專利名稱：全自動(dòng)細(xì)胞非染色圖像識(shí)別計(jì)數(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，尤其涉及一種檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量和活性的全自動(dòng)細(xì)胞非染色圖像識(shí)別計(jì)數(shù)方法。
背景技術(shù)：
由于細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)必須保持一定的濃度才能有較好的活性，因此在細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、凍存過程中需要根據(jù)實(shí)際情況多次進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；目前，常用的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法包括自動(dòng)圖像識(shí)別法和電阻抗計(jì)數(shù)法。電阻抗計(jì)數(shù)法是:以檢測(cè)電解質(zhì)溶液中懸浮的細(xì)胞在通過計(jì)數(shù)通道時(shí)引起的電阻變化為基礎(chǔ)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和體積的測(cè)定，這種方法稱為電阻抗法，也稱為庫(kù)爾特原理。電阻抗法缺點(diǎn):1、由于電阻抗法中的小孔管的內(nèi)徑僅有25 μ m，因此目前采用電阻抗的儀器均無(wú)法對(duì)直徑大于25 μ m的細(xì)胞比如人類的卵細(xì)胞直徑達(dá)100 μ m進(jìn)行計(jì)數(shù)，2、細(xì)胞碎片形成的團(tuán)塊、稀釋液中的雜質(zhì)團(tuán)塊以及雙聯(lián)體細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞聚集，均會(huì)影響細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，3、細(xì)胞的計(jì)數(shù)信號(hào)和干擾信號(hào)在放大過程中同時(shí)被放大，極大的影響了結(jié)果的可靠性；4、為了使儀器能準(zhǔn)確甄別細(xì)胞，儀器需要進(jìn)行經(jīng)常性的質(zhì)控，設(shè)定閾值，操作繁瑣；5、同時(shí)檢測(cè)電場(chǎng)的存在，對(duì)細(xì)胞的活性以及將來(lái)的再培養(yǎng)也會(huì)產(chǎn)生不良影響。圖像識(shí)別法原理是:根據(jù)存活狀態(tài)的細(xì)胞，細(xì)胞膜完整，染色劑臺(tái)盼藍(lán)不能穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜，只能使細(xì)胞膜染色但細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)不能被染色。而死亡后的細(xì)胞，其細(xì)胞膜失去完整性，臺(tái)盼藍(lán)就能穿過死細(xì)胞的細(xì)胞膜，使細(xì)胞胞漿和核碎裂后散在于胞漿內(nèi)的細(xì)胞核被染成藍(lán)色，從而得以間接鑒別細(xì)胞的存活或死亡狀態(tài)。在顯微鏡下，活細(xì)胞成像特征是:染色后的細(xì)胞，細(xì)胞膜周圍有一圈藍(lán)色，細(xì)胞中心區(qū)域透亮，呈現(xiàn)為一透亮的圓環(huán)狀；死細(xì)胞的圖像則呈現(xiàn)為可以與背景顏色區(qū)別開來(lái)的藍(lán)色的圓形或橢圓形斑點(diǎn)。通過光學(xué)系統(tǒng)將細(xì)胞計(jì)數(shù)板上已知樣本體積的特定`區(qū)域的細(xì)胞圖像放大，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像識(shí)別軟件通過圖形抓取，分析圖像的圓度、直徑、顏色灰度等參數(shù)，能全自動(dòng)計(jì)算出計(jì)數(shù)板中活細(xì)胞濃度(數(shù)量/毫升)、死細(xì)胞濃度(數(shù)量/毫升)、細(xì)胞總數(shù)(含死細(xì)胞和活細(xì)胞)值，活細(xì)胞比例等數(shù)據(jù)，并能存儲(chǔ)到儀器內(nèi)或通過U盤等轉(zhuǎn)移到其他計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)介質(zhì)。但圖像識(shí)別法的缺點(diǎn):1、此類方法中常用的染料均為核染料，對(duì)活細(xì)胞有一定的毒性；2、只能實(shí)現(xiàn)離線計(jì)數(shù)，細(xì)胞必須脫離培養(yǎng)體系方能計(jì)數(shù)，不能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線計(jì)數(shù)即不脫離培養(yǎng)體系；3、對(duì)于胚胎細(xì)胞需要后續(xù)培養(yǎng)增殖的細(xì)胞是不能使用的。4、無(wú)法判斷具有內(nèi)吞功能細(xì)胞的活性及數(shù)量，以及處于細(xì)胞凋亡過程中后期的細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入不可逆的死亡程序，但仍拒染臺(tái)盼藍(lán)。因此傳統(tǒng)的細(xì)胞經(jīng)染色后再進(jìn)行圖像識(shí)別的細(xì)胞計(jì)數(shù)法存在較大的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決傳統(tǒng)的細(xì)胞經(jīng)染色后再進(jìn)行圖像識(shí)別的細(xì)胞計(jì)數(shù)法存在的對(duì)活細(xì)胞產(chǎn)生毒性、無(wú)法在線計(jì)數(shù)、對(duì)染色后的胚胎細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)增殖以及無(wú)法判斷具有內(nèi)吞功能細(xì)胞的活性及數(shù)量的問題，本發(fā)明的目的是提供一種全自動(dòng)細(xì)胞非染色圖像識(shí)別計(jì)數(shù)方法，該方法避免使用臺(tái)盼藍(lán)帶來(lái)的潛在毒性，不僅能對(duì)各種大小細(xì)胞進(jìn)行活性計(jì)數(shù)，而且能對(duì)無(wú)法用臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞如生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞進(jìn)行活性計(jì)數(shù)，同時(shí)也能方便的實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確在線計(jì)數(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案是以下述方式實(shí)現(xiàn)的:
一種全自動(dòng)細(xì)胞非染色圖像識(shí)別計(jì)數(shù)方法，該方法選擇圖像識(shí)別法全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，該計(jì)數(shù)儀結(jié)構(gòu)包括點(diǎn)光源、凸透鏡、計(jì)數(shù)片、調(diào)焦物鏡、濾光片、感光芯片、數(shù)據(jù)線、控制器、圖像識(shí)軟件、顯示器；
操作步驟如下:
用移液器取待測(cè)細(xì)胞懸液，直接加入計(jì)數(shù)片中并插入計(jì)數(shù)儀；
打開感光芯片的參數(shù)設(shè)置；
先做白平衡，記錄白平衡后的所有參數(shù)值，將這些參數(shù)值作為基本值；
降低紅光R增益、綠光G增益，即降低感光芯片對(duì)紅光R、綠光G光強(qiáng)的接收能力，此時(shí)儀器已經(jīng)調(diào)至最佳值并設(shè)為默認(rèn)值；
增大藍(lán)光B的增益，即增強(qiáng)了感光芯片對(duì)藍(lán)光B光強(qiáng)的接收能力，增大幅度為基本值的I至2倍，此時(shí)計(jì)數(shù)儀已經(jīng)調(diào)至最佳值并設(shè)為默認(rèn)值；
此時(shí)顯示器背景為淺藍(lán)色，點(diǎn)光源發(fā)出的光經(jīng)凸透鏡、計(jì)數(shù)片、調(diào)焦物鏡、濾色片、感光芯片將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，并經(jīng)數(shù)據(jù)線傳輸?shù)娇刂破?，最終在顯示器上顯示的背景為淺藍(lán)色，此時(shí)儀器已經(jīng)調(diào)至最佳值并設(shè)為默認(rèn)值；
此時(shí)計(jì)數(shù)儀光路中的濾光片阻止了紅光R、綠光G光的干擾，只允許藍(lán)光B光通過，這時(shí)活細(xì)胞反射的藍(lán)光B光強(qiáng)度大于死細(xì)胞反射的藍(lán)光B光強(qiáng)度；
關(guān)掉自動(dòng)曝光功能，手動(dòng)調(diào)節(jié)曝光時(shí)間和曝光增益，以能將死細(xì)胞圖像與背景明顯區(qū)分開為準(zhǔn)，此時(shí)儀器已經(jīng)調(diào)至最佳值并設(shè)為默認(rèn)值，具體調(diào)節(jié)方法:活細(xì)胞反射的藍(lán)光B因強(qiáng)度大，首先在感光芯片上成像，顯示器能逐漸看到比背景顏色深的圓形藍(lán)斑；繼續(xù)增加曝光時(shí)間，因?yàn)槠毓鈺r(shí)間過長(zhǎng)，出現(xiàn)過曝現(xiàn)象，先出現(xiàn)的比背景顏色深的圓形藍(lán)斑變?yōu)閳A形亮斑，同時(shí)會(huì)有新的比背景顏色深的圓形藍(lán)斑出現(xiàn)；此時(shí)，顯示器的背景是淺藍(lán)色，圓形亮斑是活細(xì)胞的圖像，而比背景藍(lán)色深的圓形藍(lán)斑就是死細(xì)胞的圖像，通過細(xì)胞圖像識(shí)別軟件分析，得到準(zhǔn)確的對(duì)各種大小細(xì)胞活性分析數(shù)據(jù)。所述記錄白平衡后的所有參數(shù)值:包括紅光R增益、綠光G增益、藍(lán)光B增益、伽馬值、對(duì)比度、自動(dòng)色彩增益、自動(dòng)曝光值。所述降低感光芯片對(duì)紅光R、綠光G光強(qiáng)度的接收能力時(shí)，其值降低為基本值的1/3至2/3之間。本發(fā)明的原理是:依據(jù)活細(xì)胞對(duì)光的折光率小，光能吸收少，反射的光強(qiáng)大；死細(xì)胞對(duì)光的折光率大，光能吸收多，反射的光強(qiáng)小的原理。在同樣的白光光源照射下，死細(xì)胞和活細(xì)胞反射的光強(qiáng)是不同的，活細(xì)胞反射的光強(qiáng)大于死細(xì)胞。本發(fā)明的積極效果是:
無(wú)需使用染料可對(duì)細(xì)胞進(jìn) 行活性計(jì)數(shù)，避免使用臺(tái)盼藍(lán)染色給待檢測(cè)細(xì)胞帶來(lái)的潛在毒性，檢測(cè)后的細(xì)胞可繼續(xù)生存，特別對(duì)諸如胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞比較珍貴的細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行活性計(jì)數(shù)，具有重要的實(shí)用價(jià)值。同時(shí)該發(fā)明能實(shí)現(xiàn)非染色實(shí)時(shí)在線細(xì)胞計(jì)數(shù)，可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、胚胎、生殖等生命科學(xué)研究領(lǐng)域。說明書附圖:


圖1為本發(fā)明采用的圖像識(shí)別法全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀結(jié)構(gòu)示意 圖2為感光芯片的參數(shù)設(shè)置表；
圖3為采用本發(fā)明方法拍攝的死細(xì)胞和活細(xì)胞圖片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
實(shí)施例一
由圖1可以看出:本發(fā)明選擇圖像識(shí)別法全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，該計(jì)數(shù)儀結(jié)構(gòu)包括點(diǎn)光源1、凸透鏡2、計(jì)數(shù)片3、調(diào)焦物鏡4、濾光片5、感光芯片6、數(shù)據(jù)線7、控制器8、圖像識(shí)軟件
9、顯示器10 ;其操作步驟如下:
首先用移液器取待測(cè)細(xì)胞懸液10ul，將非染色的細(xì)胞懸液直接加入3計(jì)數(shù)片中并插入計(jì)數(shù)儀；
由圖2可以看出:打開感光芯片6的參數(shù)設(shè)置已經(jīng)調(diào)至最佳值并設(shè)為默認(rèn)值；
先做白平衡，記錄白平衡后的所有參數(shù)值:包括紅光R增益、綠光G增益、藍(lán)光B增益、伽馬值、對(duì)比度、自動(dòng)色彩增益、自動(dòng)曝光值，將這些參數(shù)值作為基本值；
降低紅光R、綠光G的增益，使紅光R、綠光G降為基本值的1/3至2/3之間，即降低了感光芯片6)對(duì)紅光R、綠光G光強(qiáng)度的接收能力，此時(shí)計(jì)數(shù)儀已經(jīng)調(diào)至最佳值并設(shè)為默認(rèn)值；
增大藍(lán)光B的增益，增大為基本值的I至2倍，即增強(qiáng)了感光芯片6對(duì)藍(lán)光B光強(qiáng)度的接收能力，此時(shí)計(jì)數(shù)儀已經(jīng)調(diào)至最佳值并設(shè)為默認(rèn)值；
此時(shí)顯示器10背景為淺藍(lán)色:點(diǎn)光源I發(fā)出的光經(jīng)凸透鏡2、計(jì)數(shù)片3、調(diào)焦物鏡4、濾色片5、感光芯片6將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，并經(jīng)數(shù)據(jù)線7傳輸?shù)娇刂破?，最終在顯示器10上顯示的背景為淺藍(lán)色，此時(shí)儀器已經(jīng)調(diào)至最佳值并設(shè)為默認(rèn)值；
此時(shí)記數(shù)儀光路中的濾光片5阻止了紅光R、綠光G的干擾，只允許藍(lán)光B通過，這時(shí)活細(xì)胞反射的藍(lán)光B強(qiáng)度大于死細(xì)胞反射的藍(lán)光B強(qiáng)度；
關(guān)掉自動(dòng)曝光功能，手動(dòng)調(diào)節(jié)曝光時(shí)間和曝光增益，不同種類和廠家生產(chǎn)的感光芯片6需要調(diào)節(jié)的范圍不同，以能將死細(xì)胞圖像與背景明顯區(qū)分開為準(zhǔn)此時(shí)計(jì)數(shù)儀已經(jīng)調(diào)至最佳值并設(shè)為默認(rèn)值，具體調(diào)節(jié)方法:活細(xì)胞反射的藍(lán)光B因強(qiáng)度大，首先在感光芯片6上成像，顯示器10能逐漸看到比背景顏色深的圓形藍(lán)斑；繼續(xù)增加曝光時(shí)間，先出現(xiàn)的比背景顏色深的圓形藍(lán)斑變?yōu)閳A形亮斑，因?yàn)槠毓鈺r(shí)間過長(zhǎng)，出現(xiàn)過曝現(xiàn)象，同時(shí)會(huì)有新的比背景顏色深的圓形藍(lán)斑出現(xiàn)，由圖3可以看出:此時(shí)，顯示器10的背景是淺藍(lán)色，圓形亮斑是活細(xì)胞的圖像，而比背景藍(lán)色深的圓形藍(lán)斑就是死細(xì)胞的圖像，通過細(xì)胞圖像識(shí)別軟件9分析，得出死細(xì)胞濃度:1X105，活細(xì)胞濃度:2X106。對(duì)比試驗(yàn)
使用移液器分別取細(xì)胞懸液50ul，加入A管和B管；將B管加入50ul臺(tái)盼藍(lán)(0.4%)后混勻；
選擇與實(shí)施例中的圖像識(shí)別法全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，該圖像識(shí)別法全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，設(shè)有兩個(gè)功能位，即“非染色”功能計(jì)數(shù)“ I ”位、“染色”功能計(jì)數(shù)“2”位；
從B管取IOul加入圖像識(shí)別法全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的計(jì)數(shù)片，使用“染色”功能計(jì)數(shù)“2”位，按傳統(tǒng)的圖像識(shí)別法步驟操作。從A管取IOu l加入圖像識(shí)別法全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的計(jì)數(shù)片，使用“非染色”功能計(jì)數(shù)“ I”位，按實(shí)施例一操作步驟操作。結(jié)果顯示兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果誤差在5%之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種全自動(dòng)細(xì)胞非染色圖像識(shí)別計(jì)數(shù)方法，該方法選擇圖像識(shí)別法全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，該計(jì)數(shù)儀結(jié)構(gòu)包括點(diǎn)光源(I)、凸透鏡(2)、計(jì)數(shù)片(3)、調(diào)焦物鏡(4)、濾光片(5)、感光芯片(6)、數(shù)據(jù)線(7)、控制器(8)、圖像識(shí)別軟件(9)、顯示器(10);其特征在于操作步驟如下: 用移液器取待測(cè)細(xì)胞懸液，直接加入計(jì)數(shù)片(3)中并插入計(jì)數(shù)儀； 打開感光芯片(6)的參數(shù)設(shè)置； 降低紅光R增益、綠光G增益，即降低感光芯片(6)對(duì)R、G光強(qiáng)的接收能力，此時(shí)儀器已經(jīng)調(diào)至最佳值并設(shè)為默認(rèn)值； 增大藍(lán)光B的增益，即增強(qiáng)了感光芯片(6)對(duì)B光強(qiáng)的接收能力； 此時(shí)顯示器(10)背景為淺藍(lán)色，點(diǎn)光源(I)發(fā)出的光經(jīng)凸透鏡(2)、計(jì)數(shù)片(3)、調(diào)焦物鏡(4)、濾色片(5)、感光芯片(6)將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，并經(jīng)數(shù)據(jù)線(7)傳輸?shù)娇刂破?8)，最終在顯示器(10)上顯示的背景為淺藍(lán)色，此時(shí)儀器已經(jīng)調(diào)至最佳值并設(shè)為默認(rèn)值； 此時(shí)計(jì)數(shù)儀光路中的濾光片(5)阻止了 R、G光的干擾，只允許B光通過，這時(shí)活細(xì)胞反射的B光強(qiáng)度大于死細(xì)胞反射的B光強(qiáng)度； 關(guān)掉自動(dòng)曝光功能，手動(dòng)調(diào)節(jié)曝光時(shí)間和曝光增益，以能將死細(xì)胞圖像與背景明顯區(qū)分開為準(zhǔn)，此時(shí)儀器已經(jīng)調(diào)至最佳值并設(shè)為默認(rèn)值，具體調(diào)節(jié)方法:活細(xì)胞反射的藍(lán)光B因強(qiáng)度大，首先在感光芯片(6)上成像，顯示器(10)能逐漸看到比背景顏色深的圓形藍(lán)斑；繼續(xù)增加曝光時(shí)間，因?yàn)槠毓鈺r(shí)間過長(zhǎng)，出現(xiàn)過曝現(xiàn)象，先出現(xiàn)的比背景顏色深的圓形藍(lán)斑變?yōu)閳A形亮斑，同時(shí)會(huì)有新的比背景顏色深的圓形藍(lán)斑出現(xiàn)；此時(shí)，顯示器(10)的背景是淺藍(lán)色，圓形亮斑是活細(xì)胞的圖像，而比背景藍(lán)色深的圓形藍(lán)斑就是死細(xì)胞的圖像，通過細(xì)胞圖像識(shí)別軟件分析(9)，得到準(zhǔn)確的對(duì)各種大小細(xì)胞活性分析數(shù)據(jù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全自動(dòng)細(xì)胞非染色圖像識(shí)別計(jì)數(shù)方法，其特征在于:感光芯片(6)對(duì)B光強(qiáng)的接收能力增大幅度為基本值的I至2倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的全自動(dòng)細(xì)胞非染色圖像識(shí)別計(jì)數(shù)方法，其特征在于:打開感光芯片(6)的參數(shù)設(shè)置后先做白平衡，記錄白平衡后的所有參數(shù)值，將這些參數(shù)值作為基本值。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的全自動(dòng)細(xì)胞非染色圖像識(shí)別計(jì)數(shù)方法，其特征在于:所述記錄白平衡后的所有參數(shù)值:包括紅光R增益、綠光G增益、藍(lán)光B增益、伽馬值、對(duì)比度、自動(dòng)色彩增益、自動(dòng)曝光值。
5.根據(jù)權(quán)利要求 4所述的全自動(dòng)細(xì)胞非染色圖像識(shí)別計(jì)數(shù)方法，其特征在于:所述降低感光芯片(6)對(duì)紅光R、綠光G光強(qiáng)度的接收能力時(shí)，其值降低為基本值的1/3至2/3之間。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種全自動(dòng)細(xì)胞非染色圖像識(shí)別計(jì)數(shù)方法，它選擇圖像識(shí)別法全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，將待測(cè)細(xì)胞懸液直接加入計(jì)數(shù)片并插入計(jì)數(shù)儀，通過降低感光芯片對(duì)紅光R、綠光G光強(qiáng)度的接收能力、增強(qiáng)對(duì)藍(lán)光B光強(qiáng)的接收能力的操作和手動(dòng)調(diào)節(jié)曝光時(shí)間和曝光增益，使顯示器的背景為淺藍(lán)色，圓形亮斑為活細(xì)胞的圖像，而比背景藍(lán)色深的圓形藍(lán)斑就是死細(xì)胞的圖像，通過細(xì)胞圖像識(shí)別軟件分析，得到準(zhǔn)確的對(duì)各種大小細(xì)胞活性分析數(shù)據(jù)。本發(fā)明無(wú)需使用染料可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活性計(jì)數(shù)，避免使用臺(tái)盼藍(lán)染色給待檢測(cè)細(xì)胞帶來(lái)的潛在毒性，檢測(cè)后的細(xì)胞可繼續(xù)生存，在培養(yǎng)過程中進(jìn)行活性計(jì)數(shù)，同時(shí)該發(fā)明能實(shí)現(xiàn)非染色實(shí)時(shí)在線細(xì)胞計(jì)數(shù)，可廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK103146800SQ20131010140
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月27日
發(fā)明者朱耀輝, 余海濱, 趙光 申請(qǐng)人:朱耀輝, 余海濱, 趙光