專利名稱：一種β-甘露聚糖酶、編碼基因及其生產(chǎn)菌和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一株產(chǎn)高溫β-甘露聚糖酶的曲霉屬真菌Aspergillus sp.T16，及從該菌中獲得的高溫β -甘露聚糖酶及編碼基因，和包含編碼該高溫酶基因的重組載體和酵母基因工程菌，以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β -甘露聚糖酶(endo-l, 4_ β-D-mannanmanno hydroase EC3.2.1.78)是一類水解i3-l，4_D-甘露聚糖糖苷鍵的內(nèi)切水解酶，屬于半纖維素酶類。其可水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖。甘露聚糖在自然界中含量豐富，廣泛存在于植物細(xì)胞中，如魔芋精粉、田青膠、角豆膠、澳大利亞蒲葵等(Dhawan S.&KaurJ., Critical reviews in biotechnology, 27 (4): 197-216)。甘露聚糖酶水解甘露聚糖為低聚糖，低聚糖由二至十個單糖通過糖苷鍵連接起來，具有低熱、穩(wěn)定、安全無毒等良好生理特性，可降低人體膽固醇水平，增加腸道雙歧桿菌，降低人體血糖，抑制有害菌的生長。β_甘露聚糖酶可廣泛應(yīng)用于造紙、食品、紡織、飼料和石油開采等領(lǐng)域，成為近年來研究的熱點(van Zyl ff, et al., Process Biochemistry, 45 (8): 1203-1213; Shallom D.&ShohamY., Current opinion in microbiology, 6(3):219-228)。β -甘露聚糖酶廣泛存在于植物、低等動物和微生物中(Chauhan PS, etal., Applied microbiology and biotechnology, 93:1817-1830)。微生物來源的 β_ 甘露聚糖酶廣泛分布于細(xì)菌、放線菌和真菌中，其具有寬泛的溫度和PH作用范圍，催化活力高，活力穩(wěn)定而成為工業(yè)用酶的主要來源(Duffaud, et al., Appl Environ Microbiol, 63 (I):169-177;Akino, et al., Appl.Microbial Biotech, 26:323-327)。目前，國內(nèi)外的研究和開發(fā)的甘露聚糖酶主要為中溫酶，其耐熱性較差，不能滿足工業(yè)應(yīng)用中一些高 溫工藝的要求。而近幾年國內(nèi)開發(fā)的酸性β_甘露聚糖酶，雖具有較高的最適溫度，但仍不能滿足一些高溫工藝要求。如中國發(fā)明專利201110086452.2公開了由一種來源于硫色曲霉的新型酸性甘露聚糖酶及其突變體，其最適溫度為65°C，在70°C有較好的穩(wěn)定性；中國發(fā)明專利201110410537.1公開了由一種來源于黑曲霉LW-1的新型酸性甘露聚糖酶，其最適溫度為70°C，在60°C以下穩(wěn)定；中國發(fā)明專利200810113343.3公開了由一種來源于Bispora sp.MEY-1的新型酸性甘露聚糖酶,其最適溫度為65°C,在60°C以下穩(wěn)定。國內(nèi)尚未有75°C及以上穩(wěn)定的耐熱甘露聚糖酶的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)高溫β -甘露聚糖酶的菌株Aspergillus sp.T16。本發(fā)明的目的是提供一種來源于上述菌株的高溫β -甘露聚糖酶。本發(fā)明的目的是提供上述高溫β_甘露聚糖酶的全基因。本發(fā)明再一目的是提供包含上述高溫β -甘露聚糖酶基因的重組載體。本發(fā)明再一目的是提供包含上述高溫β -甘露聚糖酶基因的重組菌株。
本發(fā)明再一目的是提供上述高溫β -甘露聚糖酶的表達(dá)方法。本發(fā)明再一目的是提供上述高溫β-甘露聚糖酶的應(yīng)用。一種高溫β -甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。一種高溫β -甘露聚糖酶基因manT16，是滿足下列要求的核苷酸序列之一:I)編碼如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的高溫β -甘露聚糖酶的核苷酸序列；2)序列表中SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；3)序列表中SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。包含所述高溫甘露聚糖酶基因manT16的重組載體為pGAPZa-manT16和pPICZa -manT16o包含所述高溫β -甘露聚糖酶基因manT16重組載體的高溫β -甘露聚糖酶酵母基因工程菌。構(gòu)建所述高溫β -甘露聚糖酶工程菌的方法，是將所述的重組載體pGAPZ a -manT16和pPICZ a -manT16導(dǎo)入畢赤酵母中獲得；所述高溫β _甘露聚糖酶基因manT16在重組載體pGAPZ a -manT16和pPICZ a -manT16中位于α分泌引導(dǎo)妝基因序列下游。用于構(gòu)建表達(dá)所述高溫甘露聚糖酶工程菌的出發(fā)菌株為畢赤酵母Χ-33或GS115。

一種表達(dá)高溫β -甘露聚糖酶的方法，培養(yǎng)所述的高溫β -甘露聚糖酶工程菌，組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)該β_甘露聚糖酶，提取純化后，得到高溫β_甘露聚糖酶。所述的高溫甘露聚糖酶能在食品、紡織、洗滌、醫(yī)藥、石油開采或動物飼料添加劑中應(yīng)用。一種曲霉屬真菌 Aspergillus sp.T16，其保藏號為:CCTCC N0:M2013122。本發(fā)明篩選獲得能夠用于食品、醫(yī)藥、洗滌、紡織、飼料和石油開采領(lǐng)域的高溫β -甘露聚糖酶。本發(fā)明人通過平板水解圈法初篩和微板培養(yǎng)法復(fù)篩，獲得一株產(chǎn)高溫β -甘露聚糖酶的曲霉屬真菌Aspergillus sp.T16,本菌株已保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為:CCTCC N0:M2013122。從上述菌株獲得一種新型高溫β -甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。該甘露聚糖酶最適溫度為75 °C，最適pH為3.5-5.0，可耐受75°C高溫，在ρΗ2.2-8.0下穩(wěn)定。本發(fā)明提供了編碼該高溫β -甘露聚糖酶的基因manT16，該酶的全基因序列如序列表中SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；編碼該高溫甘露聚糖酶成熟肽的cDNA序列如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了包含上述高溫β -甘露聚糖酶基因的重組載體pGAPZ a -manT16和pPICZa-manT16。高溫β -甘露聚糖酶基因在上述重組載體中位于α分泌引導(dǎo)肽基因序列下游。本發(fā)明的最優(yōu)方案是將高溫β_甘露聚糖酶基因插入到質(zhì)粒PGAPZ a A中的Xho I和Xba I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于GAP啟動子下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ a -manT16。本發(fā)明提供了包含上述高溫β -甘露聚糖酶基因的重組菌，是將上述重組載體導(dǎo)入畢赤酵母Χ-33或GS115中獲得。
本發(fā)明提供了表達(dá)高溫β -甘露聚糖酶的方法:培養(yǎng)上述的高溫β -甘露聚糖酶工程菌，組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)，過濾除菌后，得到高溫β -甘露聚糖酶。本發(fā)明提供了高溫甘露聚糖酶的應(yīng)用，在食品、紡織、洗滌、醫(yī)藥、石油開采或動物飼料添加劑領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。用基因工程手段產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)如此耐熱的高溫β_甘露聚糖酶目前尚未見報道。本發(fā)明提供的高溫β_甘露聚糖酶作用PH范圍廣，具有極好的耐熱性，可作為應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)的有效酶制劑，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)高溫甘露聚糖酶。本發(fā)明得到的一株產(chǎn)高溫β -甘露聚糖酶的曲霉屬真菌Aspergillus sp.T16已于2013年4月3號保存于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為:CCTCC N0:M2013122。


圖1為本發(fā)明重組菌株X-33/pGAPZ a -manT16表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測結(jié)果。I泳道為重組菌株X-33/pGAPZa-manT16發(fā)酵液中蛋白；2泳道為重組菌株X-33/pGAPZ a -manT16發(fā)酵液經(jīng)S印hadex G-75凝膠純化所得蛋白；圖2為本發(fā)明表達(dá)的高溫β -甘露聚糖酶的最適pH檢測結(jié)果；圖3為本發(fā)明表達(dá)的高溫β -甘露聚糖酶的pH穩(wěn)定性檢測結(jié)果；圖4為本發(fā)明表達(dá)的 高溫β -甘露聚糖酶的最適溫度檢測結(jié)果；圖5為本發(fā)明表達(dá)的高溫β -甘露聚糖酶的溫度穩(wěn)定性檢測結(jié)果；孵育溫度為75°C ；圖6為本發(fā)明表達(dá)的高溫β -甘露聚糖酶降解甘露聚糖(刺槐豆膠)質(zhì)譜檢測結(jié)果;A為酶解2h檢測結(jié)果，B為酶解64h檢測結(jié)果。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，不會對本發(fā)明形成限制。實驗材料和試劑1、菌株及載體:Aspergillus sp.T16由本發(fā)明人分離獲得，表達(dá)載體pGAPZ a A和pPICZ α Α,畢赤酵母菌株Χ-33和GSl 15購自于Invitrogen公司。2、試劑:限制性內(nèi)切酶、連接酶、Pfu DNA Polymerase、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于Fermentas公司，RNA提取試劑盒購自于Promega公司，刺槐豆角購自于Sigma公司，其它試劑均為國產(chǎn)試劑，可從一般的生化試劑公司購買。3、培養(yǎng)基:(I)野生菌株的篩選培養(yǎng)基為:0.5%魔芋粉溶于基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(NaNO3,0.2% ;K2HPO4,0.1% ；KC1,0.05% ；MgS04.7Η20，0.05% ；FeSO4.7Η20，0.001% ；ρΗ4.5)。Aspergillussp.Τ16 培養(yǎng)基為:魔芋粉，0.5% ;蛋白胨，1% ；NaN03,0.2% ;Κ2ΗΡ04,0.1% ；KC1,0.05% ；MgSO4.7Η20，0.05% ；FeS04.7Η20，0.001% (ρΗ4.5)。(2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨，0.5%酵母粉，l%NaCl，ρΗ7.0)和LLB培養(yǎng)基(1%蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl，pH7.4);在LB或LLB液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉得到相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。(3)酵母菌培養(yǎng)基YPD (2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖)和YPDS (2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖，IM山梨醇)；在YPD或YPDS液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉得到相應(yīng)的
固體培養(yǎng)基。下述實施例中所采用方法如無特殊說明均為常規(guī)的方法；所述引物，序列測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。實施例1、產(chǎn)高溫β -甘露聚糖酶的Aspergillus sp.T16篩選將采 自于湖南省長沙市岳麓山桔園的土樣經(jīng)富集培養(yǎng)(富集培養(yǎng)基:0.5%的魔芋粉溶于基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，調(diào)pH至5.0，30 V，200rpm) 48h。富集培養(yǎng)液稀釋IO4-1O6倍后各
0.2mL涂初篩平板(富集培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉和0.2%剛果紅)，30°C恒溫培養(yǎng)2_3天。初篩平板長出后，待菌落周圍有透明的水解圈出現(xiàn)，挑取接種于含有富集培養(yǎng)基的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，30 0C，200rpm培養(yǎng)48h。取培養(yǎng)液上清稀釋合適的倍數(shù)，以0.5%的刺槐豆膠做底物，在pH5.0和80°C，采用DNS法測量培養(yǎng)液中酶活，選取具有較高酶活的菌株。通過此方法篩選到產(chǎn)高溫β -甘露聚糖酶的Aspergillus sp.T16。該菌株在平板分離培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)2天，菌落直徑在4cm 5cm,質(zhì)地疏松,絲絨狀。菌落顏色初為白色，3天后變?yōu)榈S色，產(chǎn)生孢子之后變?yōu)楹谏?。菌落中央菌絲生長形成突起邊緣不整齊，菌落背面呈淡黃色；孢子頭呈球形至放射狀，直徑約為200 400 μ m ;孢子梗長I 3mm，直徑20 25 μ m,壁光滑，無橫隔，無色；分生孢子呈球形，黑色，直徑5.0 6.0ym,壁粗糙，有刺狀突起；菌絲透明無色，有橫隔，一部分伸入培養(yǎng)基內(nèi)，一部分形成氣生菌絲，菌絲頂端膨大形成分生孢子梗。根據(jù)以上形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特征，初步判定該真菌為曲霉屬真菌。該產(chǎn)高溫β_甘露聚糖酶的真菌Aspergillus sp.T16已于已保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏號為:CCTCC N0:M2013122。實施例2、來自于真菌Aspergillus sp.T16的高溫β -甘露聚糖酶全基因的獲得1、高溫β -甘露聚糖酶N端和C端氨基酸序列測序Aspergillus sp.T16在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.5%魔芋粉和1.0%蛋白胨溶于基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，pH5.0,35°C,200rpm)培養(yǎng)48小時，紗布過濾除去菌絲體，培養(yǎng)液上清經(jīng)透析袋濃縮、透析和S印hadexTM G_75凝膠純化后進(jìn)行N和C端氨基酸測序，其N端序列為SFASTSGLQF，其C端測序結(jié)果為TDHVAAIGSA,兩者與來源于Aspergillus usamii(ADZ99027.1)、Aspergilluskawachii (GAA89125.1)、Aspergillus niger (ACJ06979.1，ADK88903.1，AEY76082.1)和Aspergillus sulphureus (ABC59553.1)具有很高的同源性；根據(jù)編碼上述蛋白相應(yīng)N端和C端氨基酸的基因序列比對，設(shè)計上游簡并引物ManTF-5TCCTTCGCCAGCACCTCSGG3和下游簡并引物 ManTR-5CATGTKGCTGCTATTGGTAGYGCT3。2、編碼高溫β-甘露聚糖酶基因的克隆Aspergillus sp.T16在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.5%魔芋粉和1.0%蛋白胨溶于查氏基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，pH5.0,35°C,200rpm)培養(yǎng)48小時，紗布過濾獲得菌絲體0.lg，置于液氮研缽中充分研磨，之后按照Promega公司產(chǎn)的酵母基因組提取試劑盒和RNA提取試劑盒提取Aspergillus sp.T16的全基因組和總RNA。
以設(shè)計合成的ManTF和ManTR為引物，提取的Aspergillus sp.T16全基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增參數(shù)為:95°C變性5min ;94°C變性lmin，52°C退化lmin，72°C延伸2min30S，30個循環(huán)；72°C充分延伸15min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，純化產(chǎn)物測序結(jié)果如SEQ ID N0.2，其包含兩段內(nèi)含子，其中+611-673bp和+804-865為其內(nèi)含子序列。以提取的Aspergillus sp.T16總RNA為模板,利用Promega的反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到編碼高溫β -甘露聚糖酶的cDNA第一鏈；以第一鏈cDNA為模板，以設(shè)計合成的ManTF和ManTR為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增參數(shù)為:95°C變性5min ;94°C變性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸2min，30個循環(huán)；72°C充分延伸15min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，純化產(chǎn)物測序結(jié)果如SEQ ID N0.3所示。實施例3、重組高溫β -甘露聚糖酶的制備根據(jù)編碼成熟高溫β -甘露聚糖酶的cDNA序列合成引物ManPF-5CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCCTTCGCCAGCACCTCCGG3 (C~TCGAG 為 Xho I 酶切位點)和 ManPR_5GCTCTAGATCAAGCACTACCAATAGCAGCAACATG3 (T'CTAGA 為 Xba I 酶切位點)，以實施例 2 中獲得的編碼成熟高溫β -甘露聚糖酶的cDNA序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增參數(shù)為:95°C變性5min ;94°C變性 lmin，52°C退活 lmin，72°C延伸 2min,30 個循環(huán)；72°C充分延伸 15min。用Xho I和Xba I雙酶切pGAPZ a A和pPICZ a A質(zhì)粒，同時雙酶切上述PCR產(chǎn)物，用Τ4連接酶將雙酶切PCR產(chǎn)物與雙酶切pGAPZ a A和pPICZ a A質(zhì)粒進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物化轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入E.coli DH5ci，挑取陽性克隆子菌落PCR鑒定后測序。提取測序正確的重組質(zhì)?？?4 2 0-11^111'16和pPICZ a -manT16，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33和GSl 15，涂布于含100 μ g/mL的YPDS平板，30°C培養(yǎng)2_3天，長出的重組子即為產(chǎn)高溫β -甘露聚糖酶的畢赤酵母基因工程菌。挑取上述高溫β -甘露聚糖酶重組菌株接種于5mL YPD培養(yǎng)基中，28 °C，250rpm培養(yǎng)24小時，取ImL接種于IOOmL YTO培養(yǎng)基中，28°C，250rpm培養(yǎng)36小時，取上清5000g離心5min，測定上清中甘露聚糖酶酶活并進(jìn)行SDS-PAGE。發(fā)酵液中酶活為210U/mL，SDS-PAGE表明發(fā)酵液主要為高溫甘露聚糖酶(圖1)。實施例4、高溫β -甘露聚糖酶的活性分析采用DNS法對本發(fā)明制備的各β -甘露聚糖酶進(jìn)行活性分析。具體測量方法如下，取500 μ L稀釋合適倍數(shù)的β -甘露聚糖酶溶液加入到500 μ L溶于0.1M磷酸鹽緩沖液的1.0%的刺槐豆角(ρΗ5.0沖，于75°C反應(yīng)IOmin后，加入1000 μ L DNS溶液，沸水煮5min后用冷水冷卻，于540nm測量吸光度。酶活定義:在pH5.0、75°C、lmin催化終濃度為0.5%的刺槐豆角(Sigma G0753)產(chǎn)生I μ mol甘露糖所需要的酶量為一個酶活單位。實施例5、高溫β -甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析1、最適pH與pH穩(wěn)定性分析最適pH值的確定:采用pH2.2-8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋酶液和配制底物，分別于不同PH下按實施例4測定β -甘露聚糖酶的活力。

pH值穩(wěn)定性的確定:純酶樣品置于不同pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸(2.2-8.0)緩沖液中于室溫放置24h后，按實施例4測定殘留的酶活力。
結(jié)果如圖2和3，該酶在pH3.5-5.0具有最高相對酶活，在pH3.0仍具有60%的相對活性；在PH2.2-8.0條件下室溫放置24h仍能殘留75%以上的相對酶活，具有極好的耐酸性，適宜于用于飼料、食品、醫(yī)藥、紡織、造紙和石油開采行業(yè)。2、最適溫度與溫度穩(wěn)定性分析最適溫度的確定:純酶樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，分別在40°C、50°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C和90°C按照實施例4測定β -甘露聚糖酶的活力。溫度穩(wěn)定性的確定:純酶樣品置于75°C下保溫不同時間，按實施例4測定殘留的酶活力。結(jié)果如圖4和5，該酶的最適作用溫度為75°C，在75°C下保溫5min殘留酶活在80%以上，具有較好的熱穩(wěn)定性，可滿足飼料等行業(yè)的高溫工藝要求。實施例6、高溫β -甘露聚糖酶降解甘露聚糖特性分析

取IOU的高溫β -甘露聚糖酶加入甘露聚糖底物溶液中(1%的刺槐豆膠溶于蒸餾水中)，于60°C孵育2h和60h以使底物充分水解。14000g離心lOmin，經(jīng)超濾除去殘留蛋白。酶解產(chǎn)物NH4+離子化、鈉離子化和鉀離子化后進(jìn)行質(zhì)譜MS分析。結(jié)果如圖6，質(zhì)譜分析結(jié)果表明，高溫β -甘露聚糖酶水解刺槐豆膠主要產(chǎn)物為甘露二糖，及相對少量的甘露糖、甘露三糖和甘露四糖，表明該高溫β_甘露聚糖酶可降解甘露聚糖產(chǎn)生低聚合度的甘露寡糖，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、紡織、造紙和石油開采以降解甘露聚糖。
權(quán)利要求
1.一種高溫β-甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.一種高溫β_甘露聚糖酶基因manT16，其特征在于，是滿足下列要求的核苷酸序列之一 1)編碼如SEQID No. I所示氨基酸序列的高溫β -甘露聚糖酶的核苷酸序列； 2)序列表中SEQID No. 2所示的核苷酸序列； 3)序列表中SEQID No. 3所示的核苷酸序列。
3.包含權(quán)利要求2所述高溫β-甘露聚糖酶基因manT16的重組載體pGAPZ a -manT16和 pPICZa -manT16。
4.包含權(quán)利要求3所述高溫β-甘露聚糖酶基因manT16重組載體的高溫β -甘露聚糖酶酵母基因工程菌。
5.構(gòu)建權(quán)利要求4所述高溫β-甘露聚糖酶工程菌的方法，是將權(quán)利要求3所述的重組載體pGAPZ a -manT16和pPICZ a -manT16導(dǎo)入畢赤酵母中獲得；所述高溫β _甘露聚糖酶基因manT16在重組載體pGAPZa-manT16和pPICZa-manT16中位于α分泌引導(dǎo)肽基因序列下游。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述構(gòu)建工程菌的方法，其特征在于，用于構(gòu)建表達(dá)所述高溫β-甘露聚糖酶工程菌的出發(fā)菌株為畢赤酵母Χ-33或GSl 15。
7.—種表達(dá)高溫β_甘露聚糖酶的方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的高溫β -甘露聚糖酶工程菌，組成型或誘導(dǎo)型高溫β -甘露聚糖酶工程菌表達(dá)，提取純化后，得到高溫甘露聚糖酶。
8.權(quán)利要求I所述的高溫甘露聚糖酶在食品、紡織、洗滌、醫(yī)藥、石油開采或動物飼料添加劑中的應(yīng)用。
9.一種曲霉屬真菌 Aspergillus sp. T16，其保藏號為CCTCC N0:M2013122。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β-甘露聚糖酶、編碼基因及其生產(chǎn)菌和應(yīng)用，該高溫β-甘露聚糖酶的真菌Aspergillus sp.T16，保藏號為CCTCC NO:M2013122，從該菌克隆獲得的新型高溫甘露聚糖酶基因manT16，其具有如SEQ ID NO.2或3所示的核苷酸序列，編碼獲得的β-甘露聚糖酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，及包含編碼該甘露聚糖酶基因的重組載體和酵母基因工程菌。本發(fā)明的甘露聚糖酶最適溫度為75℃，最適pH為3.5-5.0，可耐受75℃高溫，在pH2.2-8.0下穩(wěn)定，作為新型高溫酶，具有極大的生產(chǎn)應(yīng)用價值，在飼料、食品、醫(yī)藥、釀酒、能源等行業(yè)中應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N15/81GK103255118SQ20131019014
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月21日
發(fā)明者周洪波, 鄭甲, 王冶 申請人:中南大學(xué)