一種恙蟲病東方體核酸檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及恙蟲病東方體核酸檢測(cè)試劑盒，特別是涉及一種利用復(fù)合探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)恙蟲病東方體核酸的試劑盒。該試劑盒通過對(duì)樣本中的恙蟲病東方體進(jìn)行定性檢測(cè)，可應(yīng)用于恙蟲病東方體感染的輔助診斷。
【專利說明】一種恙蟲病東方體核酸檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及恙蟲病東方體核酸檢測(cè)試劑盒，特別是涉及一種利用復(fù)合探針技術(shù)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)恙蟲病東方體的試劑盒。該試劑盒通過對(duì)樣本中的恙蟲病東方體進(jìn)行定性檢測(cè)，可應(yīng)用于含恙蟲病東方體感染的輔助診斷。
【背景技術(shù)】
[0002]恙蟲病東方體(Orientia tsutsugamushi)是由恙螨幼蟲盯咬傳播而引起恙蟲病的病原體，過去稱恙蟲病立克次體。以鼠類為主要傳染源，通過恙螨幼蟲叮咬而傳播。恙蟲病東方體呈圓形、橢圓型或短桿狀。革蘭染色陰性。吉姆薩染色呈紫紅色。在發(fā)熱期間，可從病人的焦痂、血液、淋巴結(jié)或骨髓等分離出病原體。恙蟲病立克次體有自然裂解傾向，不易保存。對(duì)熱及一般消毒方法都很敏感，對(duì)低溫的抵抗力較強(qiáng)。恙蟲病立克次體在不同地區(qū)、不同株間的抗原性有較大差異，對(duì)人的致病力也不相同。臨床上以發(fā)熱、焦痂或潰瘍、淋巴結(jié)腫大及皮疫為特征，易造成誤診。[Ruang-areerate T, Jeamwattanalert P,Rodkvamtookff, et al.Genotype divetsity and distribution of Orientia tsutsugamushi causingscrub typhus in Thai land[J].Journal of clinical microbiology，2011，49(7):2584-2589 ;Luksameetanasan R, Blacksell S D, Kalambaheti T, et al.Patient andsample-related factots that effect the success of in vitro isolation ofOrientia tsutsugamushi[J].2007.]。
[0003]為了有效地診斷和預(yù)防恙蟲病，國(guó)內(nèi)外對(duì)恙蟲病東方體的主要抗原分子進(jìn)行了深入研究。研究較多的是56kD、47kD、58kD、110kD和22kD等。58kD蛋白是菌體外膜蛋白，高度保守，各株共有，系恙蟲病東方 體屬特異性抗原，也是潛在性保護(hù)性抗原。56kD蛋白是菌體主要外膜蛋白，暴露在菌體表面，與立克次體的吸附和侵入有關(guān)。該抗原含有型特異性抗原決定族，也可產(chǎn)生特異型保護(hù)作用。22kD蛋白也含型特異性抗原表位。47kDa蛋白是恙蟲病東方體表面含量豐富的蛋白之一，具有較強(qiáng)的免疫原性。由于該蛋白為屬特異性，相對(duì)于型特異性的56kDa蛋白，其在用于診斷和預(yù)防不同型別恙蟲病東方體感染方面具有潛在的優(yōu)越性。[Seong S Y, Huh M S, Jang W J, et al.1nduction of homologous immuneresponse to Rickettsia tsutsugamushi Boryong with a partial56_ki lodaltonrecombinant antigen fused with the maltose-binding protein MBP-Bor56 [J].1nfection and immunity,1997,65 (4):1541-1545.； Jiang J, Chan T C, Temenak J J,et al.Development of a quantitative real-time polymerase chain reaction assayspecific for Orientia tsutsugamushi[R].NAVAL MEDICAL RESEARCH CENTER SILVERSPRING MD,2004.]。
[0004]臨床微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)恙蟲病東方體的檢測(cè)較為困難，主要原因包括:1)血清學(xué)診斷在發(fā)病一周內(nèi)很難檢測(cè)到抗體，而且病原分離操作復(fù)雜，且分離率十分低；2)病原學(xué)檢查耗時(shí)長(zhǎng)加之分離操作過程中存在隨時(shí)致人受染的危險(xiǎn)；3)Q熱臨床表現(xiàn)的多型以及多種并發(fā)癥的可能出現(xiàn)，給臨床診斷帶來一定的困難?，F(xiàn)將目前臨床上檢測(cè)恙蟲病東方體的主要方法分述如下:
[0005]1.血象白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少或正常。有其它并發(fā)癥時(shí)可增多，分類常呈中性粒細(xì)胞增多，核左移(桿狀中性粒細(xì)胞增多)。
[0006]2.病原學(xué)檢查取發(fā)熱期患者血液0.5~ImL,接種于小鼠腹腔內(nèi)。若小鼠于I~2周內(nèi)發(fā)病、死亡，則取其腹膜、腸系膜或脾臟剖面在載玻片上作印片，干后經(jīng)姬姆薩染色，再用顯微鏡油鏡檢查。在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可見紫紅色、成簇分布的恙蟲病東方體。
[0007]3.血清學(xué)檢查對(duì)本病的診斷有較大價(jià)值。常用有以下四種方法。
[0008](I)外斐反應(yīng)(變形桿菌0X19凝集試驗(yàn)):對(duì)變形桿菌OXK抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，而且效價(jià)在1: 160或以上，或早、晚期雙份血清效價(jià)呈4倍以上增長(zhǎng)者有診斷意義。
[0009](2)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn):應(yīng)用當(dāng)?shù)卮碇昕乖蚨鄡r(jià)抗原進(jìn)行檢測(cè)，特異度強(qiáng)，檢出率較聞。
[0010](3)間接免疫熒光試驗(yàn):檢測(cè)病人血清中的特異性IgM、IgG抗體。具有較高的敏感性、特異性和重現(xiàn)性，被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”。
[0011]3.分子診斷方法:簡(jiǎn)便快速，且高度敏感，解決了恙蟲病患者發(fā)病初期抗體滴度太低無法進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)的難題，是恙蟲病早期診斷有價(jià)值的方法。其中，實(shí)時(shí)熒光PCR法則是公認(rèn)的檢測(cè)細(xì)菌最準(zhǔn)確、最快捷的方法。目前也有數(shù)種基于PCR末端和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)被用于產(chǎn)KPC菌株的檢測(cè)，這些技術(shù)具有更高的特異性，但需要專業(yè)的技術(shù)人員和設(shè)備才能實(shí)施,檢測(cè)成本相對(duì)也較高。
[0012]本試驗(yàn)以恙蟲病東方體47KD基因?yàn)榘行蛄校瑧?yīng)用復(fù)合探針法建立了一種特異、靈敏、快速檢測(cè)恙蟲病東方體的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的在于提供一種實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)恙蟲病東方體核酸的試劑盒(下面簡(jiǎn)稱試劑盒)，該試劑盒包括:(I)樣本處理液A、樣本處理液B、PCR反應(yīng)液A、PCR反應(yīng)液B、陰性對(duì)照、強(qiáng)陽對(duì)照、弱陽性對(duì)照。(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
[0014]為了解決上述任務(wù)，本發(fā)明的具體技術(shù)路線為:
[0015](I)針對(duì)恙蟲病東方體基因保守序列設(shè)計(jì)的能夠與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探針。
[0016](2)寡核苷酸探針標(biāo)記熒光發(fā)生基團(tuán)，使所說的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多聚核苷酸間接結(jié)合。
[0017](3)適宜于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和熒光檢測(cè)體系。核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系包括耐熱DNA聚合酶、2’ -脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針、含有鎂離子和甲酰胺的緩沖液。
[0018](4)從待測(cè)樣本中提取DNA，加入前述的反應(yīng)體系中，直接經(jīng)PCR擴(kuò)增，從熒光擴(kuò)增曲線判斷是否存在恙蟲病東方體。
[0019]根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中試劑盒的PCR反應(yīng)液由10XPCR緩沖液、靶基因正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、滅菌水組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向和反向引物分別是5’ -AACTGATTTTATTCAAACTAATGCT-3’和5’ -AGCAAAACTTATGCCTGAGTAA-3’ ；用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測(cè)體系的寡核苷酸探針是f:FAM-TGGTCCAGTTAACCAAAATGCTCTT-P, q:GATTAAACATCGGTCCACCAAA-dabcyI ；PCR 反應(yīng)酶系包含Taq酶和UNG酶。
[0020]根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，陰性質(zhì)控品為滅菌水；陽性質(zhì)控品為通過體外重組將目的片段基因?qū)隩載體，構(gòu)建并提取重組質(zhì)粒DNA，用TE液稀釋-20C保存。用于實(shí)際檢測(cè)中的質(zhì)量控制。
[0021]根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)恙蟲病東方體進(jìn)行檢測(cè)，該方法包括下列步驟:
[0022](1)用樣本處理液進(jìn)行陰、陽性質(zhì)控品和待測(cè)樣本的DNA提取。樣本處理液除本發(fā)明提及的方法外，還可以使用其它成熟的DNA提取方法和試劑盒。
[0023](2)將提取的DNA加入到含有PCR反應(yīng)液和PCR反應(yīng)酶系的PCR反應(yīng)管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。
[0024]本發(fā)明所述的試劑盒針對(duì)恙蟲病東方體檢測(cè)中的特殊性，對(duì)反應(yīng)體系中引物探針濃度、Taq酶的用量、退火溫度等均進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合熒光PCR技術(shù)，用于恙蟲病東方體核酸檢測(cè)，并研制出用于恙蟲病東方體核酸檢測(cè)試劑盒，靈敏度可達(dá)到IO2拷貝/ ml。
[0025]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點(diǎn):
[0026](I)采用的復(fù)合探針技術(shù)為國(guó)內(nèi)唯一實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(專利號(hào):ZL99125469.4，相關(guān)論文發(fā)表于Anal Biochem, 2002, 309:206-211)，是具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)產(chǎn)品。特異性更
強(qiáng)，靈敏度更高；
[0027](2)全封閉反應(yīng)，提取細(xì)菌DNA后，直接用于PCR檢測(cè)，避免了污染發(fā)生；
[0028](3)檢測(cè)速度快，整個(gè)過程不超過2小時(shí)；
[0029](4)操作簡(jiǎn)單，可控性強(qiáng)，可進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)，有利于產(chǎn)業(yè)化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1顯示試劑盒檢測(cè)恙蟲病東方體核酸的條件設(shè)置。
[0031]圖2顯示試劑盒檢測(cè)恙蟲病東方體核酸時(shí)不同濃度樣本的擴(kuò)增曲線，二個(gè)陽性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線為S形，均能夠判定為陽性。
[0032]圖3顯示試劑盒十個(gè)陰性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，均不具S形特征，能夠判定為陰性。
[0033]圖4顯示強(qiáng)陽性對(duì)照和弱陽性對(duì)照的擴(kuò)增曲線。圖示擴(kuò)增曲線為S型曲線，說明檢測(cè)體系有效擴(kuò)增了恙蟲病東方體核酸。
[0034]圖5顯示陰性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。圖示擴(kuò)增曲線較平為直的折線，與熒光檢測(cè)閾值線沒有交點(diǎn)，且曲線不呈S型，說明檢測(cè)過程中沒有恙蟲病東方體核酸的污染。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。
[0036]恙蟲病東方體核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法
[0037]1.樣品的采集
[0038]a)采集血清:取受檢者靜脈血2ml，收集于無菌離心管中，室溫放置不超過4小時(shí)，3000rpm離心20分鐘，吸取血清轉(zhuǎn)入另一無菌離心管中備用；[0039]b)采集血漿:去受檢者靜脈血2ml于含有抗凝劑的無菌離心管中(禁止使用肝素抗凝)，室溫放置不超過4小時(shí)，3000rpm離心20分鐘,分離血衆(zhòng),轉(zhuǎn)入無菌離心管備用。
[0040]2.核酸提取
[0041]2.1核酸提取
[0042]a)用帶濾芯吸嘴吸取100 μ I樣品處理液A至離心管中。
[0043]b)加入100 μ I待測(cè)樣本。
[0044]c)蓋上管蓋，震蕩混勻，I, 3000rpm離心10分鐘。
[0045]d)吸棄175 μ I上清(避免攪動(dòng)或碰到沉淀)。
[0046]e)加入25 μ I樣品處理液B。
[0047]f)充分震蕩混勻，低速(2000rpm)離心數(shù)秒后，100°C干浴或沸水浴10分鐘。
[0048]g) I, 3000rpm離心10分鐘，取上清為PCR反應(yīng)模板(上清如不立即使用，需置_20°C保存，重新使用時(shí)需1，3000rpm離心10分鐘)。
[0049]3.PCR 檢測(cè)
[0050]3.1配制體系
[0051]a)取一支0.5ml離心管，按下列組成配制PCR反應(yīng)液(N為反應(yīng)管數(shù)):`[0052]PCR 反應(yīng)液 A26 μ I X (Ν+1)
[0053]PCR 反應(yīng)液 BI μ I X (N+i)
[0054]按27.0 μ I /管分裝至PCR反應(yīng)管中。
[0055](注意:使用前確保PCR反應(yīng)液充分溶解，PCR反應(yīng)液B在使用前需離心以確保所有酶集中在底部)
[0056]b)加樣
[0057]將3μ I處理過的樣本上清液分別加入PCR反應(yīng)管中蓋緊管蓋，6000rpm離心Imin后放入PCR擴(kuò)增儀。
[0058]擴(kuò)增程序設(shè)置
[0059]Bio-Rad、ABI7300 / 7500PCR擴(kuò)增儀的參數(shù)設(shè)置如下
【權(quán)利要求】
1.一種實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)恙蟲病東方體核酸的試劑盒(下面簡(jiǎn)稱試劑盒)，該試劑盒包括:(I)樣本處理液A、樣本處理液B、PCR反應(yīng)液A、PCR反應(yīng)液B、陰性對(duì)照、強(qiáng)陽性對(duì)照、弱陽性對(duì)照；(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其中試劑盒的PCR反應(yīng)液由IOXPCR緩沖液、靶基因的正向引物、反向引物、寡核苷酸探針和滅菌水組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向和反向引物分別是5’ -AACTGATTTTATTCAAACTAATGCT-3’和5’ -AGCAAAACTTATGCCTGAGTAA-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增的寡核苷酸探針是5’-FAM-TGGTCCAGTTAACCAAAATGCTCTT-P-3’ 和 5’ -GATTAAACATCGGTCCACCAAA-dabcyl-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR反應(yīng)酶系包含Taq酶和UNG酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于陰性質(zhì)控品為滅菌水；陽性質(zhì)控品為通過體外重組將目 的片段基因?qū)隤GEM-T載體，構(gòu)建并提取重組質(zhì)粒DNA。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103866013SQ201410079165
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】王升啟, 陳蘇紅, 羅琳, 劉志紅, 孫曉彥, 郝寶平, 王立軍, 喬平, 劉琦琪 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所, 邢臺(tái)縣醫(yī)院