一種電化學(xué)基因傳感器法檢測(cè)人乳頭瘤病毒20種分型的試劑盒的制作方法
【專利摘要】人乳頭瘤病毒(HPV)是一種誘發(fā)外生殖器良性病變和女性子宮頸癌的主要病原體。HPV分為低危型和中高危型HPV。低危型HPV常引起外生殖器尖銳濕疣等良性病變；而中高危型HPV與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)病變的發(fā)生密切相關(guān)。因此，有針對(duì)性地進(jìn)行HPV的分型檢測(cè)，對(duì)于宮頸癌的早期診斷和治療具有一定的臨床意義。本發(fā)明針對(duì)HPV基因組晚期區(qū)L1區(qū)設(shè)計(jì)特異引物和20型信號(hào)探針，將信號(hào)探針?lè)謩e固定在印刷電路板金電極表面，制備成電化學(xué)傳感器，用于捕獲PCR多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物。由于信號(hào)探針標(biāo)記有二茂鐵分子，通過(guò)夾心雜交產(chǎn)生電流的變化，應(yīng)用電化學(xué)基因傳感器分析系統(tǒng)檢測(cè)出電流值，最后進(jìn)行人乳頭瘤病毒基因型別判定。
【專利說(shuō)明】—種電化學(xué)基因傳感器法檢測(cè)人乳頭瘤病毒20種分型的試劑盒【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)基因傳感器法檢測(cè)人乳頭瘤病毒20個(gè)基因分型的試劑盒，特別是涉及以一種電化學(xué)基因傳感器技術(shù)快速分型檢測(cè)20個(gè)人乳頭瘤病毒型別的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒，實(shí)現(xiàn)對(duì)宮頸脫落細(xì)胞樣本或生殖泌尿道分泌物樣本中的20個(gè)人乳頭瘤病毒型別進(jìn)行快速檢測(cè)和分析。
【背景技術(shù)】
[0002]1998年底美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)將電化學(xué)基因傳感器技術(shù)列為1998年度自然科學(xué)領(lǐng)域十大進(jìn)展之一，足見(jiàn)其在科學(xué)史上的意義。它以其可同時(shí)、快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)基因組信息的本領(lǐng)而顯示出了巨大的威力。這些應(yīng)用主要包括基因表達(dá)檢測(cè)、突變檢測(cè)、基因組多態(tài)性分析和基因文庫(kù)作圖以及雜交測(cè)序等方面。
[0003]生物芯片以其高通量、多靶位的檢測(cè)模式正在被越來(lái)越多地應(yīng)用于生物科學(xué)領(lǐng)域。以印刷電路板為載體的微陣列芯片，更以其高效、高通量、低價(jià)位等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于基礎(chǔ)研究和臨床篩查、輔助診斷。
[0004]微陣列芯片包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片、抗原芯片、抗體芯片等，電化學(xué)基因傳感器芯片以特殊化學(xué)方法處理后的印刷電路板為載體，將各種探針或靶標(biāo)片段以化學(xué)鍵結(jié)合的方式固定在印刷電路板表面，并利用二茂鐵衍生物作為電化學(xué)指示劑，形成可用于雜交反應(yīng)或抗原抗體反應(yīng)的微陣列芯片。
[0005]宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)每年宮頸癌新發(fā)病例約13萬(wàn)，是僅次于乳腺癌而引起婦女癌癥相關(guān)死亡的重要原因。近幾年來(lái)，隨著生活方式的改變，宮頸癌患者的發(fā)病年齡更趨年輕化，并且病例數(shù)有不斷上升的趨勢(shì)。宮頸癌也是目前唯一一種發(fā)病原因比較清楚的癌癥，主要病因是由高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的持續(xù)感染或反復(fù)感染所致，同一型別的高危HPV病毒持續(xù)感染導(dǎo)致發(fā)生宮頸癌或者宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)更高，而不同型別的HPV與宮頸癌的相關(guān)性也不一樣，例如HPV16，18型感染與宮頸癌高度相關(guān)，60%以上的宮頸癌的發(fā)生是由HPV16，18型的持續(xù)感染所致；低危型如6，11等的持續(xù)感染則幾乎不導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。
[0006]HPV主要通過(guò)性行為傳播，也可通過(guò)接觸污染物品傳播。研究表明，幾乎所有(99.7% )的宮頸癌患者中都有HPV的感染；有過(guò)性行為的女性，一生中至少感染過(guò)一種HPV的機(jī)率高達(dá)40%左右。只有高危型HPV的持續(xù)或反復(fù)感染才有致癌的可能，從HPV感染至宮頸癌發(fā)生需經(jīng)歷多年的時(shí)間，通過(guò)積極處理HPV感染及癌前病變，可以有效阻斷病情發(fā)展，預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。因此檢測(cè)HPV基因型有助于判斷病情的進(jìn)展、制定個(gè)體化檢查和治療方案。
[0007]目前確定的HPV型別約有100多種，依其感染的上皮所在部位分為皮膚型HPV和生殖道上皮HPV，大約35種型別涉及生殖道感染，約20種與腫瘤相關(guān)。依據(jù)不同型HPV與癌發(fā)生的危險(xiǎn)性高低分為低危險(xiǎn)型HPV如HPV6，11，42，43，44等，常引起外生殖器濕疣等良性病變包括宮頸上皮內(nèi)低度病變；高危型HPV如16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59，68，73，82等15個(gè)型別與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變(CIN2 / 3)的發(fā)生相關(guān)，尤其是HPV16和18型；而26，53，66等疑似高危型別則可能會(huì)引起癌前病變，甚至宮頸癌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)基因傳感器法分型檢測(cè)20個(gè)人乳頭瘤病毒型別基因的試劑盒，特別是涉及以一種電化學(xué)基因傳感器技術(shù)快速分型檢測(cè)20個(gè)人乳頭瘤病毒型別基因的試劑盒。本試劑盒可以檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞樣本或生殖泌尿道分泌物樣品中人乳頭瘤病
毒基因。 [0009]本發(fā)明適用于定性并分型檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞樣本或生殖泌尿道分泌物等臨床樣品中的 HPV16,18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，6，11 等 20 個(gè)人
乳頭瘤病毒型別。
[0010]本發(fā)明的目的是提供一種使用電化學(xué)基因傳感器技術(shù)來(lái)定性分型檢測(cè)樣品中20個(gè)人乳頭瘤病毒型別基因的試劑盒。其基本原理是利用四對(duì)寡核苷酸的特異性引物在UNG酶、耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、高質(zhì)量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、Mg2+和PCR反應(yīng)緩沖液中，通過(guò)ABI2700、ABI9700等市售的定性PCR擴(kuò)增儀實(shí)現(xiàn)靶多核苷酸的循環(huán)擴(kuò)增，獲得多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物；設(shè)計(jì)的特異性捕獲探針?lè)謩e固定在特制的印刷電路板金電極表面，制備成電化學(xué)傳感器(芯片)，用于捕獲PCR多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物；特異性信號(hào)探針與已捕獲的PCR產(chǎn)物特異結(jié)合。由于信號(hào)探針標(biāo)記有二茂鐵分子，通過(guò)夾心雜交產(chǎn)生電流的變化，應(yīng)用電化學(xué)基因傳感器分析系統(tǒng)檢測(cè)出電流值(信號(hào)值)，并對(duì)20個(gè)不同人乳頭瘤病毒型別的堿基進(jìn)行判定，從而達(dá)到快速檢測(cè)靶多核苷酸的目的，用以指導(dǎo)臨床治療。
[0011]本發(fā)明所提供的檢測(cè)樣品中人乳頭瘤病毒型別基因的試劑盒包括:(I)分別裝有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)酶系、電化學(xué)雜交液、空白對(duì)照、人乳頭瘤病毒陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其特征在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的37條引物包括:
[0012]正向引物MYl 1-A:5’ -GCACAGGGACATAACAATGG-3’ (SEQ ID NO:1)，
[0013]正向引物MYll-B:5，-GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’ (SEQ ID NO:2),
[0014]正向引物MYll-C:5’-GCACAGGGACATAATAATGG-3’ (SEQ ID NO:3),
[0015]正向引物MYll-D:5’ -GCCCAGGGCCACAACAATGG-3’ (SEQ ID NO:4),
[0016]正向引物MYll-E:5’-GCTCAGGGTTTAAACAATGG-3，(SEQ ID NO:5),
[0017]正向引物MYll-F:5’ -GCACAAGGCCATAATAATGG(SEQ ID NO:6)，
[0018]正向引物MYll-G:5’-GCCCAGGGTCATAACAATGG-3’ (SEQ ID NO:7),
[0019]正向引物MYll-H:5’-GCACAAGGTCATAATAATGG-3’ (SEQ ID NO:8),
[0020]正向引物MYll-1:5’ -GCICAGGGICATAAIAATGG-3’ (SEQ ID NO:9),
[0021 ]正向引物 MYl 1-J:5’ -GCACAGGGACACAATAATGG-3’ (SEQ ID NO: 10)，
[0022]反向引物MY09-1:5’ -AGGTAGATGAGGTGGTGGGT-3’ (SEQ ID NO:11),
[0023]反向引物MY09-2:5’-ACGCAATCCAGCCTGAACCA-3’ (SEQ ID NO:12),
[0024]反向引物MY09-3:5’-TGCCTAACTGAAATATAAATTGTAA-3’ (SEQ IDNO:13),
[0025]反向引物MY09_4:5’-GACGATGTGCGGGTGGATGT-3’ (SEQ ID NO:14)，[0026]反向引物MY09-5:5’-GCATAGATGAAAAACAAACTGTA-3’ (SEQ ID NO:15)，
【權(quán)利要求】
1.一種電化學(xué)基因傳感器法檢測(cè)人乳頭瘤病毒20種分型的試劑盒，該試劑盒包括:PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)酶系、電化學(xué)雜交液、人乳頭瘤病毒陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)液由PCR反應(yīng)緩沖液、鎂離子溶液、能夠分別與20個(gè)不同型別的雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的10條正向引物、能夠分別與20個(gè)不同型別的雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的27條反向引物組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)酶系由Taq酶、UNG酶和dNTPs組成；電化學(xué)雜交液由雜交液1、雜交液I1、雜交液III組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的10條正向引物和27條反向引物的序列包括:
正向引物 MYl 1-A: GCACAGGGACATAACAATGG
正向引物 MYl 1-B: GCGCAGGGCCACAATAATGG
正向引物 MYl 1-C: GCACAGGGACATAATAATGG
正向引物 MYl 1-D: GCCCAGGGCCACAACAATGG
正向引物 MYl 1-E: GCTCAGGGTTTAAACAATGG
正向引物 MYl 1-F: GCACAAGGCCATAATAATGG
正向引物 MYl 1-G: GCCCAGGGTCATAACAATGG
正向引物 MYl 1-H: GCACAAGGTCATAATAATGG
正向引物 MYll-1:GCICAGGGICATAAIAATGG
正向引物 MYl 1-J:GCACAGGGACACAATAATGG
反向引物 MY09-1:AGGTAGATGAGGTGGTGGGT
反向引物 MY09-2:ACGCAATCCAGCCTGAACCA
反向引物 MY09-3:TGCCTAACTGAAATATAAATTGTAA
反向引物 MY09-4:GACGATGTGCGGGTGGATGT
反向引物 MY09-5:GCATAGATGAAAAACAAACTGTA
反向引物 MY09-6:GCACACTTGAAAAATAAACTGTAA
反向引物 MY09-7:TGGAAAATAAACTGCAAATCA
反向引物 MY09-8:AGGTGGAAGCAGCAGGACGC
反向引物 MY09-9:CCTATTCTTCACCATGCCTTA
反向引物 MY09-10:CGATGATGCGGGGCGTTTTA
反向引物 MY09-11:AGAGGATACAGGCGGTTTAG
反向引物 MY09-12:AACACAAATTGTAATTCATATTCC
反向引物 MY09-13:TTTGCGTTTGGTGGATGGTG
反向引物 MY09-14:GGGTAGAGGTAGGGGCAGGC
反向引物 MY09-15:TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC
反向引物 MY09-16:GCAGTAGTTGCTGTGGCGGG
反向引物 MY09-17:GGTAGCATCCATTGTGTGTAAA
反向引物 MY09-18:CGAGGAAGCGGAAGAGGATG
反向引物 MY09-19:TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
反向引物 MY09-20:GGGCTGTAGAGGGCTTAGAC
反向引物 MY09-21:TGCGTCCCAAAGGAAACTGATC反向引物 MY09-22:CTACCTAAAGGAAACTGATC 反向引物 MY09-23:AACTTGCGACCCAATGCAAACTG 反向引物 MY09-24:CGTCCTAAAGGAAACTGGTC 反向引物 MY09-25:CGACCCAATGGAAACTGATC 反向引物 MY09-26:TTTACGGCCCAACGGAAACTGATC 反向引物 MY09-27:TGCGCCCTAAGGGAAACTGGGT。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物序列，其特征還在于正向引物工作濃度均為0.5i!mOl/L，反向引物的工作濃度均為0.03iimol / L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)酶系中Taq酶的濃度為7U /反應(yīng)，UNG酶的濃度為0.1U /反應(yīng)，dNTPs的濃度為0.6mmol / L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件為:500C 3 分鐘；95°C 15 分鐘；94°C 30 秒，45°C 30 秒，72°C 30 秒，50 個(gè)循環(huán)；72°C 7 分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于電化學(xué)雜交液中雜交液I的主要成分為28種信號(hào)探針，且濃度均為0.175pmol / u L ;雜交液II的主要成分為蛋白質(zhì)；雜交液III的主要成分為高氯酸鈉，且濃度為0.8mol / L0
7.根據(jù)權(quán)利要 求6所述的電化學(xué)雜交液，其特征還在于電化學(xué)雜交液I中用于特異性結(jié)合PCR產(chǎn)物并指示各個(gè)人乳頭瘤病毒型別的寡核苷酸信號(hào)探針有28條，包括:
HPV (20 型)? SP-Ol: CACATAATGTCATATTTGTACTGCGT
HPV (20 型)? SP-02:TGCATAAAGTCATATTAGTGCTACGA
HPV (20 型)? SP-03:TAGATAATGTAAAGTTGGTACTGCGAG
HPV (20 型)? SP-04: TAGTAATAGTCATGTTAGTACTGCGGG
HPV (20 型)? SP-05:CACACACAGAAAGATTAGTGCTTCTAG
HPV (20 型)? SP-06: TGCATAATGTCATATTAGTGCTACAAG
HPV (20 型)? SP-07:GGACAATGTAAAATTAGTACTGCGCG
HPV (20 型)? SP-08: CACATATTGTTAAATAGTACTGCGG
HPV (20 型)? SP-09:AACACACAGACATATTGGTACTGCGT
HPV (20 型)? SP-10: TGCTAATGGTTAAATTTGTACTTCTGG
HPV (20 型)? SP-1l:CGTTAATAGTCATGTTTGTATTCCTG
HPV (20 型)? SP-12: CAACAGTAACAAATAGTTGGTTACC
HPV (20 型)? SP-13:AACTGTGACAAACAACTGATTGCCC
HPV (20 型)? SP-14: TGTATCAACTACAGTAACAAACAATT
HPV (20 型)? SP-15: TATCAACACAGGTAATAAAAAGCTGAT
HPV (20 型)? SP-16:AGTATCCACAACAGTAACAAATACCTGA
HPV (20 型)? SP-17:GGTATCTACCACAGTAACAAATAATTG
HPV (20 型)? SP-18:AGTGGTATCCACAACTGTGACAAACAA
HPV (20 型)? SP-19:ATTAGTGCTTCTAGTAGTATCTACAACAGT
HPV (20 型)? SP-20:TTGGTACTTTTAGTAGTGTCAACACAAGTIA
HPV (20 型)? SP-21:GGCATACGTTGTAGTAGAGCTACTAGCCTGTG
HPV (20 型)? SP-22:GGCATACGTTGTAGTAGAGCTACTAGCCTGHPV (20 型)? SP-23:TCATTTTTATATGTACCTTCCTTAGTTACT
HPV (20 型)? SP-24:TCACTAGAAGACACAGCAGAACACACAGACAT
HPV (20 型)? SP-25:GAAGACTCTATAGAGGTAGATAATGTAA
HPV (20 型)? SP-26:CGCAGCAGTGGCAGTGCTAATAGTTAAATTTGTA
HPV (20 型)? SP-27:TCACTAGTTACTTGTGTGCATAAAGTCATATTAG
HPV(20 型)? SP-28:ATGGTAAGGTTAGTACTGCGGGTGGTATCAAC。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于人乳頭瘤病毒陰性質(zhì)控品為滅菌純化水；陽(yáng)性質(zhì)控品為傳代培養(yǎng)的宮頸癌Hela細(xì)胞，且DNA濃度為IO4拷貝/ mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于所檢測(cè)的樣品可選自但不局限于宮頸脫落細(xì)胞樣本或生殖泌 尿道分泌物。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103602755SQ201310366831
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月21日
【發(fā)明者】陳華云, 李明, 肖湘文, 黃桃生, 趙麗 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司