(yīng)溶角軍溫度為一56。。，萬(wàn).can is /chafeensis /ovina/muris溫度一63 °C。
全文摘要
一種埃里希氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)和分型的引物、探針及試劑盒。所述引物序列如SEQIDNO.1和2所示，所述探針為SEQIDNO.3和4。用上述引物和探針PCR擴(kuò)增待測(cè)菌，擴(kuò)增出210bp條帶，且熒光檢測(cè)在640nm波長(zhǎng)增強(qiáng)的為埃里希氏菌陽(yáng)性樣本；再根據(jù)熔解溫度可對(duì)埃里希氏菌進(jìn)行分型。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，具有很高的特異性和敏感,且可以方便的檢測(cè)所有種的埃里希氏菌,可廣泛的用于人和各種動(dòng)物(牛、狗、羊)和人的埃里希氏菌病的確診和治療判定，將會(huì)產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12Q1/10GK103060468SQ20131003437
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者王成明, 王志強(qiáng), 許傳靈 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)