專利名稱：鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的分子標(biāo)記方法以及試劑盒和引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及鑒定青花菜雜交種‘海綠’真實性和或品種純度的分子標(biāo)記方法以及試劑盒和引物。
背景技術(shù)：
優(yōu)良品種是作物高產(chǎn)的基礎(chǔ)，品種混雜和純度不高則會明顯降低產(chǎn)量和商品品質(zhì)?？焖贉?zhǔn)確地鑒定品種和進(jìn)行純度分析對于種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、品種審定、假種辨別、產(chǎn)權(quán)糾紛均有重要作用。目前，我國種子生產(chǎn)和經(jīng)營管理還不太規(guī)范，不合格的種子屢屢混入市場并用于生產(chǎn)，造成減產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)損失，因此品種純度鑒定顯得尤為重要(吳敏生，王守才，戴景瑞，DNA指紋圖譜技術(shù)在品種鑒定和純度分析上的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，1998，6 (1):51-56;王忠華.DNA指紋圖譜技術(shù)及其在作物品種資源中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2006，4 (3):425-430.)。目前生產(chǎn)中，青花菜雜交種通過自交不親和系或雄性不育系制種。利用母本的自交不親和性制種，由于自交不親和性受環(huán)境因素影響會有少量自交種產(chǎn)生從而影響雜交種純度。如不及時有效鑒定雜交種純度，則會給青花菜生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。因此，對青花菜雜交種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確而高效的純度鑒定，對青花菜雜交種的推廣應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實意義。傳統(tǒng)的品種純度檢測方法有多種:幼苗鑒定、蛋白質(zhì)電泳方法以及田間小區(qū)種植鑒定等(潘顯政.農(nóng)作物種子檢驗員學(xué)習(xí)讀本[M].北京:中國工商出版社.2006:239 245.)。這些檢測方法費時費力且不夠直觀。以DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)如簡單重復(fù)序列(SSR)等，具有檢測位點數(shù)量多，多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點，已在青花菜品種鑒定、種子純度檢測和品種親緣關(guān)系及分類等方面得到應(yīng)用，并發(fā)揮著越來越重要的作用。

‘海綠’是由寧波海通食品科技有限公司、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所等多家單位聯(lián)合選育的國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)青花菜雜交種，該品種的兩個親本均為通過小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的DH系。2012年12月通過浙江省非主要農(nóng)作物品種審定委員會審定(浙(非)審蔬2012010)。‘海綠’是通過小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得的具有自產(chǎn)知識產(chǎn)權(quán)的兩個DH系親本雜交而成的優(yōu)質(zhì)品種。為保證該優(yōu)良品種產(chǎn)生最大的經(jīng)濟(jì)效益，需要一種權(quán)威、準(zhǔn)確、穩(wěn)定檢測方法對其商品種子的真?zhèn)渭捌浼兌冗M(jìn)行快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前青花菜品種種子純度鑒定大多依靠田間表現(xiàn)型觀察方法所存在的鑒定時間長、受季節(jié)性限制及作物的表現(xiàn)型易隨環(huán)境條件變化等缺陷，本發(fā)明的一個目的是提供鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的引物，本發(fā)明的二個目的是提供鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的試劑盒，本發(fā)明的三個目的是提供鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的分子標(biāo)記鑒定方法，本發(fā)明的方法能早期、全年、快速、準(zhǔn)確鑒定青花菜品種純度和或品種真?zhèn)巍?br> 為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的引物，該引物為以下的4對引物中的I對或多對
組合:
1)引物0112-D05:上游引物的序列為5’ -TCCATGACCAACGACAAGGTC-3’，下游引物的序列為 5’ -AAGAGGCGACTTCTATTGCG-3’ ；
2)引物Ral-F06:上游引物的序列為5’ -ACCAAAATGTGTGAAGCCAC-3’，下游引物的序列為 5， -CTTGTGGCCAGATTCATCAC-3，；
3)引物FIT0439:上游引物的序列為5’ -CGAGAAGAGATAGCGGGT-3’，下游引物的序列為5’ -AGGTTGTGACTCCATCAAAG-3’ ；
4)引物OllO-All:上游引物的序列為5’ -CACAATTTCTCAGACAAAACGG-3’;下游引物的序列為 5’ -GAGCTGGCTCATTCAACTCC-3’。為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的試劑盒，該試劑盒包括:上述技術(shù)方案所述的引物；dNTP ；Mg2+ ；PCR 緩沖液；Taq DNA 聚合酶。作為優(yōu)選，所述的試劑盒還可以包括染色液和顯色液，染色液為AgNO3溶液，顯色液為NaOH、硼砂和甲醛的混合溶液。

為了實現(xiàn)上述的第三個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的分子標(biāo)記鑒定方法，該方法包括如下步驟:
1)提取青花菜基因組DNA;
2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增:在PCR管中加入步驟I)提取的青花菜基因組DNA15^30ng ;權(quán)利要求 I 所述的一對引物 0.2^0.8 μ M ；dNTP 0.15^0.5mM ；Mg2+l.2^2.0mM；l 倍的 PCR 緩沖液；Taq DNA聚合酶0.8^1.2單位，加無菌超純水至15 μ L，進(jìn)行擴(kuò)增；
3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析:在步驟2)的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入甲酰胺上樣緩沖液，混勻，將混合物在質(zhì)量體積比濃度9%的雙垂直板非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，200V穩(wěn)壓電泳2-3h，至二甲苯腈到達(dá)凝膠的2/3位置處停止電泳，凝膠經(jīng)AgNO3染色和顯色液顯色后照相；
4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶特征，通過以下的特征鑒定青花菜雜交種‘海綠’純
度:
SSR引物0112-D05產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記0112-D05210條帶大小為210bp，產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記0112-D05200條帶大小為200bp ；
SSR引物Ral-F06產(chǎn)生的三條母本特異標(biāo)記Ral_F06135、Ral_F06145和Ral_F06155條帶大小分別為135bp、145bp和155bp，產(chǎn)生的三條父本特異標(biāo)記Ral-F06140、Ral-F06150和Ral-F06160條帶大小分別為140bp、150bp和160bp ；
SSR引物FIT0439產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記FIT0439760條帶大小分別為760bp，產(chǎn)生的兩條父本特異標(biāo)記FIT0439400和FIT0439700條帶大小分別為400bp和700bp ；
SSR引物01 IOAlI產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記01 IOAl1120條帶大小為120bp，產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記01 IOAl 1110條帶大小為I IObp。作為優(yōu)選，所述的甲酰胺上樣緩沖液包括98%甲酰胺+IOmM EDTA+0.25%溴酚蘭+0.25% 二甲苯腈。
作為優(yōu)選，所述的擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性120 180秒，94°C變性60秒，50 55°C退火30秒，72 °C延伸45 90秒，25 35個循環(huán)，再72 °C延伸300 420秒，擴(kuò)增完成。本發(fā)明的主要依據(jù)是:從所用引物中篩選出三個共顯性標(biāo)記，即能夠在一代雜種中同時產(chǎn)生父本、母本特異標(biāo)記條帶，且?guī)颓逦?、重?fù)性好、可靠性強(qiáng)的引物四個，分別是0112-D05、FIT0439、Ral-F06和01 IOAl I?？赏ㄟ^檢測青花菜雜交種中是否同時具有父母本的特異條帶來確定是否雜交種。如果同時具有父母本特異條帶，則說明是雜交種。如果只有母本特異條帶，則說明是自交結(jié)實的種子而非雜交種。如果是其它條帶或沒有條帶，則說明不是自交種也不是雜交種。本發(fā)明的有益效果為:可以明確區(qū)分和判別青花菜的不同品種，實現(xiàn)準(zhǔn)確、快速鑒定品種真實性和品種純度，從而為品種鑒定、種子市場管理、品種保護(hù)、播前種子質(zhì)量控制及良種繁育等提供可靠技術(shù)。無需在田間進(jìn)行，不受天氣影響，而且檢測周期大大縮短。


圖1為青花菜‘海綠’種子檢測特征引物0112-D05的SSR-PCR電泳圖譜。圖2為青花菜‘海綠’種子檢測特征引物FIT0439的SSR-PCR電泳圖譜。圖3為青花菜‘海綠’種子檢測特征引物Ral_F06的SSR-PCR電泳圖譜。圖4為青花菜‘海綠’種子檢測特征引物0110A11的SSR-PCR電泳圖譜。M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P1: ‘海綠’父本；P2 ‘海綠’母本；F1: ‘海綠’Fl雜交種;L1 L4分別為青花菜‘優(yōu)秀’、‘綠雄90’、‘耐寒優(yōu)秀’、‘喜鵲’等品種。
具體實施例方式
下面通過基于PCR技術(shù)的SSR標(biāo)記分析實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。本實施例的實驗材料為青花菜‘海綠’商品種子及其親本、生產(chǎn)上常用的4個其它青花菜品種(優(yōu)秀、綠雄90、耐寒優(yōu)秀、喜鵲)。方法:提取青花菜葉片的DNA，采用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，統(tǒng)計結(jié)果并篩選特征弓I物。1.青花菜基因組DNA提取 采用常規(guī)方法提取青花菜基因組DNA。2.分子標(biāo)記分析
SSR 反應(yīng)體系為基因組 DNA 20 ng，Mg2+ 1.8 mM, dNTP 0.2 mM，引物 0.6 μ M，I 倍的 PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶0.8 U，加無菌超純水至15 μ L。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序:94°C 120 秒，94°C 60 秒，50 55°C 30 秒，72°C 90 秒，30 個循環(huán)；72°C 300 秒。在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入甲酰胺上樣緩沖液(98%甲酰胺+IOmM EDTA+0.25%溴酚蘭+0.25%二甲苯腈)，混勻，在雙垂直板9%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行凝膠電泳分析，200V穩(wěn)壓電泳疒3 h，至二甲苯腈到達(dá)凝膠的2/3位置處停止電泳。凝膠經(jīng)銀染(0.2% AgNO3溶液)30min ;用顯色液(1.5% NaOH, 0.4%甲醛)，顯色后用清水清洗后照相。3.篩選純度鑒定的特征引物
從所用的引物中篩選出能夠在一代雜種中同時產(chǎn)生父、母本特異標(biāo)記條帶，且?guī)颓逦⒅貜?fù)性好、可靠性強(qiáng)的引物共4對，分別是0112-D05、Ral-F06、FIT0439和0110A11，可作為青花菜‘海綠’種子真實性和/或品種純度鑒定的特征引物(附圖)。其中0112-D05、Ral-F06和FIT0439這3對引物可將‘海綠’與其它四個青花菜品種區(qū)分開。4對SSR引物序列為:
引物 0112-D05
F:5’ -TCCATGACCAACGACAAGGTC-3’，
R:5’ -AAGAGGCGACTTCTATTGCG-3’ ；
引物 FIT0439
F:5，-CGAGAAGAGATAGCGGGT-3，，
R:5’ -AGGTTGTGACTCCATCAAAG-3’ ；
引物 Ral-F06
F:5’ -ACCAAAATGTGTGAAGCCAC-3’，
R:5’ -CTTGTGGCCAGATTCATCAC-3’ ；
引物 OllO-All
F:5’ -CACAATTTCTCAGACAAAACGG-3 ；
R:5’ -GAGCTGGCTCATTCAACTCC-3’。SSR引物0112-·D05產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記0112_D0521(I條帶大小為210bp，產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記0112-D05.條帶大小為200bp ；SSR引物Ral_F06產(chǎn)生的三條母本特異標(biāo)記Ral-F06135、Ral-F06145 和 Ral_F06155 條帶大小分別為 135bp、145bp 和 155bp，產(chǎn)生的三條父本特異標(biāo)記 Ral-F0614Q、Ral-F06150 和 Ral-F06160 條帶大小分別為 140bp、150bp 和 160bp ；SSR引物FIT0439產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記FIT0439.條帶大小分別為760bp，產(chǎn)生的兩條父本特異標(biāo)記FIT04394(i(i和FIT04397(i(i條帶大小分別為400bp和700bp ；SSR引物0110A11產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記OIIOAII12ci條帶大小為120bp，產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記0110A1111(I條帶大小為IIObp。4.用特征引物對品種遺傳純度的鑒定
利用篩選到的4對SSR引物對青花菜‘海綠’進(jìn)行純度鑒定，步驟同1-3。只有同時具有雙親特異標(biāo)記條帶的單株才為真正的‘海綠’雜交種。通過應(yīng)用4對SSR引物對雜種單株幼苗的標(biāo)記基因型進(jìn)行分析，檢測得到的純度結(jié)果的平均值為雜交種的遺傳純度。這4個SSR標(biāo)記在多次重復(fù)中表明穩(wěn)定，分析結(jié)果可以相互驗證，可以準(zhǔn)確地鑒定青花菜‘海綠’雜交種純度。
權(quán)利要求
1.鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的引物，其特征在于該引物為以下的4對引物中的I對或多對組合: 1)引物Ol12-D05:上游引物的序列為5 ’ -TCCATGACCAACGACAAGGTC-3 ’，下游引物的序列為 5’ -AAGAGGCGACTTCTATTGCG-3’ ； 2)引物Ral-F06:上游引物的序列為5’ -ACCAAAATGTGTGAAGCCAC-3’，下游引物的序列為 5， -CTTGTGGCCAGATTCATCAC-3，； 3)引物FIT0439:上游引物的序列為5’ -CGAGAAGAGATAGCGGGT-3’，下游引物的序列為5’ -AGGTTGTGACTCCATCAAAG-3’ ； 4)引物OllO-All:上游引物的序列為5’ -CACAATTTCTCAGACAAAACGG-3’;下游引物的序列為 5’ -GAGCTGGCTCATTCAACTCC-3’。
2.鑒定青花菜雜交種 ‘海綠’品種純度的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括:權(quán)利要求1所述的引物；dNTP ；Mg2+ ；PCR緩沖液；Taq DNA聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的試劑盒，其特征在于試劑盒還可以包括染色液和顯色液，染色液為AgNO3溶液，顯色液為NaOH、硼砂和甲醛的混合溶液。
4.鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于該方法包括如下步驟: 1)提取青花菜基因組DNA; 2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增:在PCR管中加入步驟I)提取的青花菜基因組DNA15^30ng ;權(quán)利要求I所述的一對引物0.2 0.8 μ M ；dNTP 0.15 0.5mM ；Mg2+l.2 2.0 mM ；1倍的PCR緩沖液；Taq DNA聚合酶0.8^1.2單位，加無菌超純水至15 μ L，進(jìn)行擴(kuò)增； 3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析:在步驟2)的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入甲酰胺上樣緩沖液，混勻，將混合物在質(zhì)量體積比濃度9%的雙垂直板非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，200V穩(wěn)壓電泳2-3h，至二甲苯腈到達(dá)凝膠的2/3位置處停止電泳，凝膠經(jīng)AgNO3染色和顯色液顯色后照相； 4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶特征，通過以下的特征鑒定青花菜雜交種‘海綠’純度: SSR引物0112-D05產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記0112_D0521(I條帶大小為210bp，產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記0112-D052QQ條帶大小為200bp ； SSR引物Ral-F06產(chǎn)生的三條母本特異標(biāo)記Ral_F06135、Ral_F06145和Ral_F06155條帶大小分別為135bp、145bp和155bp，產(chǎn)生的三條父本特異標(biāo)記Ral-F0614(l、Ral_F0615(l和Ral-F06160 條帶大小分別為 140bp、150bp 和 160bp ； SSR引物FIT0439產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記FIT0439.條帶大小分別為760bp，產(chǎn)生的兩條父本特異標(biāo)記FIT04394(KI和FIT04397(i(i條帶大小分別為400bp和700bp ； SSR引物01 IOAlI產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記OIIOAII12ci條帶大小為120bp，產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記OIIOAII1iq條帶大小為IlObp0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于:甲酰胺上樣緩沖液包括98%甲酰胺+IOmM EDTA+0.25%溴酚蘭+0.25% 二甲苯腈。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于:上述的擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性120 180秒，94°C變性60秒，5(T55°C退火30秒，72°C延伸45 90秒，25 35 個循環(huán)，再72 °C延伸300 420秒，擴(kuò)增完成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定青花菜雜交種‘海綠’品種純度的引物，該引物為以下的4對引物中的1對或多對組合1)引物Ol12-D05；2)引物Ra1-F06；3)引物FITO439；4)引物Ol10-A11。本發(fā)明的有益效果為可以明確區(qū)分和判別青花菜的不同品種，實現(xiàn)準(zhǔn)確、快速鑒定品種真實性和品種純度，從而為品種鑒定、種子市場管理、品種保護(hù)、播前種子質(zhì)量控制及良種繁育等提供可靠技術(shù)。
文檔編號C12N15/11GK103233077SQ201310177960
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月13日
發(fā)明者虞慧芳, 顧宏輝, 王建升, 趙振卿, 盛小光, 陳紀(jì)算, 許映君 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院