專利名稱：Leber病之線粒體T12338C檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于檢測(cè)與Leber氏病相關(guān)的線粒體DNA ND5T12338C突變的試劑盒，還涉及一種與原發(fā)性Leber氏病相關(guān)的線粒體基因突變的檢測(cè)方法，特別涉及檢測(cè)線粒體M^T12338C突變的方法，以及上述方法或上述的試劑盒在檢測(cè)與原發(fā)性Leber氏病相關(guān)的線粒體DNA T12338C突變中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Leber 遺傳性視神經(jīng)病變(Leber，s Hereditary Optic Neuropathy, LH0N,簡(jiǎn)稱Leber氏病)是一種母系遺傳性視神經(jīng)病變，主要累及視網(wǎng)膜、鞏膜篩板前部視乳頭黃斑束纖維，導(dǎo)致視神經(jīng)退行性變的母系遺傳病，嚴(yán)重的影響著人們正常的生產(chǎn)、生活。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部(http://www .moh.gov.cn/)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)現(xiàn)有的低視力人口約有710萬,盲人約有500萬，占總?cè)藬?shù)的0.4%，成為世界上視力損傷最嚴(yán)重的國(guó)家之一。其中，由視神經(jīng)病變引起的約為55萬。1871年德國(guó)眼科醫(yī)生Theodor Leber首次報(bào)道該病的臨床癥狀、體征和遺傳特性。1972年Erickson等發(fā)現(xiàn)LHON的遺傳方式呈典型的母系遺傳特征。1988年Wallace DC等發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)與LHON相關(guān)的線粒體基因組DNA(mitochondria DNA, mtDNA)突變位點(diǎn)似衫G11778A。目前已報(bào)道50多種線粒體DNA突變位點(diǎn)與LHON致病相關(guān)(http://www.mitomap.0rg/),其中90%以上的LHON的家系是由氧化磷酸化復(fù)合物I亞基上的ND4G11778A、ND1 G3460A和ND6 T14484C這3個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)所致。為了進(jìn)一步探究LHON的發(fā)病機(jī)制，在全國(guó)范圍內(nèi)收集了大量的LHON家系，除上述3個(gè)原發(fā)性突變位點(diǎn)外，相繼發(fā)現(xiàn)了 tRNAMetA4435G、似衫 G11696A、tRNAThr A15951G、M 7 T3866C 和似枚 T12338C 突變與 LHON相關(guān)，與線粒體相關(guān)的原發(fā)性Leber氏病在早期臨床癥狀不明顯，早期的檢查常常會(huì)因此被耽誤，尤其在我國(guó)偏遠(yuǎn)農(nóng)村地區(qū)，這種情況普遍存在。因此，在高危人群和易感人群中開展mtDNA突變篩查，對(duì)于預(yù)防和控制與線粒體相關(guān)的原發(fā)性Leber氏病的發(fā)生有著極其重要的作用。自發(fā)現(xiàn)與mtDNA突變相關(guān)的疾病以來，檢測(cè)線粒體突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法主要還是序列測(cè)定。直接測(cè)序法是鑒定突變的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但該操作繁瑣，費(fèi)用昂貴限制了它的廣泛應(yīng)用。近年來，國(guó)內(nèi)相繼報(bào)道了 Leber遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒及其檢測(cè)方法，以滿足對(duì)線粒體突變突變進(jìn)行廣泛篩查的需要，如福建醫(yī)科大學(xué)于2005年申請(qǐng)了的基因診斷試劑盒及其檢測(cè)方法專利(專利號(hào):200510006097.8)，該發(fā)明是根據(jù)90 %以上的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變患者的線粒體DNA突變屬于3個(gè)原發(fā)性致病位點(diǎn)突變(G11778A、G3460A和T14484C)，設(shè)計(jì)和合成位點(diǎn)特異性PCR引物，直接以全血樣作PCR的DNA模板，利用等位基因特異性多重PCR技術(shù)，單管一次性PCR反應(yīng)，同時(shí)檢測(cè)LHON患者的線粒體DNA的3個(gè)原發(fā)性致病突變位點(diǎn)，具有簡(jiǎn)便快速、高效、費(fèi)用低、特異性好、只需微量血液樣本等優(yōu)點(diǎn)，為L(zhǎng)HON患者的快速臨床基因診斷提供一種簡(jiǎn)易、可靠的方法和試劑盒，具有巨大的普及推廣應(yīng)用價(jià)值。但是該方法存在血液中直接PCR擴(kuò)增的難度加大，實(shí)驗(yàn)中采取的多重PCR的條件要求將會(huì)增加，檢測(cè)方法跟普通的方法沒有本質(zhì)的區(qū)別。2006年杭州優(yōu)思達(dá)生物科技有限公司建立一種以單核苷酸多態(tài)性核酸試紙快速檢測(cè)LHON線粒體DNA中G11778A位點(diǎn)突變的新方法(專利號(hào):200610003429.1)。在應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)或突變位點(diǎn)的檢測(cè)時(shí)，需要設(shè)計(jì)一條特異性延伸引物，這條引物的3’端堿基緊臨多態(tài)性堿基或突變堿基，其在DNA聚合酶的作用下開始延伸，帶有抗原標(biāo)記與模板對(duì)應(yīng)的雙脫氧單核苷酸(ddNTP)被連接到延伸引物上。雖然該方法能夠?qū)崿F(xiàn)短時(shí)間內(nèi)的檢測(cè)陽(yáng)性位點(diǎn)，但PCR擴(kuò)增條件嚴(yán)格，存在假陰性的幾率大大增加。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前檢測(cè)tRNAIle T12338C突變的方法所存在的缺點(diǎn)，提供一種Leber病之線粒體T12338C檢測(cè)試劑盒，是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)原發(fā)性Leber氏病相關(guān)的線粒體DNA突變的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，由置于盒體內(nèi)的DNA提取混合液、擴(kuò)增T12338C的PCR混合液、針對(duì)T12338C設(shè)計(jì)的一對(duì)外引物、針對(duì)T12338C設(shè)計(jì)的一對(duì)內(nèi)引物、限制性內(nèi)切酶Psi 1、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照構(gòu)成。其中提取DNA提取混合液主要由細(xì)胞裂解液和溶液I(主要成分是蛋白酶K)組成；擴(kuò)增T12338C的PCR混合液試劑包括dNTP (脫氧單核苷酸)、10XPCR緩沖液、MgCl2、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，針對(duì)T12338C設(shè)計(jì)的外引物包括外前向引物 F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQ ID NO:1)，外反向引物 R: AGA AGG ATATAA TTC CTA CG (SEQ ID NO:2);針對(duì)T12338C設(shè)計(jì)的內(nèi)引物包括內(nèi)前向引物F: TTTTAAAGGATAACAGCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAAAM TTTTGGTGCAACTCCAAATAAAAGTTA (SEQ ID NO:3)，內(nèi)反向引物R: GTGGGGAAGAGACTGATAATA (SEQ ID NO:4);限制性內(nèi)切酶包括限制性內(nèi)切酶Psi I ；陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照是不含有線粒體序列第12338位點(diǎn)發(fā)生T>C突變的酶切樣本、陰性標(biāo)本對(duì)照是含有線粒體序列第12338位點(diǎn)發(fā)生T>C突變的酶切樣本。在上述試劑 盒中，在擴(kuò)增T12338C的PCR混合液中添加用于提高延伸反應(yīng)特異性的少許二甲基亞砜(0.1-0.2 μ I)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述試劑盒在檢測(cè)與Leber氏病相關(guān)的線粒體基因M^T12338C突變中的應(yīng)用。通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
(1)基因組DNA的提取:運(yùn)用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標(biāo)本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片或唾液的樣本中提取基因組DNA ；
(2)特異性PCR擴(kuò)增:使用Primer5.0軟件和01 igo7.0軟件根據(jù)SEQ ID N0:5所示的人類線粒體基因序列所設(shè)計(jì)的引物F#/R#、F#/I^是能擴(kuò)增出包含上述原發(fā)性Leber氏病的線粒體突變位點(diǎn)的片段，F(xiàn)#/R#卜擴(kuò)增出為線粒體DNA的核苷酸11929-12793，其序列為序列表中的SEQ ID N0:l、2 ;F /R肖擴(kuò)增出為線粒體DNA的核苷酸12268-12488，其序列為序列表中的SEQ ID Ν0:3、4
(3)酶切鑒定:將上述PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶I對(duì)T12338C位點(diǎn)處進(jìn)行酶切；
(4)突變檢測(cè):聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，直接根據(jù)酶切PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的DNA片段數(shù)量及DNA片段大小，檢測(cè)mtDNA是否發(fā)生T12338C突變。在上述檢測(cè)mtDNA T12338C突變的方法中，可從血標(biāo)本(如一滴血)、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片或唾液的樣本中快速提取基因組DNA，根據(jù)取樣方式或被測(cè)樣本形式不同，對(duì)不同樣本進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)處理，處理方法如下:
(1)血標(biāo)本(如一滴血):取20 200μ I少量血標(biāo)本(如一滴血)或Icm2的血濾紙片放入1.5ml EP管(離心管)，加入900μl紅細(xì)胞裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl,pH 7.6)(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細(xì)胞，12000rpm離心lmin，收集白細(xì)胞沉淀；
(2)帶毛囊的毛發(fā):用體積比70%乙醇洗帶毛囊的毛發(fā)I次，后再用蒸餾水沖洗毛發(fā)2次。在1.5ml EP管中分別放入2 4根毛發(fā)，毛囊置于EP管底部，用干凈的剪刀剪去毛發(fā)高于EP管的部分；
(3)口腔粘膜刮片或唾液:收集唾液前，必須讓被收集者漱口。以除去口腔中過多的老化細(xì)胞、食物殘?jiān)?、牙膏、咖啡、煙等物質(zhì)。半小時(shí)內(nèi)不要喝水、進(jìn)食、吸煙，然后開始收集口腔粘膜刮片或唾液，可視條件選 擇如下方法收集唾液樣本:①舌頭圍繞口腔刮取粘膜細(xì)胞，將約0.1ml唾液直接吐進(jìn)EP管內(nèi)生理鹽水漱口，吐進(jìn)EP管內(nèi)，吸取PBS溶液至裝有通過上述任一種方法收集的唾液樣本的EP管中，反復(fù)吹打后，12000rpm離心5min，除去上清，重復(fù)該過程一次用棉拭子反復(fù)刮拭面頰內(nèi)壁6次，空氣中干燥，然后用滅菌過的鑷子小心撕去其外表面，放入EP管中將唾液吐在濾紙上，空氣中干燥后形成唾液斑，再用干凈的剪刀剪成大小約Icm2碎紙片置于EP管中。然后用細(xì)胞裂解液和蛋白酶K對(duì)上述樣本進(jìn)行消化裂解，利用鹽析法去除蛋白等雜質(zhì)，異丙醇沉淀DNA，最后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于-20°C保存?zhèn)溆谩Ｔ诒景l(fā)明的實(shí)施方案中，引物設(shè)計(jì)的指導(dǎo)思想是，針對(duì)mtDNA T12338C位點(diǎn)存在的位置相鄰近，擴(kuò)增在一條片段上，故應(yīng)設(shè)計(jì)3’末端與12338位點(diǎn)野生型T和12338位點(diǎn)突變型C相對(duì)應(yīng)的上游引物；針對(duì)12338位點(diǎn)設(shè)計(jì)3’末端分別與12338位點(diǎn)野生型T和12338位點(diǎn)突變型C相對(duì)應(yīng)的下游引物。(參照?qǐng)D2)
本發(fā)明人針對(duì)設(shè)計(jì)的特殊的引物形成限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增(圖3)，mtDNA T12338C發(fā)生突變后使形成的酶切位點(diǎn)消失。酶切位點(diǎn)是由mtDNA T12338C突變形成的，其中的限制性內(nèi)切酶為I，其位點(diǎn)處為序列表中的SEQ ID N0:3、4;
用以上設(shè)計(jì)的引物，以相應(yīng)的被檢測(cè)樣本的DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增后分別獲得明亮清晰的大小約221bp的恒定擴(kuò)增帶，12338突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增片段的第70位。在上述檢測(cè)線粒體基因原發(fā)性Leber氏病突變的方法中，結(jié)合特異性PCR技術(shù)和酶切技術(shù)，每份DNA樣本分別用特異性引物即引物F/R于PCR反應(yīng)管中進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行突變位點(diǎn)處的酶切，通過一次PCR便可在幾小時(shí)內(nèi)檢出原發(fā)性Leber氏病相關(guān)的mtDNA T12338C 突變。理論上，基因組DNA樣本經(jīng)一次PCR反應(yīng)，即體系中僅加入針對(duì)突變型位點(diǎn)T12338C引物F/R后，加入針對(duì)突變位點(diǎn)新形成的限制性內(nèi)切酶泣_7 I進(jìn)行酶切，就可進(jìn)行檢測(cè)。也就是說，同一基因組DNA樣本經(jīng)一次PCR-酶切，從而使檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確、可信。本發(fā)明人還根據(jù)本發(fā)明中設(shè)計(jì)的引物序列，通過人工合成(委托生物公司)獲得引物，并將引物按一定的比例混合，與提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑、陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照、陰性標(biāo)本對(duì)照以及使用說明書組合起來，制成了用于體外檢測(cè)母系遺傳原發(fā)性Leber氏病線粒體基因mtDNA T12338C突變的試劑盒，使得樣本DNA提取、特異性PCR擴(kuò)增和酶切可以在試劑盒提供的試劑基礎(chǔ)上順利完成。其中，提取樣本DNA的試劑主要由細(xì)胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑包括dNTP、10XPCR緩沖液、MgCl2、三蒸水和Taq酶，限制性內(nèi)切酶包括限制性內(nèi)切酶泣7 I。用本發(fā)明的方法及其制備的體外檢測(cè)原發(fā)性Leber氏病相關(guān)的線粒體基因mtDNAT12338C突變?cè)噭┖芯哂幸韵绿攸c(diǎn):
1.傳統(tǒng)上獲得原發(fā)性Leber氏病患者基因組DNA的方法是從血液中提取，每人大約需要3 5ml。這種采血方法給很多被檢者尤其是嬰幼兒帶來了一些痛苦和傷害，而且在跨地區(qū)傳遞樣本時(shí)存在一定的風(fēng)險(xiǎn)和麻煩。本發(fā)明運(yùn)用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標(biāo)本(如一滴血)、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片或唾液等樣本中快速提取基因組DNA。該方法不僅解決了傳統(tǒng)上從原發(fā)性Leber氏病患者血液中提取DNA的問題，減輕被檢者的痛苦；而且還解決了跨地區(qū)傳遞樣本的問題，血濾紙片、毛發(fā)以及口腔粘膜刮片(棉拭子)或唾液斑濾紙片等可以很容易的放在信封內(nèi)，并可通過郵寄的方式跨地區(qū)傳遞。2.目前國(guó)內(nèi)外有幾種線粒體相關(guān)的母系遺傳性疾病基因診斷方法，如直接測(cè)序法熒光定量PCR檢測(cè)方法、基因芯片檢測(cè)方法等，由于其自身的缺陷，如費(fèi)時(shí)費(fèi)力、操作繁瑣以及檢測(cè)費(fèi)用偏高而不易在臨床進(jìn)行推廣。與這些方法相比較，PCR-酶切技術(shù)則結(jié)合了特異性PCR技術(shù)及酶切技術(shù)兩者的優(yōu)點(diǎn)，每份DNA樣本用特異性引物即引物F/R于PCR反應(yīng)管中進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，通過一次PCR-酶切便可在幾小時(shí)內(nèi)同時(shí)檢出mtDNA T12338C突變。另外值得一提的是，本方法所用的引物均經(jīng)過仔細(xì)設(shè)計(jì)。首先，正常和突變等位基因間不同的堿基在酶切過程中對(duì)特異性限制性內(nèi)切酶形成的位點(diǎn)不同，因而大大提高了酶切的特異性；另外由正常對(duì)照和空白對(duì)照的產(chǎn)物可作為整個(gè)PCR反應(yīng)的分子內(nèi)控指標(biāo)，從而避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，提高檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。通過調(diào)整不同引物的濃度和比例以及對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以確保結(jié)果的特異性和穩(wěn)定性。3.應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)行mtDNA T12338C突變檢測(cè)，成本較其他檢測(cè)方法更低；檢測(cè)流程簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果判讀直觀；對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備及操作人員無特殊要求，適合在一般醫(yī)院、分子生物實(shí)驗(yàn)室 開展，便于在全國(guó)范圍內(nèi)特別是欠發(fā)達(dá)地區(qū)實(shí)行原發(fā)性Leber氏病相關(guān)的mtDNA T12338C突變的大規(guī)模篩查和預(yù)防性檢查。


圖1是本發(fā)明試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明的特異性巢式PCR引物示意圖。圖3是本發(fā)明的特異性巢式PCR擴(kuò)增方案示意圖。圖4是攜帶T12338C突變?cè)l(fā)性Leber氏病家系系譜圖。圖5是基因特異性巢式PCR擴(kuò)增鑒定mtDNA T12338C的7%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。符號(hào)說明:
圖2和3中:F外為特異性巢式PCR第一次擴(kuò)增的正向引物#外為特異性巢式PCR第一次擴(kuò)增的反向引物，與F外配對(duì)使用；F內(nèi)為特異性巢式PCR第二次擴(kuò)增的正向引物，R內(nèi)為特異性巢式PCR第二次擴(kuò)增的反向引物，與F內(nèi)配對(duì)使用；T12338C表示為線粒體DNA第12338位，野生型為T，發(fā)生基因突變后為C。圖4中:□為正常男性個(gè)體；〇為正常女性個(gè)體；■為發(fā)病男性個(gè)體；籲為發(fā)病女性個(gè)體；，為先證者；I為該家系的第一代成員；II為該家系的第二代成員；111為該家系的第三代成員。圖5中:Ml表示野生型位點(diǎn)檢測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖(陰性對(duì)照者)；M2表示先證者攜帶T12 3 38C突變位點(diǎn)檢測(cè)的P C R擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切鑒定的電泳圖；M 3為攜帶T12338C突變的先證者的女兒；M4分別為未攜帶T12338C突變的先證者的丈夫，M6表示未攜帶T12338C突變位點(diǎn)檢測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生酶切的電泳圖；M7陽(yáng)性對(duì)照者電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1 一種Leber病之線粒體T12338C檢測(cè)試劑盒
參見圖1，本發(fā)明提供的試劑盒，由置于盒體8內(nèi)的DNA提取混合液1、擴(kuò)增T12338C的PCR混合液2、針對(duì)T12338C設(shè)計(jì)的一對(duì)外引物3、針對(duì)T12338C設(shè)計(jì)的一對(duì)內(nèi)引物4、限制性內(nèi)切酶/ / I 5、是陽(yáng)性對(duì)照6和陰性對(duì)照7構(gòu)成。其中提取DNA提取混合液I主要由細(xì)胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)組成；擴(kuò)增T12338C的PCR混合液2試劑包括dNTP (脫氧單核苷酸)UOXPCR緩沖液、MgCl2、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，針對(duì)T12338C設(shè)計(jì)的一對(duì)外引物3包括外前向引物F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQID NO:1)，外反向引物 R: AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG (SEQ ID NO: 2);針對(duì) T12338C 設(shè)計(jì)的一對(duì)內(nèi)引物 4 包括內(nèi)前向引物 F: TTTTAAAGGATAACAGCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAAAAATTTTGGTGCAACTCCAAATAAAAGTTA (SEQ ID NO:3)，內(nèi)反向引物 R: GTGGGGAAGAGACTGATAATA(SEQ ID NO:4);陽(yáng)性對(duì)照6是不含有線粒體序列第12338位點(diǎn)發(fā)生T>C突變的酶切樣本，陰性對(duì)照7是含有線粒體序列第12338位點(diǎn)發(fā)生T>C突變的酶切樣本。在上述試劑盒中，在擴(kuò)增T12338C的PCR混合液2中添加用于提高延伸反應(yīng)特異性的少許二甲基亞砜(0.1-0.2 μ I)。實(shí)施例2攜帶線粒體基因T12338C突變的原發(fā)性Leber氏病家系的檢測(cè)
1.檢測(cè)樣本
選擇I個(gè)攜帶T12338C突變的原發(fā)性Leber氏病家系。其家系圖參見圖4。這個(gè)家系呈現(xiàn)母系遺傳，發(fā)病者均以視力損傷為唯一的臨床癥狀，但是家系中母系成員的視力損傷程度不等。這個(gè)家系總?cè)藬?shù)為18人，其中母系成員數(shù)為12人，患Leber氏病者有2人。2.基因組DNA的提取
分別獲取4名受檢者的樣本(包括采集I1-9,11 -10和家系外正常者的毛細(xì)血管一滴靜脈血濾紙片；111 -5為由于年齡較小采集帶毛囊的頭發(fā))，將血濾紙片用干凈的剪刀剪成大小約lcm2的碎紙片放入1.5ml EP管(Eppendorf管)，加入900 μ I紅細(xì)胞裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl,pH 7.6)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細(xì)胞，12000rpm離心lmin，收集白細(xì)胞沉淀；帶毛囊的頭發(fā)樣本用70%乙醇洗帶毛囊的毛發(fā)I次，后再用蒸餾水沖洗毛發(fā)2次。在1.5ml EP管中分 別放入2 4根毛發(fā)，毛囊置于EP管底部，用干凈的剪刀剪去毛發(fā)高于EP管的部分。然后加入600 μ I細(xì)胞裂解液，混勻后再加入溶液I，使得蛋白酶K的工作濃度為20μ g/ml。充分混勻后55°C消化裂解，接著以鹽析法去除蛋白等雜質(zhì)，異丙醇沉淀DNA，最后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.引物設(shè)計(jì)
使用Primer 5.0軟件和01igo7.0軟件協(xié)助設(shè)計(jì)改良引物,根據(jù)已公開的人類線粒體基因劍橋參考序列(SEQ ID N0:5)進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物的設(shè)計(jì)方案(見圖3)如下:
針對(duì)mtDNA 12338位點(diǎn)，保證引物設(shè)計(jì)的特異性，我們?cè)O(shè)計(jì)巢式PCR兩對(duì)引物F外/R夕卜，F(xiàn)內(nèi)/R內(nèi)；它們長(zhǎng)度、退火溫度相近便于實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，以增強(qiáng)特異性。由此設(shè)計(jì)出的4263 位點(diǎn)的巢式 PCR 引物為外前向引物 F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQ ID NO:1),外反向引物 R: AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG (SEQ ID NO: 2);內(nèi)前向引物 F: TTTTAAAGGATAACAGCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAAAAATTTTGGTGCAACTCCAAATAAMGTTA (SEQ ID NO:3)，內(nèi)反向引物 R: GTGGGGAAGAGACTGATAATA (SEQ ID NO:4)。參見圖2，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，引物設(shè)計(jì)的指導(dǎo)思想是，針對(duì)mtDNA T12338C位點(diǎn)存在的位置相鄰近，擴(kuò)增在一條片段上，故應(yīng)設(shè)計(jì)3’末端與12338位點(diǎn)野生型T和12338位點(diǎn)突變型C相對(duì)應(yīng)的上游引物；針對(duì)12338位點(diǎn)設(shè)計(jì)3’末端分別與12338位點(diǎn)野生型T和12338位點(diǎn)突變型C相對(duì)應(yīng)的下游引物。本發(fā)明人針對(duì)設(shè)計(jì)的特殊的引物形成限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增(圖3)，mtDNA T12338C發(fā)生突變后使形成的酶切位點(diǎn)消失。酶切位點(diǎn)是由mtDNA T12338C突變形成的，其中的限制性內(nèi)切酶為I，其位點(diǎn)處為序列表中的SEQ ID N0:3、4。用以上設(shè)計(jì)的引物，以相應(yīng)的被檢測(cè)樣本的DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增后分別獲得明亮清晰的大小約221bp的恒定擴(kuò)增帶，12338突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增片段的第70位。

4.基因特異性巢式PCR擴(kuò)增
根據(jù)上述設(shè)計(jì)的4條引物序列，通過人工合成(委托生物公司)獲得2對(duì)引物，以上述提取的被檢樣本基因組DNA為模板，進(jìn)行基因特異性巢式PCR擴(kuò)增和7%的聚丙烯酰胺凝膠電泳酶切鑒定。
表I基因特異性巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(TAKAM公司產(chǎn)品)
權(quán)利要求
1.一種Leber病之線粒體T12338C檢測(cè)試劑盒，其特征在于，由置于盒體(8)內(nèi)的DNA提取混合液(I)、擴(kuò)增T12338C的PCR混合液(2)、針對(duì)T12338C設(shè)計(jì)的一對(duì)外引物(3)、針對(duì)T12338C設(shè)計(jì)的一對(duì)內(nèi)引物(4)、限制性內(nèi)切酶I (5 )、陽(yáng)性對(duì)照(6 )和陰性對(duì)(7 )構(gòu)成，其中提取DNA提取混合液(I)由細(xì)胞裂解液和溶液I組成；擴(kuò)增T12338C的PCR混合液(2)試劑有脫氧單核苷酸、10XPCR緩沖液、MgCl2、三蒸水和DNA聚合酶組成，針對(duì)T12338C設(shè)計(jì)的一對(duì)外引物(3)有外前向引物F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG和外反向引物R:AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG，針對(duì)T12338C設(shè)計(jì)的一對(duì)內(nèi)引物(4)有內(nèi)前向引物F: TTTTAAAGGATAACAGCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAAAAA TTTTGGTGCAACTCCAAATAAAAGTTA 和內(nèi)反向引物R: GTGGGGAAGAGACTGATAATA ;陽(yáng)性對(duì)照(6)是不含有線粒體序列第12338位點(diǎn)發(fā)生T>C突變的酶切樣本，陰性對(duì)照(7)是含有線粒體序列第12338位點(diǎn)發(fā)生T>C突變的酶切樣本，溶液I為蛋白酶K。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Leber病之線粒體T12338C檢測(cè)試劑盒，其特征在于，擴(kuò)增T3866C的PCR混合液(2)中添加0.1-0.2 μ I 二甲基亞砜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種Leber病之線粒體T12338C檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)與Leber氏病相關(guān)的線粒體基因ND5 T12338C突變中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)基因組DNA的提取:用蛋白酶K消化裂解法，從血液標(biāo)本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片或唾液的樣本中提取基因組DNA ； (2)特異性PCR擴(kuò)增:使用Primer5.0軟件和Oligo7.0軟件根據(jù)SEQ ID N0:5所示的人類線粒體基因序列所設(shè)計(jì)的引物F#/R#、F#/I^是能擴(kuò)增出包含上述原發(fā)性Leber氏病的線粒體突變位點(diǎn)的片段，F(xiàn)#/R#卜擴(kuò)增出為線粒體DNA的核苷酸11929-12793，其序列為序列表中的SEQ ID N0:l、2 ;F /R肖擴(kuò)增出為線粒體DNA的核苷酸12268-12488，其序列為序列表中的SEQ ID Ν0:3、4; (3)酶切鑒定:將上述PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶I對(duì)T12338C位點(diǎn)處進(jìn)行酶切； (4)突變檢測(cè):聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，直接根據(jù)酶切PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的DNA片段數(shù)量及DNA片段大小，檢測(cè)mtDNA是否發(fā)生T12338C突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(I)所述從血標(biāo)本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片或唾液的樣本中快速提取基因組DNA，通過以下方法獲得: (1)血標(biāo)本:取20 200μ I血標(biāo)本或Icm2的血濾紙片放入1.5ml離心管，加入900 μ I紅細(xì)胞裂解緩沖液，20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH 7.6，室溫靜置lOmin，充分裂解紅細(xì)胞，12000rpm離心lmin，收集白細(xì)胞沉淀； (2)帶毛囊的毛發(fā):用體積比70%乙醇洗帶毛囊的毛發(fā)I次，后再用蒸餾水沖洗毛發(fā)2次，在1.5ml離心管中分別放入2 4根毛發(fā)，毛囊置于離心管底部，用干凈的剪刀剪去毛發(fā)聞?dòng)谏行墓艿牟糠郑? (3)口腔粘膜刮片或唾液:收集唾液前，必須讓被收集者漱口，以除去口腔中過多的老化細(xì)胞、食物殘?jiān)⒀栏?、咖啡、煙等物質(zhì)，半小時(shí)內(nèi)不要喝水、進(jìn)食、吸煙，然后開始收集口腔粘膜刮片或唾液，選擇如下方法收集唾液樣本:①舌頭圍繞口腔刮取粘膜細(xì)胞，將0.1ml唾液直接吐進(jìn)離心管內(nèi)；②生理鹽水漱口，吐進(jìn)離心管內(nèi)，吸取PBS溶液至裝有通過上述任一種方法收集的唾液樣本的離心管中，反復(fù)吹打后，12000rpm離心5min，除去上清，重復(fù)該過程一次用棉拭子反復(fù)刮拭面頰內(nèi)壁6次，空氣中干燥，然后用滅菌過的鑷子小心撕去其外表面，放入離心管中；④將唾液吐在濾紙上，空氣中干燥后形成唾液斑，再用干凈的剪刀剪成大小約Icm2碎紙片置于離心管中； 然后用細(xì)胞裂解液和蛋白酶K對(duì)上述樣本進(jìn)行消化裂解，利用鹽析法去除蛋白雜質(zhì)，異丙醇沉淀DNA，最后 用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明提供一種Leber病之線粒體T12338C檢測(cè)試劑盒，由置于盒體內(nèi)的DNA提取混合液、擴(kuò)增T12338C的PCR混合液、針對(duì)T12338C設(shè)計(jì)的一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物、限制性內(nèi)切酶PsiⅠ、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照構(gòu)成。本發(fā)明從少量的血液標(biāo)本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片或唾液等樣本中快速提取基因組DNA，既解決傳統(tǒng)上從原發(fā)性Leber氏病患者血液中提取DNA的問題，減輕被檢者的痛苦，又解決了跨地區(qū)傳遞樣本的問題，提高酶切特異性，避免出現(xiàn)假陰性，提高檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。本發(fā)明是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)試劑盒?？蓪?shí)行原發(fā)性Leber氏病相關(guān)的mtDNAT12338C突變的篩查和預(yù)防性檢查。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103173545SQ20131006933
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者冀延春, 管敏鑫, 蔣萍萍, 梁敏, 張娟娟, 徐靜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)