一株海洋殼青霉、其衍生的喹啉酮類化合物及其制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一株海洋真菌殼青霉、其衍生的喹啉酮類化合物及該化合物的制備和應用。所述喹啉酮類化合物的具體結(jié)構(gòu)式如R1～R6所示，其制備方法為將殼青霉AP2T1?CGMCC?No.8516接種于培養(yǎng)基中靜止發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取，菌絲體由有機溶劑提取，合并后粗提物用有機溶劑進行葡聚糖凝膠柱、反相硅膠柱層析，經(jīng)薄層層析檢測，將含有中間體的洗脫組分進行甲基化處理后，繼續(xù)進行制備薄層層析、反相硅膠柱層析分離純化得目標化合物R1～R6；化合物R1～R6顯示出在制備抗腫瘤藥物、抗細菌劑及農(nóng)用殺蟲劑中具有廣泛的應用前景。
【專利說明】一株海洋殼青霉、其衍生的喹啉酮類化合物及其制備和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】；涉及一株海洋真菌殼青霉AP2T1，特別是利用該真菌衍生的喹啉酮類化合物與其制備方法以及其在抗腫瘤藥物、抗細菌抗生素及殺蟲劑領(lǐng)域的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前在臨床治療中發(fā)現(xiàn)腫瘤的耐藥性也在不斷增強，且出現(xiàn)多藥耐藥性現(xiàn)象，已有抗腫瘤藥物在臨床化療中越來越力不從心；另外臨床治療發(fā)現(xiàn)病原微生物的耐藥性越來越強，很多傳統(tǒng)抗生素已基本喪失療效，因此有必要尋找新型的抗腫瘤藥物和抗生素來滿足臨床藥物研發(fā)的需要。此外，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)因為過度使用各種化學合成農(nóng)藥，造成嚴重的食品、土壤及水污染，并經(jīng)過食物鏈危及人體健康和生態(tài)平衡，農(nóng)藥殘留也嚴重阻礙了我國的農(nóng)產(chǎn)品出口 ；而生物農(nóng)藥具有不易產(chǎn)生抗藥性、對非靶生物安全、環(huán)境友好且易于自然降解等優(yōu)點，對于人類健康、環(huán)境保護及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。海洋真菌來源的抗腫瘤藥物、抗細菌抗生素及殺蟲劑具有易于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)、高效、易于克服抗藥性等優(yōu)點，易于實現(xiàn)藥源穩(wěn)定供給，具有較好的經(jīng) 濟、社會與環(huán)境效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明通過分離于鯊魚灰鯖鯊觸部的真菌殼青霉(Penicillium crustosum)CGMCC N0.8516發(fā)酵；經(jīng)提取、分離、甲基化、分離獲得的喹啉酮類化合物，經(jīng)實驗得出這些化合物在制備抗腫瘤藥物、抗細菌劑及農(nóng)用殺蟲劑中都具有廣泛的應用前景，有較好的經(jīng)濟、社會與環(huán)境效益。
[0004]本發(fā)明涉及的海洋真菌殼青霉(Penicillium crustosum) AP2T1是從中國東海漁獲的海洋生物灰鯖鯊鰓耙組織中分離獲得。該菌株合適的生長鹽濃度范圍為2.0%~5.0%。依據(jù)ITSl-5.8S-1TS2rDNA序列分析比對及《真菌鑒定手冊》(魏景超，1979)，經(jīng)鑒定為Penicillium crustosum AP2T1菌株，已于2013年11月27日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(其簡稱為CGMCC)，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。保藏編號為=CGMCC N0.8516。
[0005]海洋真菌殼青霉(Penicillium crustosum) AP2T1具有下述性質(zhì):接種到海水馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(海水PDA)平板上，28°C培養(yǎng)，菌落開始為白色，圓形，向四周擴展，后從菌落中央向邊緣產(chǎn)生灰綠色孢子，整個菌落呈粉粒狀，中央凸起，有多道同心紋，邊緣顏色較淺、放射狀，背面產(chǎn)黃色色素。菌絲生長速度每天0.44cm。基部無足細胞，頂端不形成膨大的頂囊，其分生孢子梗經(jīng)過多次分枝，產(chǎn)生幾輪對稱或不對稱的小梗，形成典型的帚狀分生孢子穗。孢子圓形，綠色；分生孢子梗基部無足細胞。最佳生長溫度范圍26~30°C，最佳生長pH為6.0~7.0，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源。該菌株在海水馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵可產(chǎn)生抗腫瘤、抗菌、殺蟲活性物質(zhì)。[0006]海洋真菌殼青霉(Penicilliumcrustosum) AP2T1 的 ITS1-5.8S_ITS2rDNA 序列(541bp)已向美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GenBank基因序列數(shù)據(jù)庫提交，登陸號為 JN368448。
[0007]本發(fā)明還公開了一系列喹啉酮類化合物，其由上文所述的海洋真菌殼青霉(Penicillium crustosum) AP2T1CGMCC N0.8516衍生，所述喹啉酮類化合物的結(jié)構(gòu)式為:
[0008]
【權(quán)利要求】
1.一株海洋真菌殼青霉(Penicillium crustosum) AP2T1，其保藏編號為CGMCCN0.8516。
2.喹啉酮類化合物，其特征在于:由所述的海洋真菌殼青霉(Penicilliumcrustosum) AP2T1CGMCC N0.8516衍生，所述喹啉酮類化合物的結(jié)構(gòu)式為:
3.如權(quán)利要求2所述的喹啉酮類化合物的制備方法，其特征在于包括如下操作步驟: I.發(fā)酵 從殼青霉(Penicillium crustosum) CGMCC N0.8516發(fā)酵產(chǎn)物中提取、分離純化viridicatol ； I1.甲基化 a.將步驟I獲得的viridicatol干燥后加入密閉反應容器，在氬氣或干燥氮氣保護下，按照每0.1g viridicatol加入0.5~1.5mL無水二甲基甲酰胺的比例添加,室溫下磁力攪拌8~20min ； b.攪拌狀態(tài)下，向步驟a產(chǎn)物中分三次，每次間隔15~25min，逐滴加入三甲基硅重氮甲燒的2.0M 二乙醚溶液,其每次加入的體積與步驟a中viridicatol的質(zhì)量比為0.2~.0.3mL:0.1 ~0.15mL:0.1 ~0.15mL:0.1g ； c.繼續(xù)攪拌2~4小時，TLC監(jiān)測反應進程； d.真空抽干溶劑以終止反應； e.按照每0.1g viridicatol加入0.1~0.5mL水的比例加水,真空抽干； f.分離純化得到化合物R1-R6； 或者，化合物R6從步驟I獲得的發(fā)酵產(chǎn)物中，經(jīng)過柱層析得到； 所述化合物R1-R6在薄層層析板上，于254nm紫外線照射下均呈單個的深紫色斑點，在365nm紫外線照射下均呈單個的紫色熒光斑點，硫酸茴香醛顯色均為淺橙色；其高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析的保留時間及分子量依次為15.2min、M=295 ；12.7min、M=295 ；.12.7min、M=281 ；11.2min、M=281 ；10.2min、M=281 ；9.0min、M=267 ；所述的檢測用高效液相色譜分析條件為Nucleosil C-18柱,填料粒徑3微米,柱尺寸.2.0mmX 100mm，流動相為A相:0.1%甲酸水溶液，B相:0.06%甲酸乙腈溶液，0_15minl0%B線性梯度增至100%B，15-20min為100%B，流速0.4mL/min ;檢測器為陣列二極管檢測器、電噴霧質(zhì)譜儀。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述的提取包括以下操作步驟:過濾發(fā)酵產(chǎn)物，分別收集菌絲體和發(fā)酵液，并將獲得的發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取并濃縮，將獲得的菌絲體用有機溶劑提取并濃縮，將所得濃縮物合并，即為粗提物； 其中，所述有機溶劑為丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述的分離純化包括以下操作步驟: 將步驟I中所獲得的提取產(chǎn)物經(jīng)色譜分離，得到在S1-60F254薄層層析板上Rf值為.0.27、254nm紫外光下呈暗紫色、365nm紫外線下有紫色突光的物質(zhì)viridicatol,層析展開劑為體積比為9:1的氯仿-甲醇混合溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟I中的發(fā)酵所用培養(yǎng)基組成為:每升含土豆汁500mL,天然粗海鹽配制的30~50g/L鹽水500mL,鹿糖15~25g。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:步驟I中發(fā)酵的條件是:26~30°C培養(yǎng)箱靜止發(fā)酵25~35天，發(fā)酵結(jié)束時加入發(fā)酵液一半體積的乙酸乙酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:步驟IIf中所述的分離純化方法為薄層層析和反相柱層析法，其具體如下: a.將步驟IIe獲得的中間體甲基化產(chǎn)物用有機溶劑溶解后，加樣至S1-60F254制備薄層層析板，以體積比20:1的氯仿-甲醇為展開劑進行層析后，分別刮取Rf值為0.90,0.79、.0.67,0.43和0.15的帶，研磨后用2~10:1的氯仿-甲醇洗脫，收集洗脫液并濃縮干燥。其中Rf值為0.79,0.67及0.15的條帶洗脫物為所述的化合物R2、R3、和R6 ； b.將步驟a中Rf值為0.90條帶洗脫物，再次使用S1-60F254制備薄層層析板分離，以體積比2:1的石油醚-丙酮為展開劑，刮取Rf值為0.60的條帶，研磨后用2~10:1的氯仿-甲醇洗脫，收集洗脫液濃縮干燥得到所述的化合物Rl ； c.將步驟a中Rf值為0.43條帶洗脫物，使用反向硅膠柱層析分離，洗脫液為體積比.70:30的甲醇-水，流速0.50~0.60個柱體積/小時，分別收集1.5~3.0及2.5~4.0個柱體積之間的洗脫液，收集洗脫液濃縮干燥分別得到所述的化合物R4和R5。
9.如權(quán)利要求2 所述的喹啉酮類化合物在制備抗腫瘤藥物、抗細菌抗生素及農(nóng)用殺蟲劑中的應用。
【文檔編號】C12R1/80GK103937678SQ201410036251
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】張翼, 穆軍, 馮妍, 斯蒂芬妮·格弘德, 韓金媛, 溫利雪, 鮑海燕 申請人:大連交通大學