去氧孕烯中間體納米脂質(zhì)體生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及納米脂質(zhì)體生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化方法，具體涉及納米脂質(zhì)體在微生物轉(zhuǎn)化中應(yīng)用的優(yōu)化方法，特別是公開了采用納米脂質(zhì)體投料方式進行左旋乙基甾烯二酮的11α羥化制備去氧孕烯關(guān)鍵中間體的優(yōu)化參數(shù)。采用本發(fā)明方法底物投料濃度為2g/L-7g/L時，可使左旋乙基甾烯二酮的11α羥化轉(zhuǎn)化率高達60%-80%，顯著高于游離底物投料方式下的投料濃度和轉(zhuǎn)化率。
【專利說明】去氧孕烯中間體納米脂質(zhì)體生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及納米脂質(zhì)體生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化方法，具體涉及一種基于去氧孕烯中間體納米脂質(zhì)體的生物轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開了微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)通常在常溫常壓下進行，相比于化學(xué)反應(yīng)具有專一性強、污染少和產(chǎn)率高的優(yōu)點，因此制藥工業(yè)通常利用兩者的優(yōu)勢配合使用，微生物轉(zhuǎn)化可以為藥物的化學(xué)合成提供關(guān)鍵中間體。盡管微生物轉(zhuǎn)化具有獨特的優(yōu)勢，但工業(yè)應(yīng)用中常受到實際困難的制約，其中，底物對菌體的毒性和對反應(yīng)的抑制作用是困擾疏水性化合物微生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵問題。實踐顯示，由于疏水性底物在水中溶解度極低，因此增加培養(yǎng)基中底物量并不能夠提高轉(zhuǎn)化率，隨投料濃度的提高，轉(zhuǎn)化率顯下降趨勢，這可能是過多的底物沉積于細胞表面而限制了反應(yīng)物和產(chǎn)物的擴散，因此提高轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵在于提高留體底物的有效反應(yīng)濃度，可 以從提高底物溶解度和改善細胞通透性兩個方面解決這一問題。
[0003]本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)進行研究關(guān)于將納米脂質(zhì)體應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化的技術(shù)，即采用卵磷脂為載體將疏水性底物制備成底物納米脂質(zhì)體，再進行微生物轉(zhuǎn)化。這樣既能夠利用卵磷脂增加細胞膜通透性的特性，又能發(fā)揮納米脂質(zhì)體生物相容性好、提高水溶性及巨大比表面積的優(yōu)勢，促進底物向細胞內(nèi)運輸，提高生物利用度，使其進入微生物細胞內(nèi)的量增加，從而提高轉(zhuǎn)化體系底物投料濃度和轉(zhuǎn)化率。
[0004]左旋乙基留烯二酮的Ila羥基衍生物是制備強效孕激素去氧孕烯的關(guān)鍵中間體。去氧孕烯是口服避孕藥媽富隆的主要成分，由于媽富隆的副作用小，效果可靠，應(yīng)用已越來越廣泛，市場需求量也隨之增加。美國專利(US2005/0234251A1)公開的去氧孕烯合成工藝采用左旋乙基甾烯二酮為起始原料，首先利用AspergiIIus ochraceous經(jīng)生物轉(zhuǎn)化引Alla羥基再進行一系列化學(xué)反應(yīng)合成去氧孕烯。該專利以有機溶劑DMF溶解底物左旋乙基留烯二酮投料，投料濃度2g/L-6g/L時，羥化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為35%-60%。
[0005]本發(fā)明擬提供一種納米脂質(zhì)體應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化中提高生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的優(yōu)化方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于設(shè)計將納米脂質(zhì)體應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化中提高生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的優(yōu)化方法，特別是提供去氧孕烯關(guān)鍵中間體11 a羥化的納米脂質(zhì)體生物轉(zhuǎn)化優(yōu)化生產(chǎn)方法。
[0007]本發(fā)明經(jīng)過大量實驗證明，納米脂質(zhì)體應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化中納米脂質(zhì)體制備方法和儲存方式、培養(yǎng)條件、投料濃度對轉(zhuǎn)化產(chǎn)率具有較大的影響。本發(fā)明通過優(yōu)化納米脂質(zhì)體制備方法和儲存方式、培養(yǎng)基pH、底物投料濃度、轉(zhuǎn)化時間和菌齡，建立了左旋乙基留烯二酮
11a羥化的納米脂質(zhì)體生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化條件，底物投料濃度和轉(zhuǎn)化效率與游離底物投料方式相比都有明顯提高。
[0008]本發(fā)明公開的優(yōu)化生產(chǎn)左旋乙基留烯二酮Ila羥化衍生物的納米脂質(zhì)體生物轉(zhuǎn)化參數(shù)為:采用薄膜分散法結(jié)合高壓均質(zhì)機制備底物納米脂質(zhì)體并制成凍干粉儲存、培養(yǎng)基pH為6.5，轉(zhuǎn)化時間60-70h，菌齡24h，投料濃度2g/L_7g/L，微生物菌種采用金龜子綠僵菌突變株(Metarhizium anisopliae) 11490 (CCTCC M2011240)。在此優(yōu)化條件下，左旋乙基甾烯二酮11 α羥化衍生物轉(zhuǎn)化率高達60%_80%。
[0009]更具體的，本發(fā)明的去氧孕烯中間體納米脂質(zhì)體生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化方法，其特征在于，其包括步驟:
[0010]1、底物納米脂質(zhì)體的制備及保存
[0011]采用薄膜分散法將左旋乙基留烯二酮以卵磷脂為載體經(jīng)高壓均質(zhì)機制成納米脂質(zhì)體；添加保護劑后真空冷凍干燥、-20°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0012]2、微生物與培養(yǎng)
[0013]微生物菌種:Metarhiziumanisopliaell490,菌種保藏號 CCTCC M2011240。該菌種能在左旋乙基留烯二酮上引入Ila羥基；[0014]斜面培養(yǎng):將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，其中添加質(zhì)量百分比為0.25%的蠶蛹粉，26~30°C培養(yǎng)5~10天；
[0015]發(fā)酵培養(yǎng):將上述斜面菌種在無菌條件下用接種環(huán)接I環(huán)于裝有40mL液體培養(yǎng)基(10g/L葡萄糖、10g/L黃豆粉、5g/L蠶蛹粉，pH6.5)的250mL搖瓶中，28 °C條件下，旋轉(zhuǎn)式搖床220r/min培養(yǎng)24小時，得種子液；
[0016]3、生物轉(zhuǎn)化
[0017]將制得的底物納米脂質(zhì)體凍干粉投入上述制備好的種子液中，相同條件下轉(zhuǎn)化48-60h，取轉(zhuǎn)化液分析；
[0018]4、分析方法
[0019]HPLC
[0020]流動相:A水，B乙腈
[0021]波長:215nm/254nm
[0022]流速:1.2mL/min
[0023]梯度洗脫:
[0024]0-5min A:B=70:30 保持 5min
[0025]5_15min 梯度 A:B=70:30 — A:B=40:60 保持 IOmin
[0026]15-25min A:B=40:60 保持 IOmin
[0027]樣品用甲醇溶解；
[0028]TLC 及 TLC Scanner
[0029]取發(fā)酵液2mL加入2mL乙酸乙酯浸泡過夜,取5uL點樣于GF254硅膠板，同時取底物和產(chǎn)物標準品(lmg/mL)luL點樣對照，展開劑CH2Cl2 = CH3OH (20:1),CAMAG Scanner-3掃描分析。
[0030]本發(fā)明中，通過下述方法制備底物納米脂質(zhì)體及進行儲存，本發(fā)明的實施例中采用薄膜分散法結(jié)合高壓均質(zhì)機制備左旋乙基留烯二酮納米脂質(zhì)體，比較了兩種卵磷脂——蛋黃卵磷脂和大豆卵磷脂制備的脂質(zhì)體，平均粒徑相似，分別為131.6nm和148.3nm(如圖1所示)，透射電鏡觀察形態(tài)相同，向上述制得的脂質(zhì)體中加入5%蔗糖作保護液，經(jīng)過真空冷凍干燥即得左旋乙基留烯二酮納米脂質(zhì)體凍干粉末，放入_20°C冰箱保存。脂質(zhì)體制成凍干粉末后便于后續(xù)的投料處理，脂質(zhì)體粒徑大小也相對穩(wěn)定。凍干粉末與普通冷凍脂質(zhì)體(未凍干)復(fù)溶后的粒徑分布結(jié)果如圖2所示，凍干保護劑的加入能降低凍結(jié)過程中脂質(zhì)體囊泡的脫水速度和皺縮程度，并防止冰晶對囊泡的機械損傷，直接冷凍儲存脂質(zhì)體，復(fù)溶后，粒徑顯著增大，有沉降現(xiàn)象；將兩種卵磷脂制備的底物納米脂質(zhì)體凍干粉進行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率一致，因此制備脂質(zhì)體時優(yōu)先選用價格較低的大豆卵磷脂。
[0031]本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化時間66h達到最大轉(zhuǎn)化率，本發(fā)明的實施例中，投料濃度2g/L，分別在轉(zhuǎn)化24h、36h、48h、54h、60h和66h取樣分析不同轉(zhuǎn)化時間轉(zhuǎn)化率的變化。比較兩種投料方式——納米脂質(zhì)體投料與游離底物投料(DMF溶解)的轉(zhuǎn)化-時間曲線表明，納米脂質(zhì)體投料方式下(圖3)，轉(zhuǎn)化24h即有約1/3的底物被轉(zhuǎn)化，36h后底物被迅速轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，66h后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率達到87.2%，底物幾乎完全被轉(zhuǎn)化；而01^投料方式下，底物轉(zhuǎn)化始終比較緩慢，轉(zhuǎn)化66h后產(chǎn)物DES2轉(zhuǎn)化率僅為31.1%，進一步延長轉(zhuǎn)化時間底物仍然不能被完全轉(zhuǎn)化。證明將底物制成納米脂質(zhì)體后，促進底物迅速向胞內(nèi)運輸，在短時間內(nèi)即被完全轉(zhuǎn)化。
[0032]本發(fā)明中培養(yǎng)基pH控制在6.5明顯有利于轉(zhuǎn)化，本發(fā)明的實施例中，將培養(yǎng)基pH調(diào)至5.0、6.0、6.5、7.0及8.0，投料濃度3g/L，轉(zhuǎn)化66h后，TLC掃描分析。結(jié)果表明培養(yǎng)基pH控制在6.5有利于轉(zhuǎn)化(如圖4所示);與現(xiàn)有技術(shù)報道的微生物羥化酶最適pH為6.5左右比較，本發(fā)明實驗表明底物制成納米脂質(zhì)體后對轉(zhuǎn)化體系PH影響不明顯，生物相容性很好。
[0033]本發(fā)明中，進行了投料濃度對轉(zhuǎn)化的影響試驗，底物投料濃度是影響微生物轉(zhuǎn)化經(jīng)濟性的一個重要因素，投料濃度提高意味著轉(zhuǎn)化效率提高、生產(chǎn)成本下降；本發(fā)明的實施例中，在不同的投料濃度下(2-10g/L)，比較了納米脂質(zhì)體投料與游離底物投料(DMF溶解)的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果表明(如圖5所示)，投料濃度在2g/L時，納米脂質(zhì)體投料方式下轉(zhuǎn)化率高達80%以上，而游離底物投料方式下為40%左右；投料濃度提高到2g/L以上后，采用游離底物投料轉(zhuǎn)化率會明顯下降，主要是過多的不溶性底物對菌體生長和轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了毒性及抑制作用；而在納米脂質(zhì)體投料方式下，投料濃度提高到7g/L，轉(zhuǎn)化率仍然可以維持在60%以上，說明將不溶性留體底物制備成納米脂質(zhì)體后，溶解性及生物相容性提高，另外粒徑小造成比表面積大，多種因素促進底物向細胞內(nèi)運輸，提高生物利用度，使其進入微生物細胞內(nèi)的量增加，從而提高轉(zhuǎn)化體系底物投料濃度和轉(zhuǎn)化率；
[0034]本發(fā)明中，進行了菌齡對轉(zhuǎn)化的影響試驗，微生物轉(zhuǎn)化是先進行菌體的生長，而后投入留體底物進行轉(zhuǎn)化，前期的生長時間決定了菌體產(chǎn)生的酶量和最佳酶活；本發(fā)明的實施例中，考查菌種生長時間(菌齡)對轉(zhuǎn)化的影響:按菌齡24h、36h和48h投料，分析不同菌齡對轉(zhuǎn)化率的影響(投料濃度3g/L)，轉(zhuǎn)化66h后取樣分析，結(jié)果表明菌齡對轉(zhuǎn)化影響較大，24h菌齡最有利于轉(zhuǎn)化，菌體生長過老過稠不利于轉(zhuǎn)化(如圖6所示)，可能由于過度衰老的菌絲不容易吸收底物及菌體內(nèi)羥化酶活性下降。
[0035]本發(fā)明采用納米脂質(zhì)體技術(shù)促進去氧孕烯中間體微生物轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明通過優(yōu)化底物納米脂質(zhì)體制備和儲存方法、培養(yǎng)基pH、轉(zhuǎn)化時間、投料濃度和菌齡，建立了去氧孕烯中間體納米脂質(zhì)體生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化條件。投料濃度和轉(zhuǎn)化率與游離底物投料方式相比都有明顯提高，表明納米脂質(zhì)體技術(shù)能很好的促進疏水性化合物微生物轉(zhuǎn)化效率。
[0036]以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明的左旋乙基留烯二酮Ilci羥化，優(yōu)化納米脂質(zhì)體投料方式下的系統(tǒng)參數(shù)進行詳細地描述。【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1蛋黃卵磷脂與大豆卵磷脂制備的底物納米脂質(zhì)體粒徑比較。A，蛋黃卵磷脂制備的底物納米脂質(zhì)體粒徑；B，大豆卵磷脂制備的底物納米脂質(zhì)體粒徑。
[0038]圖2底物納米脂質(zhì)體凍干粉與直接冷凍保藏脂質(zhì)體復(fù)溶后粒徑比較。A,底物納米脂質(zhì)體凍干粉復(fù)溶后粒徑分布；B，直接冷凍保藏的底物納米脂質(zhì)體復(fù)溶后粒徑分布。
[0039]圖3納米脂質(zhì)體投料與游離底物投料(DMF溶解)的轉(zhuǎn)化-時間曲線。
[0040]圖4培養(yǎng)基pH對轉(zhuǎn)化的影響。
[0041]圖5轉(zhuǎn)化率隨投料濃度的變化。
[0042]圖6菌齡對轉(zhuǎn)化率的影響?！揪唧w實施方式】
[0043]實施例1:底物納米脂質(zhì)體的制備及儲存優(yōu)化
[0044]將卵磷脂與左旋乙基留烯二酮，按照5:1 (質(zhì)量比)的比例溶于適量無水乙醇中，使其全部溶解。轉(zhuǎn)移至IL圓底燒瓶中，30°C恒溫水浴中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾除去有機溶劑，在瓶壁上形成均勻類脂薄膜。用IOOmL PBS (pH=7.4)水化類脂薄膜(30°C )，形成粗懸液。將脂質(zhì)體懸液在600bar壓力下，用高壓均質(zhì)機處理五次，即得左旋乙基留烯二酮納米脂質(zhì)體。比較了兩種卵磷脂——蛋黃卵磷脂和大豆卵磷脂制備的脂質(zhì)體，平均粒徑相似，分別為131.6nm和148.3nm (圖1)，透射電鏡觀察形態(tài)相同。向上述制得的脂質(zhì)體中加入5%蔗糖作保護液，放入_70°C冰箱冷凍48h。取出冷凍后的脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機蒸發(fā)48h，即得左旋乙基留烯二酮納米脂質(zhì)體凍干粉末，放入-20°C冰箱保存。脂質(zhì)體制成凍干粉末后便于后續(xù)的投料處理，脂質(zhì)體粒徑大小也相對穩(wěn)定。凍干粉末與普通冷凍脂質(zhì)體(未凍干)復(fù)溶后的粒徑分布結(jié)果見(圖2)。凍干保護劑的加入可降低凍結(jié)過程中脂質(zhì)體囊泡的脫水速度和皺縮程度，并防止冰晶對囊泡的機械損傷。直接冷凍儲存脂質(zhì)體，復(fù)溶后，粒徑顯著增大，有沉降現(xiàn)象。將兩種卵磷脂制備的底物納米脂質(zhì)體凍干粉進行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率一致，因此制備脂質(zhì)體時可以優(yōu)先選用價格較低的大豆卵磷脂。
[0045]實施例2轉(zhuǎn)化時間的優(yōu)化
[0046]1、底物納米脂質(zhì)體凍干粉的制備
[0047]按實施例1所述方法制備底物納米脂質(zhì)體凍干粉備用
[0048]2、微生物與培養(yǎng)
[0049]微生物菌種:Metarhiziumanisopliaell490,菌種保藏號 CCTCC M2011240。該菌種能在左旋乙基留烯二酮上引入Ila羥基。
[0050]斜面培養(yǎng):將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，其中添加質(zhì)量百分比為0.25%的蠶蛹粉，26~30°C培養(yǎng)5~10天。
[0051]發(fā)酵培養(yǎng):將上述斜面菌種在無菌條件下用接種環(huán)接I環(huán)于裝有40mL液體培養(yǎng)基(10g/L葡萄糖、10g/L黃豆粉、5g/L蠶蛹粉，pH6.5)的250mL搖瓶中，28 °C條件下，旋轉(zhuǎn)式搖床220r/min培養(yǎng)24小時，得種子液。
[0052]3、生物轉(zhuǎn)化
[0053]將制備好的底物納米脂質(zhì)體凍干粉按2g/L的底物濃度投入上述制備好的種子液中(50mL搖瓶裝液量10mL)，分別在轉(zhuǎn)化24h、36h、48h、54h、60h和66h取樣分析不同轉(zhuǎn)化時間轉(zhuǎn)化率的變化。比較兩種投料方式——納米脂質(zhì)體投料與游離底物投料(DMF溶解)的轉(zhuǎn)化-時間曲線表明，納米脂質(zhì)體投料方式下(圖3)，轉(zhuǎn)化24h即有約1/3的底物被轉(zhuǎn)化，36h后底物被迅速轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，66h后產(chǎn)物產(chǎn)量達到17.44mg (轉(zhuǎn)化率87.2%)，底物幾乎完全被轉(zhuǎn)化；而DMF投料方式下，底物轉(zhuǎn)化始終比較緩慢，轉(zhuǎn)化66h后產(chǎn)物DES2產(chǎn)量僅為6.22mg(轉(zhuǎn)化率31.1%)，進一步延長轉(zhuǎn)化時間底物仍然不能被完全轉(zhuǎn)化。證明將底物制成納米脂質(zhì)體后，促進底物迅速向胞內(nèi)運輸，在短時間內(nèi)即被完全轉(zhuǎn)化。
[0054]實施例3轉(zhuǎn)化pH的優(yōu)化
[0055]1、底物納米脂質(zhì)體凍干粉的制備
[0056]按實施例1所述方法制備底物納米脂質(zhì)體凍干粉備用。
[0057]2、微生物與培養(yǎng)
[0058]微生物菌種:Metarhiziumanisopliaell490,菌種保藏號 CCTCC M2011240。該菌種能在左旋乙基留烯二酮上引入Ila羥基。
[0059]斜面培養(yǎng):將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，其中添加質(zhì)量百分比為0.25%的蠶蛹粉，26~30°C培養(yǎng)5~10天。
[0060]發(fā)酵培養(yǎng):將上述斜面菌種在無菌條件下用接種環(huán)接I環(huán)于裝有40mL液體培養(yǎng)基(10g/L葡萄糖、10g/L黃豆粉、5g/L蠶蛹粉，pH6.5)的250mL搖瓶中，28 °C條件下，旋轉(zhuǎn)式搖床220r/min培養(yǎng)24小時， 得種子液。
[0061]3、生物轉(zhuǎn)化
[0062]將培養(yǎng)基pH調(diào)至5.0,6.0,6.5,7.0及8.0，投料濃度3g/L，轉(zhuǎn)化66h后,TLC掃描分析。結(jié)果表明培養(yǎng)基pH控制在6.5有利于轉(zhuǎn)化(如圖4所示)
[0063]實施例4投料濃度的優(yōu)化
[0064]1、底物納米脂質(zhì)體凍干粉的制備
[0065]按實施例1所述方法制備底物納米脂質(zhì)體凍干粉備用。
[0066]2、微生物與培養(yǎng)
[0067]微生物菌種:Metarhiziumanisopliaell490,菌種保藏號 CCTCC M2011240。該菌種能在左旋乙基留烯二酮上引入Ila羥基。
[0068]斜面培養(yǎng):將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，其中添加質(zhì)量百分比為0.25%的蠶蛹粉，26~30°C培養(yǎng)5~10天。
[0069]發(fā)酵培養(yǎng):將上述斜面菌種在無菌條件下用接種環(huán)接I環(huán)于裝有40mL液體培養(yǎng)基(10g/L葡萄糖、10g/L黃豆粉、5g/L蠶蛹粉，pH6.5)的250mL搖瓶中，28 °C條件下，旋轉(zhuǎn)式搖床220r/min培養(yǎng)24小時，得種子液。
[0070]2、生物轉(zhuǎn)化
[0071]在不同的投料濃度下(2-10g/L)，比較了納米脂質(zhì)體投料與游離底物投料(DMF溶解)的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果表明(如圖5所示)，投料濃度在2g/L時，納米脂質(zhì)體投料方式下轉(zhuǎn)化率高達80%以上，而游離底物投料方式下為40%左右；投料濃度提高到2g/L以上后，采用游離底物投料轉(zhuǎn)化率會明顯下降，主要是過多的不溶性底物對菌體生長和轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了毒性及抑制作用；而在納米脂質(zhì)體投料方式下，投料濃度提高到7g/L，轉(zhuǎn)化率仍然可以維持在60%以上。[0072]實施例5菌齡的優(yōu)化
[0073]1、底物納米脂質(zhì)體凍干粉的制備
[0074]按實施例1所述方法制備底物納米脂質(zhì)體凍干粉備用。
[0075]2、微生物與培養(yǎng)
[0076]微生物菌種:Metarhiziumanisopliaell490,菌種保藏號 CCTCC M2011240。該菌種能在左旋乙基留烯二酮上引入Ila羥基。
[0077]斜面培養(yǎng):將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，其中添加質(zhì)量百分比為0.25%的蠶蛹粉，26~30°C培養(yǎng)5~10天。
[0078]發(fā)酵培養(yǎng):將 上述斜面菌種在無菌條件下用接種環(huán)接I環(huán)于裝有40mL液體培養(yǎng)基(10g/L葡萄糖、10g/L黃豆粉、5g/L蠶蛹粉，pH6.5)的250mL搖瓶中，28 °C條件下，旋轉(zhuǎn)式搖床220r/min分別培養(yǎng)24h、36h和48h，得不同菌齡的種子液。
[0079]3、生物轉(zhuǎn)化
[0080]將底物納米脂質(zhì)體凍干粉分別投入菌齡24h、36h和48h的種子液中，分析不同菌齡對轉(zhuǎn)化率的影響(投料濃度3g/L)，轉(zhuǎn)化66h后取樣分析，結(jié)果表明菌齡對轉(zhuǎn)化影響較大，24h菌齡最有利于轉(zhuǎn)化，菌體生長過老過稠不利于轉(zhuǎn)化(如圖6所示)。
【權(quán)利要求】
1.去氧孕烯中間體納米脂質(zhì)體生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化方法，包括以左旋乙基留烯二酮為原料，以金龜子綠僵菌突變株(Metarhizium anisopliae)11490 (CCTCC M2011240)為菌種進行微生物轉(zhuǎn)化，其特征在于，該方法采用卵磷脂為載體將疏水性底物左旋乙基留烯二酮制成底物納米脂質(zhì)體，再進行微生物轉(zhuǎn)化，其包括步驟: 1)底物納米脂質(zhì)體的制備 采用薄膜分散法將左旋乙基留烯二酮以卵磷脂為載體經(jīng)高壓均質(zhì)機制成納米脂質(zhì)體，測定平均粒徑； 2)微生物與培養(yǎng) 微生物菌種:Metarhizium anisopliaell490,菌種保藏號CCTCC M2011240 ;該菌種在左旋乙基留烯二酮上引入11 α羥基； 斜面培養(yǎng):將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，其中添加質(zhì)量百分比為0.25%的蠶蛹粉，26~30°C培養(yǎng)5~10天； 發(fā)酵培養(yǎng):將上述斜面菌種無菌接種于裝有液體培養(yǎng)基搖瓶中，28°C條件下，旋轉(zhuǎn)式搖床220r/min培養(yǎng)48小時，得種子液； 3)生物轉(zhuǎn)化 將制得的底物納米脂質(zhì)體按底物濃度投入上述制備好的種子液中，相同條件下轉(zhuǎn)化，取轉(zhuǎn)化液分析； 4)分析方法 取發(fā)酵液加入L乙酸乙酯浸泡過夜,取樣點樣于GF254硅膠板，同時取底物和產(chǎn)物標準品點樣對照，展開劑CH2Cl2 = CH3OH (20:1), CAMAG Scanner-3掃描分析； 所述的方法中將納米脂質(zhì)體應(yīng)用于去氧孕烯關(guān)鍵中間體Ila羥化的優(yōu)化條件為:采用薄膜分散法結(jié)合高壓均質(zhì)機制備底物納米脂質(zhì)體并制成凍干粉儲存，培養(yǎng)基PH為6.5，轉(zhuǎn)化時間60-70h，菌齡24h，投料濃度2g/L-7g/L。
2.按權(quán)利要求1所述的去氧孕烯中間體納米脂質(zhì)體生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化方法，其特征在于，所述的卵磷脂選自蛋黃卵磷脂或大豆卵磷脂。
3.按權(quán)利要求1所述的去氧孕烯中間體納米脂質(zhì)體生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化方法，其特征在于，所述的液體培養(yǎng)基中含有10g/L葡萄糖、10g/L黃豆粉、5g/L蠶蛹粉，pH6.5。
【文檔編號】C12R1/645GK103834712SQ201310484977
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月26日
【發(fā)明者】馮美卿, 葉麗 申請人:復(fù)旦大學(xué)