一種電化學(xué)基因傳感器生物芯片的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用特殊技術(shù)和工藝制備的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，該電化學(xué)基因傳感器生物芯片是采用普通的印刷電路板(PCB)做成，該印刷電路板上有許多金屬電極，前期完成銀膠處理工藝及等離子處理工藝后，在每個(gè)金屬電極表面通過(guò)特制的點(diǎn)樣針以接觸式點(diǎn)樣方式固定上合成的DNA捕獲探針，點(diǎn)制好捕獲探針的芯片通過(guò)清洗及組裝工藝組裝成電化學(xué)基因傳感器生物芯片。該電化學(xué)基因傳感器生物芯片本底低、表面均一、結(jié)合力強(qiáng)、雜交分辨率高、點(diǎn)樣點(diǎn)大小和形狀規(guī)整，可廣泛用于高質(zhì)量的寡核苷酸芯片、cDNA芯片、抗原芯片、抗體芯片的制備，亦可應(yīng)用于系列病臨床原體高通量檢測(cè)和系列個(gè)體化用藥靶標(biāo)的臨床檢測(cè)領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】一種電化學(xué)基因傳感器生物芯片的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)基因傳感器生物芯片，特別涉及到利用二茂鐵衍生物作為電化學(xué)指示劑的方法，通過(guò)特制的點(diǎn)樣針以接觸式點(diǎn)樣方式固定合成的DNA捕獲探針而制備的一種電化學(xué)生物芯片。該電化學(xué)生物芯片表面覆蓋一層金屬金，便于與特殊化學(xué)方法標(biāo)記的的核酸探針和蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原抗體以及其它物質(zhì)的共價(jià)化學(xué)結(jié)合。電化學(xué)基因傳感器生物芯片是用普通的印刷電路板(PCB)按照一定的工藝制備而成，該芯片上有許多金屬電極，每個(gè)金屬電極表面固定有合成的DNA捕獲探針。捕獲探針的序列長(zhǎng)度從20個(gè)堿基到30個(gè)堿基不等。本發(fā)明適合于核酸類、蛋白質(zhì)類和其它種類的探針、模板片段點(diǎn)制微陣列芯片，具有牢固的特異的化學(xué)鍵結(jié)合特點(diǎn)，為生物芯片的制備提供可靠的載體。
【背景技術(shù)】
[0002]1998年底美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)將電化學(xué)基因傳感器技術(shù)列為1998年度自然科學(xué)領(lǐng)域十大進(jìn)展之一，足見(jiàn)其在科學(xué)史上的意義。它以其可同時(shí)、快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)基因組信息的本領(lǐng)而顯示出了巨大的威力。這些應(yīng)用主要包括基因表達(dá)檢測(cè)、突變檢測(cè)、基因組多態(tài)性分析和基因文庫(kù)作圖以及雜交測(cè)序等方面。
[0003]生物芯片以其高通量、多靶位的檢測(cè)模式正在被越來(lái)越多地應(yīng)用于生物科學(xué)領(lǐng)域。以印刷電路板為載體的微陣列芯片，更以其高效、高通量、低價(jià)位等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于基礎(chǔ)研究和臨床篩查、輔助診斷。
[0004]微陣列芯片包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片、抗原芯片、抗體芯片等，電化學(xué)基因傳感器芯片以特殊化學(xué)方法處理后的印刷電路板為載體，將各種探針或靶標(biāo)片段以化學(xué)鍵結(jié)合的方式固定在印刷電路板表面，并利用二茂`鐵衍生物作為電化學(xué)指示劑，形成可用于雜交反應(yīng)或抗原抗體反應(yīng)的微陣列芯片。
[0005]目前國(guó)內(nèi)外基于電化學(xué)傳感器技術(shù)大多數(shù)都不是用二茂鐵作為電化學(xué)指示劑，只有極少數(shù)用二茂鐵衍生物作為電化學(xué)指示劑。本專利的電化學(xué)基因傳感器生物芯片將完全不同于國(guó)外專利的二茂鐵衍生物，完全形成具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核心專利。此外，本專利擬構(gòu)建的新型基因芯片不同于傳統(tǒng)的基因芯片，無(wú)需采用載玻片、尼龍膜、磁珠等為基質(zhì)，而是采用普通的印刷電路板，通過(guò)特制的點(diǎn)樣針以接觸式點(diǎn)樣方式固定合成的DNA捕獲探針，再將印刷電路板表面覆蓋一層膠膜，并組裝上微流樣品管，實(shí)現(xiàn)了密閉微流雜交通道，大大提高了雜交效率和速度，實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)基因芯片上的技術(shù)革新。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種用特殊技術(shù)和工藝制備的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，該電化學(xué)基因傳感器生物芯片是采用普通的印刷電路板(PCB)做成，該印刷電路板(PCB)上有許多金屬電極，前期完成銀膠處理工藝及等離子處理工藝后，在每個(gè)金屬電極表面通過(guò)特制的點(diǎn)樣針以接觸式點(diǎn)樣方式固定上合成的DNA捕獲探針，點(diǎn)制好捕獲探針的芯片通過(guò)清洗及組裝工藝組裝成電化學(xué)基因傳感器生物芯片。該電化學(xué)基因傳感器生物芯片本底低、表面均一、結(jié)合力強(qiáng)、雜交分辨率高、點(diǎn)樣點(diǎn)大小和形狀規(guī)整?？梢詮V泛用于高質(zhì)量的寡核苷酸芯片、cDNA芯片、抗原芯片、抗體芯片的制備，可應(yīng)用于系列病臨床原體高通量檢測(cè)和系列個(gè)體化用藥靶標(biāo)的臨床檢測(cè)領(lǐng)域。
[0007]本發(fā)明提供的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，制備程序如下:
[0008]1、空白電化學(xué)基因傳感器生物芯片處理工藝:在印刷電路板的電極上均勻覆蓋預(yù)混好的銀膠，，點(diǎn)好銀膠的印刷電路板放在恒溫干燥箱中95°C 60分鐘烘干；等離子處理I分鐘。[0009]2、在電極上偶聯(lián)捕獲探針工藝:在等離子處理之后的印刷電路板的金電極表面點(diǎn)上相應(yīng)的捕獲探針，在85%濕度、溫度26.7°C的條件下孵育10~15分鐘。
[0010]3、清洗工藝:使用去離子純化水將印刷電路板表面沒(méi)有結(jié)合的探針溶液沖洗2分鐘，取出置于真空干燥箱中30°C 15分鐘干燥。
[0011]4、成品組裝工藝:將塑料板、密封蓋及大膠膜、小膠膜按孔上相應(yīng)位置組裝好，跟烘干好的印刷電路板對(duì)準(zhǔn)位置在氣液增壓機(jī)上壓制成電化學(xué)基因傳感器生物芯片，并蓋好塑料外殼。
[0012]通過(guò)以上特殊制備工藝，制成本發(fā)明電化學(xué)基因傳感器生物芯片，放置一周后，可以用于系列病臨床原體高通量檢測(cè)和系列個(gè)體化用藥靶標(biāo)的臨床檢測(cè)領(lǐng)域。
[0013]大多數(shù)傳統(tǒng)的芯片需要自動(dòng)化設(shè)備或人工手動(dòng)來(lái)做多級(jí)流體處理過(guò)程。這些自動(dòng)化設(shè)備一般體積龐大，復(fù)雜，昂貴，而且往往限制DNA芯片的高成本科研應(yīng)用，不適合用于體外診斷。人工手動(dòng)則耗費(fèi)人力，容易出錯(cuò)。而我們的電化學(xué)基因傳感器生物芯片完全不需要清洗。檢測(cè)人員只需將PCR產(chǎn)物與信號(hào)探針雜交液混合，然后移入到電化學(xué)基因傳感器生物芯片里，并將芯片插入電化學(xué)基因傳感器生物芯片檢測(cè)系統(tǒng)里，30分鐘之后，便有結(jié)果，中間無(wú)需任何操作。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1印刷電路板芯片的正面
[0015]圖2印刷電路板芯片的反面
[0016]圖3電化學(xué)基因傳感器生物芯片成品
[0017]圖4華法林敏感性基因點(diǎn)樣制備電化學(xué)基因傳感器生物芯片的探針矩陣
[0018]圖5華法林敏感性基因檢測(cè)試劑電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)
【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明用下列實(shí)施例進(jìn)行解釋，目的只是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。
[0020]實(shí)施例1:華法林敏感性基因點(diǎn)樣制備電化學(xué)基因傳感器生物芯片
[0021]取本發(fā)明電化學(xué)基因傳感器生物芯片中所描述的印刷電路板(PCB) —塊，前期完成銀膠處理工藝及等離子處理工藝，配以華法林敏感性基因寡核苷酸探針出條)，以及點(diǎn)樣液成分，通過(guò)點(diǎn)樣儀將探針點(diǎn)制在印刷電路板(PCB)相應(yīng)的電極上。探針矩陣為“S”型，每個(gè)探針重復(fù)2點(diǎn)，中間間隔一個(gè)點(diǎn)，如圖4所示。本發(fā)明電化學(xué)基因傳感器生物芯片點(diǎn)制的探針點(diǎn)大小均勻。[0022]華法林敏感性基因檢測(cè)試劑盒針對(duì)人類基因組DNA中對(duì)華法林藥物代謝敏感的五個(gè)SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物和探針(包括捕獲探針和信號(hào)探針)，其中特異性引物進(jìn)行多重復(fù)合擴(kuò)增獲得五個(gè)SNP位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物；捕獲探針?lè)謩e固定在特制的印刷電路板金電極表面，制備成華法林電化學(xué)傳感器(芯片)，用于捕獲PCR多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物；信號(hào)探針與PCR產(chǎn)物特異結(jié)合。由于信號(hào)探針標(biāo)記有二茂鐵分子，會(huì)通過(guò)夾心雜交產(chǎn)生電流的變化。應(yīng)用電化學(xué)基因傳感器分析系統(tǒng)檢測(cè)出相應(yīng)電流值(信號(hào)值)，并對(duì)各個(gè)SNP位點(diǎn)的堿基型別進(jìn)行判定。
[0023]實(shí)施例2:通過(guò)雜交反應(yīng)檢驗(yàn)電化學(xué)基因傳感器生物芯片的信號(hào)特性
[0024]將上述點(diǎn)制好的芯片通過(guò)清洗及組裝工藝組裝成電化學(xué)基因傳感器生物芯片。取華法林敏感性基因檢測(cè)試劑的其它成分，擴(kuò)增1份己知基因型別的DNA樣本得到雜交模板。取一 0.2ml的離心管，依次加入70 μ I雜交液I，10 μ I雜交液II，20 μ I雜交液III以及25 μ I PCR產(chǎn) 物，充分混勻(注意盡量不要有氣泡)，將混勻的液體移入制備好的電化學(xué)基因傳感器生物芯片的管中，壓緊管蓋。插入與該電化學(xué)基因傳感器生物芯片配套檢測(cè)使用的電化學(xué)基因傳感器檢測(cè)系統(tǒng)(DA9000)中，選擇設(shè)定好的雜交程序，雜交時(shí)間30分鐘。雜交結(jié)束后該儀器給出該樣本的檢測(cè)結(jié)果和報(bào)告。同時(shí)可以將該次上機(jī)檢測(cè)的結(jié)果導(dǎo)入相應(yīng)的服務(wù)器中，采用相應(yīng)的軟件查看相應(yīng)的電化學(xué)信號(hào)(如圖5所示)，野生型樣本在相應(yīng)的電勢(shì)位置上出現(xiàn)野生型信號(hào)，突變型樣本在相應(yīng)的電勢(shì)位置上出現(xiàn)突變型信號(hào)，并將圖像轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，采用分析軟件，將以上數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成基因型別。結(jié)果分析得到的陽(yáng)性雜交點(diǎn)和陰性雜交點(diǎn)與樣本基因序列和基因型別符合，從圖中可見(jiàn)，陽(yáng)性探針點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)，陰性點(diǎn)本底低，結(jié)合力和分辨力都很好，能夠滿足電化學(xué)基因傳感器生物芯片的制備和雜交反應(yīng)要求。
【權(quán)利要求】
1.一種電化學(xué)基因傳感器生物芯片的制備方法，其特征在于電化學(xué)基因傳感器生物芯片是采用普通的印刷電路板(PCB)做成，該印刷電路板(PCB)上有許多金屬電極，每個(gè)金屬電極表面通過(guò)特制的點(diǎn)樣針以接觸式點(diǎn)樣方式固定上合成的DNA捕獲探針，捕獲探針的序列長(zhǎng)度從20個(gè)堿基到30個(gè)堿基不等，點(diǎn)制好捕獲探針的芯片通過(guò)清洗及組裝工藝組裝成電化學(xué)基因傳感器生物芯片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該印刷電路板(PCB)表面覆蓋一層金屬金，便于與特殊化學(xué)方法標(biāo)記的的DNA捕獲探針、蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原抗體以及其它物質(zhì)的共價(jià)化學(xué)結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該生物芯片的印刷電路板(PCB)上金屬電極微陣列可以有不同的排列組合方式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微陣列排列組合，其特征還在于該生物芯片的印刷電路板(PCB)上金屬電極微陣列的排列組合采用“S”型的微陣列方式，每條捕獲探針2個(gè)重復(fù)點(diǎn)，中間間隔一個(gè)點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該生物芯片的銀膠處理工藝為:在印刷電路板的右上方輔助電極上均勻覆蓋預(yù)混好的銀膠，點(diǎn)好銀膠的印刷電路板放在恒溫干燥箱中95°C 60分鐘烘干。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該生物芯片的等離子處理工藝為:取處理好銀膠的印刷電路板放置于全自動(dòng)的等離子處理儀器中，設(shè)置好程序，在等離子處理儀上處理I分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該生物芯片的偶聯(lián)捕獲探針工藝為:在等離子處理之后的印刷電路板的金電極表面通過(guò)特制的點(diǎn)樣針接觸式點(diǎn)樣方式固定合成的DNA捕獲探針，在85%濕度、溫度26.7°C的條件下孵育10~15分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該生物芯片的清洗工藝為:使用去離子純化水將印刷電路板表面沒(méi)有結(jié)合的探針溶液沖洗2分鐘，取出置于真空干燥箱中30°C 15分鐘干燥。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)基因傳感器生物芯片，其特征還在于該生物芯片的成品組裝工藝為:將塑料板、密封蓋及大膠膜、小膠膜按孔上相應(yīng)位置組裝好，跟烘干好的印刷電路板對(duì)準(zhǔn)位置在氣液增壓機(jī)上壓制成電化學(xué)基因傳感器生物芯片，并蓋好塑料外殼。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103627788SQ201310366816
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月21日
【發(fā)明者】陳華云, 李明, 肖湘文, 趙麗, 黃桃生 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司