突變的基因prpf4在制備遺傳性視網(wǎng)膜疾病診斷試劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了突變的基因PRPF4在制備遺傳性視網(wǎng)膜疾病診斷試劑中的應用。篩選HRDs致病基因的方法包括（1）HRDs遺傳資源庫的建立，（2）設計并合成HRDs致病基因的基因芯片雜交探針，并將其整合到基因芯片上；（3）利用制備的基因芯片捕獲目標區(qū)域并進行深度測序；（4）對測序數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，篩選出候選致病基因；（5）針對新發(fā)現(xiàn)的剪切基因突變位點進行功能預測。本發(fā)明建立了高效的HRDs靶基因捕獲技術，以深度測序為手段，確認HRDs捕獲芯片效率，建立高效、可信的生物信息分析模型。
【專利說明】突變的基因PRPF4在制備遺傳性視網(wǎng)膜疾病診斷試劑中的應用
[0001]分案說明
[0002]本申請系2013年I月7日提交的申請?zhí)枮?013100052529，名稱為一種篩查HRDs致病突變的方法及涉及的基因芯片雜交探針設計方法的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0003]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及突變的基因PRPF4在制備遺傳性視網(wǎng)膜疾病診斷試劑中的應用。
【背景技術】
[0004]遺傳性視網(wǎng)膜疾病(Hereditaryretinal diseases, HRDs)是一組由遺傳缺陷引起的進行性視網(wǎng)膜退行性疾 病，是臨床上常見且危害嚴重的遺傳性致盲疾病。作為世界范圍內(nèi)工作年齡人群的第一大致盲眼病，HRDs在歐美發(fā)病率約為1/3000，在我國更是高達1/1000。我國是HRDs遺傳資源大國，但目前HRDs相關的遺傳學信息多來自西方國家，因此對我國HRDs患者進行深入的遺傳學研究顯得尤為重要。
[0005]HRDs多為單基因遺傳病，眾多基因缺陷均可導致其發(fā)生，其常見的遺傳模式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及X連鎖隱性遺傳。迄今，全世界已鑒定出191個HRDs相關致病基因和231個連鎖位點(www.RetNet.0rg),且隨著研究深入,該數(shù)目正逐年遞增。其致病基因數(shù)之多表明臨床表現(xiàn)相同的患者，很有可能有不同的基因型，即顯著的遺傳異質(zhì)性。目前仍有大于60%(西方國家統(tǒng)計結果，我國比率更高)HRDs患者的致病基因尚未找到，提示存在大量新致病基因有待挖掘。
[0006]由DNA轉錄得到的前體RNA (pre-mRNA)需經(jīng)過剪接成為信使RNA (mRNA)才能進一步參與翻譯過程合成蛋白質(zhì)，而該剪接過程主要發(fā)生在剪接體。剪接體是由小分子核糖核蛋白(snRNPs)組成的超大分子復合體，構成剪接體的snRNP有五種:U1、U2、U4/U6和U5。研究指出，與前體RNA剪接體蛋白編碼相關的基因(剪切基因)能夠引起常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性(ADRP)。目前已被證實能夠引起ADRP的剪切基因有PRPF3、PRPF6、PRPF8、PRPF31、RP9以及由 申請人:所發(fā)現(xiàn)并報道的SNRNP200，這些剪切基因都是通過影響U4/U6-U5復合體而引起ADRP的。值得關注的是，上述六個剪切基因所編碼的蛋白在生物體各種細胞內(nèi)廣泛表達，但目前研究僅發(fā)現(xiàn)該六個基因相關的突變能夠引起視網(wǎng)膜疾病，沒有引起其他疾病的報道。因此，針對剪切基因與RP發(fā)病的相關研究顯得尤為必要。
[0007]針對HRDs的研究必須建立在一定的分子生物學技術的基礎上。研究HRDs致病基因的一個重要目的是進行HRDs分子診斷，鑒于其顯著的遺傳異質(zhì)性，如何檢測眾多致病基因突變是目前的難題之一?；谶B鎖分析的定位克隆策略是鑒定單基因遺傳病致病基因的經(jīng)典方法，但是同時也面臨一些困難:①通常需要多代家系，難以分析小家系和散發(fā)病例。②有時多代家系也不能定位致病位點。③難以在連鎖區(qū)域內(nèi)篩選出正確的致病基因。因此，鑒于HRDs疾病本身的性質(zhì)及傳統(tǒng)分析技術的局限性，尋求一種全新的HRDs致病基因的研究方法顯得尤為迫切。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是針對上述缺陷，提供突變的基因PRPF4在制備遺傳性視網(wǎng)膜疾病診斷試劑中的應用。
[0009]本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn):
[0010]一種以深度測序為平臺篩查或檢測HRDs致病突變所涉及的基因芯片雜交探針的設計方法，包括:
[0011](I)候選基因的選擇:所述的基因捕獲芯片涵蓋了全部179個由RetNet公布的視網(wǎng)膜疾病相關基因，及高度懷疑可能與視網(wǎng)膜疾病相關的剪切基因；
[0012](2)轉錄本的選擇:針對不同基因選擇特定轉錄本，選擇原則是:首先考慮擁有CCDS編碼蛋白的轉錄本，若一個基因有多個轉錄本均編碼蛋白，則首選含氨基酸數(shù)最多的蛋白相對應的轉錄本，若多個轉錄本氨基酸含量相同，則進一步選擇含堿基數(shù)最多的轉錄本；
[0013](3)雜交探針的設計:根據(jù)(2)中挑選出的不同轉錄本設計雜交探針，設計標準為:(a)探針覆蓋所有候選基因的外顯子區(qū)域及外顯子和內(nèi)含子拼接處；(b)去除在人類基因組中出現(xiàn)的高度重復序列及出現(xiàn)2-5倍的較低頻率的重復片段；(C)對臨近外顯子的探針進行整合，整合標準為:當相鄰外顯子的綜合目標區(qū)域總和小于600bp時，即將其整合為一個探針，以求通過一對探針完成多對外顯子區(qū)域的捕獲；其中，所述的相鄰外顯子的綜合目標區(qū)域指前個外顯 子的上游IOObp起至后一個外顯子的下游IOObp止；(d)當所設計探針序列小于250bp時,在其兩端各包含上下游IOObp的內(nèi)含子的基礎上,各繼續(xù)增加相同bp數(shù)的內(nèi)含子，使探針大小達到250bp。
[0014]其中，所述的高度懷疑可能與視網(wǎng)膜疾病相關的剪切基因優(yōu)選PRPF4。
[0015]本發(fā)明方法是一種通用的以深度測序為平臺篩查HRDs致病突變所涉及基因芯片的雜交探針設計方法，所述的高度懷疑可能與視網(wǎng)膜疾病相關的剪切基因不局限于上述優(yōu)選的基因，也可以是其他的高度懷疑可能與視網(wǎng)膜疾病相關的剪切基因。
[0016]所述的外顯子和內(nèi)含子拼接處是指外顯子上下游至少各100個bp。
[0017]本發(fā)明基于深度測序為平臺篩選HRDs致病基因的基因芯片雜交探針設計方法中，設計的用于篩選HRDs致病基因PRPF4的雜交探針序列共15條，序列如SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.15 所示。
[0018]一種以深度測序為平臺篩查HRDs致病突變的方法，包括以下步驟:
[0019](I)建立HRDs遺傳資源庫，收集HRDs類病人的臨床資料及血液標本，提取基因組DNA ；
[0020](2)按照上述雜交探針設計方法設計并合成HRDs致病基因芯片的雜交探針，并將其整合到基因芯片上；
[0021](3)利用制備的基因芯片捕獲目標區(qū)域并進行深度測序；
[0022](4)對測序結果進行優(yōu)化的生物信息學分析，篩選出高度可疑的致病基因及致病突變；
[0023](5)針對新發(fā)現(xiàn)的剪切基因突變位點進行致病能力預測和功能研究。[0024]步驟⑵所述的基因芯片優(yōu)選Roche Nimblegen公司生產(chǎn)的基因芯片。
[0025]步驟(3)所述的利用制備的基因芯片捕獲目標區(qū)域并進行深度測序優(yōu)選利用美國Illumina公司的Hi_seq2000儀器完成。
[0026]步驟(3)所述的利用制備的基因芯片捕獲目標區(qū)域并進行深度測序優(yōu)選流程為:將基因組DNA片段化，在DNA末端標記“A”并與Illumina PE接頭-寡核苷酸混合物相連接；連接產(chǎn)物經(jīng)PCR富集，獲得DNA文庫，并將DNA文庫與已知致病基因捕獲芯片雜交、洗脫、純化，獲得編碼序列；創(chuàng)建配對末端，在Illumina HiSeqTM2000平臺上對目標序列進行測序。
[0027]步驟(4)所述的對測序數(shù)據(jù)進行生物信息學分析優(yōu)選包括:
[0028](I)采用Mosaik軟件處理Illumina原始測序數(shù)據(jù)，產(chǎn)生.bam類型文件,將.bam文件輸入GATK，利用GATK檢測單核苷酸變異體和小的插入或缺失，同時進行質(zhì)量評估，便于下游的生物信息學分析，最后產(chǎn)生.vcf類型文件；
[0029](2)將患者的測序結果在包括dbSNP132
[0030](http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hgl9/database/snpl32.txt.gz.), HapMap 計劃(ftp://ftp.ncb1.nlm.nih.gov/hapmap), 1000Genome Project (ftp://ftp.1OOOgenomes.eb1.ac.uk/vol 1/ftp)，炎黃數(shù)據(jù)庫(http://yh.genomics, org.cn/)以及 Exome Variant Server (http: //evs.gs.Washington.edu/EVS/)在內(nèi)的五個單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫中篩查，濾過所有已知的SNP位點；
[0031] (3)將患者的測序結果所對應的基因序列進行比較和分析，優(yōu)先分析插入/缺失突變、無義突變和錯義突變，結果可分為三類，包括已知突變、已知基因的新突變和新基因的突變。
[0032]通過本發(fā)明所述的方法獲得的HRDs致病基因為與視網(wǎng)膜疾病相關的剪切基因為PRPF4。
[0033]有益效果
[0034]1.HRDs是常見的、嚴重的遺傳性致盲疾病，在我國發(fā)病率高達1/1000，是世界范圍內(nèi)工作年齡人群中的第一大致盲眼病。挖掘HRDs的新致病突變和新致病基因有利于進一步探索HRDs的分子遺傳學病因，是充分利用我國的眼科遺傳病資源，造福遺傳性視網(wǎng)膜疾病患者的現(xiàn)實需要，是后基因組時代最重要的研究方向之一。本專利旨在探索HRDs的遺傳學病因，從而幫助了解發(fā)病機制、輔助臨床診斷、產(chǎn)前診斷和轉基因治療。
[0035]2.大量研究證實，剪切基因的功能異常能夠引起ADRP。因此，針對剪切基因與ADRP的相關研究顯得尤為必要。本專利的候選基因涵蓋了 6個已知致病的剪切基因及4個高度可疑的剪切基因，所有基因均是由 申請人:在多年從事遺傳學研究的基礎上查閱大量文獻所篩選出的，通過本發(fā)明方法的到進一步明確了這些基因與HRDs的關系。
[0036]3.一個基因可以對應多個不同的轉錄本，且不同轉錄本所編碼的RNA及蛋白有所不同。本專利中 申請人:根據(jù)長期從事遺傳學研究的經(jīng)驗，篩選出最優(yōu)轉錄本，并根據(jù)不同的轉錄本設計相應的探針，從而使篩查效益達到最高。
[0037]4.基因的外顯子區(qū)域發(fā)生改變，可直接引起氨基酸序列發(fā)生改變，從而導致蛋白的結構和功能發(fā)生改變。然而研究表明，外顯子和內(nèi)含子交界區(qū)堿基的改變可直接影響基因的剪切。本專利所設計的雜交探針覆蓋所有已知致病基因的外顯子區(qū)域及外顯子和內(nèi)含子拼接處(外顯子上下游至少各100個bp)，使致病位點篩查面達到最廣。
[0038]5.在探針設計過程中，本專利對臨近的外顯子進行整合，旨在用一個探針檢測600bp以內(nèi)的相鄰外顯子的綜合目標區(qū)域(即前個外顯子的上游IOObp起至后一個外顯子的下游IOObp止)，以求通過一對探針完成兩對甚至多對外顯子區(qū)域的捕獲，使探針的篩查效率達到最高。與此同時，我們剔除了目標區(qū)域中所含有的高度重復序列以及在人類基因組中出現(xiàn)2-5倍的較低頻率的重復片段，避免捕獲其他同源基因，使篩查的假陽性率降到最低。
[0039]6.HRDs具有顯著的遺傳異質(zhì)性，目前已知致病基因191個，已連鎖位點231個,且仍存在大量未知的致病基因。應用傳統(tǒng)技術研究顯然具有很大的局限性。深度測序技術是一種比較成熟的高通量測序技 術，可一次性對海量基因(全基因組)進行平行測序，有傳統(tǒng)技術無法比擬的優(yōu)勢。研究證實深度測序技術在孟德爾遺傳疾病的基因挖掘和致病基因篩查方面具有巨大優(yōu)勢，將深度測序技術應用于我國遺傳性視網(wǎng)膜疾病研究是非常必要的、可行的。我們所申請的專利旨在建立高效的HRDs靶基因捕獲技術，以深度測序為手段，確認HRDs捕獲芯片效率，建立高效、可信的生物信息分析模型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖11980-2012年已鑒定的視網(wǎng)膜疾病相關基因及位點數(shù)目
[0041]圖2挖掘新致病基因的技術路線
[0042]圖3深度測序流程
[0043]圖4家系圖(紅框標注為已采血患者)
[0044]圖5先證者眼底照
[0045]圖6測序圖
[0046]圖7蛋白結構預測
【具體實施方式】
[0047]實施例1
[0048]實驗方法:
[0049]1.HRDs遺傳資源庫的建立。
[0050]1.1收集以下三類病人的臨床資料及血液標本:
[0051]1.1.13代或3代以上的常染色體顯性遺傳家系、常染色體隱性遺傳家系、X連鎖隱性遺傳家系，包括RP、Leber先天性黒朦、先天性靜止性夜盲、卵黃樣黃斑營養(yǎng)不良、Stargardt 病。
[0052]1.1.2收集各種HRDs的遺傳性小家系。
[0053]1.1.3收集無家族史的各種HRDs的散發(fā)病例。
[0054]1.2提取基因組DNA:
[0055]米用TIANamp 血液 DNA 抽提試劑盒(Tiangen Biotech C0.Ltd, Beijing, China)，按照廠家提供的protocol從采集到的病人外周血中提取病人的基因組DNA。
[0056]2.挖掘HRDs新致病基因/已知致病基因的新突變(見圖2)。
[0057]2.1設計并定制HRDs相關基因捕犾芯片:[0058]2.1.1候選基因的選擇:
[0059]該基因捕獲芯片涵蓋了全部179個由RetNet公布的視網(wǎng)膜疾病相關基因(其中包括6個已知致病剪切基因)，及4個高度懷疑可能與視網(wǎng)膜疾病相關的剪切基因。其中，6個已知致病剪切基因分別為:PRPF3、PRPF6、PRPF8、PRPF31、RP9及SNRNP200(該基因由 申請人:率先發(fā)現(xiàn)并報道與HRDs疾病相關);4個高度可疑的剪切基因分別是:SNRNP40、SNRNP27、PRPF4及EFTUD2，其在Ensemble數(shù)據(jù)庫中的基因編號如下表所示。以上基因均是由 申請人:在多年從事遺傳學研究的基礎上查閱大量文獻所篩選出的。
[0060]
【權利要求】
1.突變的基因PRPF4在制備遺傳性視網(wǎng)膜疾病診斷試劑中的應用，其特征在于突變的基因/?°/?編碼蛋白第315位氨基酸由野生型的脯氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?br> 2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述的遺傳性視網(wǎng)膜疾病診斷試劑為基因捕獲芯片。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于所述的基因捕獲芯片上用于捕獲/--?基因的雜交探針序列如S EQ ID N0.10所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004826SQ201410047797
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年1月7日 優(yōu)先權日:2013年1月7日
【發(fā)明者】趙晨, 陳雪, 趙堪興, 陳雪娟, 潘鑫源, 蔣超 申請人:趙晨