日本短體線蟲的pcr檢測(cè)試劑及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了日本短體線蟲的PCR檢測(cè)試劑及試劑盒，包括一對(duì)特異性引物，上游引物的核苷酸序列：GGCAACGGGCCTAGTTATGA，下游引物的核苷酸序列：GACTCGCGCACACGATAAAC。該特異性引物對(duì)蘋果根結(jié)線蟲特異、靈敏，擴(kuò)增的特異性片段大小為176bp，對(duì)其它短體線蟲無(wú)特異性條帶片段；應(yīng)用本發(fā)明的特異性引物及試劑盒，可在4小時(shí)內(nèi)完成測(cè)試，靈敏度高，實(shí)用性強(qiáng)。
【專利說(shuō)明】日本短體線蟲的PCR檢測(cè)試劑及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及短體屬線蟲的檢測(cè)技術(shù)，具體涉及日本短體線蟲的PCR檢測(cè)試劑及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]短體屬線蟲(Pratylenchus Filipjev, 1936)為植物根系專性內(nèi)寄生線蟲,是植物病原線蟲中種類最多、分布最廣、為害最嚴(yán)重的類群之一，具有十分重要的經(jīng)濟(jì)意義。我國(guó)于2007年將短體線蟲(非中國(guó)種)列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》，在口岸實(shí)施嚴(yán)格檢疫，以保護(hù)我國(guó)農(nóng)業(yè)和生態(tài)安全。日本短體線蟲Pratylenchus japonicusRyss, 1988為寧波口岸首次從來(lái)自日本的雞爪槭中截獲。國(guó)內(nèi)尚無(wú)分布，為非中國(guó)種，是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物。日本短體線蟲在1963年首次由日本的Gotoh和Ohshima提到，當(dāng)時(shí)只鑒定到短體屬，1974年Gotoh又將這個(gè)種歸于穿孔屬，1982年Minagawa將該種鑒定為大針短體線蟲Pratylenchus macrostylus Wu, 1971。1988年,俄羅斯學(xué)者Ryss將在日本發(fā)現(xiàn)的該種線蟲與加拿大發(fā)現(xiàn)的大針短體線蟲進(jìn)行區(qū)分，把它描述為新的亞種P.macrostylus japonicus, Ryss, 1988。直到 1997 年，日本的 Mizukubo 等根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、測(cè)計(jì)值及分子生物學(xué)特征，將其與大針短體線蟲區(qū)分開來(lái)，并將其從亞種提升到種，命名為日本短體線蟲。日本短體線蟲僅發(fā)現(xiàn)于日本，我國(guó)尚未有相關(guān)報(bào)道。其寄主包括櫟屬的扁果麻櫟、槲樹、抱櫟以及蘋果、枇杷、矮櫻桃等幾種果樹，可以對(duì)寄主造成侵染，影響寄主植物的生長(zhǎng)。
[0003]我國(guó)口岸出入境 檢疫實(shí)驗(yàn)室或其他相關(guān)部門，都面臨著對(duì)短體線蟲進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定這一難題。近年來(lái)，雖然在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，PCR - RFLP、熒光PCR、特異性PCR、序列測(cè)定、LAMP技術(shù)等已在線蟲鑒定上廣泛應(yīng)用，但在短體線蟲上應(yīng)用很少。目前還未
【公開日】本短體線蟲的分子生物學(xué)方面的檢測(cè)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速、特異、準(zhǔn)確的日本短體線蟲的PCR檢測(cè)試劑及試劑盒。
[0005]本發(fā)明系選擇參考GenBank中日本短體線蟲的核糖體28S基因(InternalTranscribed Spacer),使用 Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp)設(shè)計(jì)了特異性引物，經(jīng)過(guò)大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，并經(jīng)過(guò)大量實(shí)際樣品的檢測(cè)應(yīng)用評(píng)估(以日本短體線蟲的DNA為模板，穿刺短體線蟲、咖啡短體線蟲、傷殘短體線蟲、盧斯短體線蟲為陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照，利用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。通過(guò)觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的保守性和特異性，篩選最適引物)，篩選得到擴(kuò)增效率和特異性好的一對(duì)特異性引物。引物均由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。
[0006]本發(fā)明的日本短體線蟲的PCR檢測(cè)試劑，包括一對(duì)特異性引物，所述一對(duì)特異性引物的核苷酸序列分別為:[0007]上游引物:5’-GGCAACGGGC CTAGTTATGA-3’
[0008]下游引物:5’ -GACTCGCGCA CACGATAAAC-3 ’。
[0009]日本短體線蟲的PCR檢測(cè)試劑盒，由無(wú)Mg2+的10XPCR緩沖液，濃度為25mM的MgCl2溶液，濃度為0.1mM的dNTP溶液，濃度5U/ y L的Taq酶溶液，濃度都為IOyM的上游引物溶液和下游引物溶液組成。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是日本短體線蟲的PCR檢測(cè)試劑及試劑盒，包括一對(duì)特異性引物，上游引物的核苷酸序列:GGCAACGGGC CTAGTTATGA，下游引物的核苷酸序列:GACTCGCGCA CACGATAAAC。該特異性引物對(duì)日本短體線蟲特異、靈敏，擴(kuò)增的特異性片段大小為176bp，對(duì)其它短體線蟲無(wú)特異性條帶片段；應(yīng)用本發(fā)明的特異性引物及試劑盒，可在4小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，靈敏度高，實(shí)用性強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0011]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0012]實(shí)施例1、日本短體線蟲的PCR檢測(cè)試劑盒
[0013]100次或200次反應(yīng)體系，50 ii L反應(yīng)體系包括:無(wú)Mg2+的10 X PCR緩沖液5.0 y L，濃度為25mM的MgCl2溶液5.0 y L，濃度為0.1mM的dNTP溶液4.0 y L，濃度5U/ y L的Taq酶溶液0.6 ii L，濃度都為10 ii M的上游引物溶液和下游引物溶液各3.0 ii L。Taq酶液，dNTP液購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，其中上游引物溶液含有核苷酸序列為GGCAACGGGCCTAGTTATGA的引物，下游引物溶 液含有核苷酸序列為GACTCGCGCACACGATAAAC弓丨物。
[0014]實(shí)施例2、DNA提取方法
[0015]挑取單條線蟲放入200 u L PCR管中[已加有10 ii L雙蒸水和5 u LlO XPCR緩沖液(無(wú)Mg2+)]，液氮中放置Imin (或-70度放置0.5h)以上，取出后立即85°C加熱2min。然后向PCR管中加入liiLlmg/mL蛋白酶K，56°C加熱30min以上，95°C加熱lOmin，得到DNA模板。
[0016]實(shí)施例3、PCR檢測(cè)方法
[0017]用日本短體線蟲的PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系為:無(wú)Mg2+的IOXPCR緩沖液5.0uL,濃度為25mM的MgCl2溶液5.0 u L,濃度為0.1mM的dNTP溶液4.0 u L,濃度5U/ ii L的Taq酶溶液0.6 y L，濃度都為10 y M的上游引物溶液和下游引物溶液各3.0 y L，DNA 模板 1.0 ~5.0 ii L，ddH20 補(bǔ)齊 50 u L0 PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30S,55°C退火30S，72°C延伸30S，共35個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72°C延伸6min。電泳:將5uL PCR產(chǎn)物用1.0% (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像，出現(xiàn)特異性片段大小為176bp，則為日本短體線蟲。
[0018]實(shí)施例4、日本短體線蟲的特異性和敏感性試驗(yàn)
[0019]用實(shí)施例2的提取方法，實(shí)施例3的PCR檢測(cè)方法，分別對(duì)日本短體線蟲(采自日本進(jìn)口的雞爪槭)、盧斯短體線蟲(采自日本進(jìn)口的山茶)、咖啡短體線蟲(采自寧波的大豆)、傷殘短體線蟲(采自日本進(jìn)口的雞爪槭)、朱頂紅短體線蟲(采自以色列進(jìn)口的孤挺花)、玻利維亞短體線蟲(采自新西蘭進(jìn)口的麻)、假草地短體線蟲(采自俄羅斯進(jìn)口的郁金香)和最短尾短體線蟲(采自臺(tái)灣進(jìn)口的苗)進(jìn)行檢測(cè)，只有日本短體線蟲能進(jìn)行有效擴(kuò)增，出現(xiàn)條帶，且其特異性片段大小為176bp，說(shuō)明本發(fā)明一對(duì)引物具有很好的特異性。對(duì)日本短體線蟲的DNA模板進(jìn)行10°、10_ 1、10_ 2、10_ 3、10_ 4、10_ 5、10_ 6稀釋再PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示PCR檢測(cè)限為原液稀釋10—1倍。
【權(quán)利要求】
1.日本短體線蟲的PCR檢測(cè)試劑，包括一對(duì)特異性引物，其特征在于一對(duì)特異性引物的核苷酸序列分別為: 上游引物:GGCAACGGGC CTAGTTATGA 下游引物:GACTCGCGCA CACGATAAAC。
2.如權(quán)利要求1所述的日本短體線蟲的PCR檢測(cè)試劑組成的檢測(cè)試劑盒，其特征在于由無(wú)Mg2+的IOXPCR緩沖液，濃度為25mM的MgCl2溶液，濃度為0.1mM的dNTP溶液，濃度5U/ ii L的Taq酶溶液， 濃度都為10 y M的上游引物溶液和下游引物溶液組成。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103789427SQ201410030404
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】顧建鋒, 何潔, 陳先鋒 申請(qǐng)人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院