一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發(fā)酵方法，包括如下步驟：將惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)菌體接種于固體培養(yǎng)基，活化后挑取菌苔在搖床中發(fā)酵制備腈水合酶，經(jīng)光照、溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速200r·min-1，培養(yǎng)96h后得到具有腈水合酶活力的發(fā)酵液。本發(fā)明的光敏性腈水合酶惡臭假單胞菌菌種，經(jīng)傳統(tǒng)發(fā)酵、水合催化合成丙烯酰胺，利用本發(fā)明菌株合成的丙烯酰胺水合產(chǎn)物濃度高，減少了濃縮的負(fù)擔(dān)，且無副產(chǎn)物，產(chǎn)品純度高，適合工業(yè)化生產(chǎn)丙烯酰胺。
【專利說明】一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于工業(yè)微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丙烯酰胺是一種用途廣泛的有機化工原料，以它為單體合成的產(chǎn)品不下百種，其中以聚丙烯酰胺用途最廣。聚丙烯酰胺的主要用途是用于油田調(diào)整吸水剖面和“三次采油”中，近年來，為適應(yīng)我國原油“三次采油”對超高分子量聚丙烯酰胺(相對分子質(zhì)量> 2000萬)的需求，丙烯酰胺的生產(chǎn)將有較大的發(fā)展。
[0003]丙烯酰胺是以丙烯腈為原料水合而成，從20世紀(jì)50年代至今，生產(chǎn)工藝先后經(jīng)歷了硫酸水合、銅系催化的化學(xué)水合及微生物腈水合酶生物轉(zhuǎn)化3個發(fā)展階段。1973年，法國研究者Galzy及其研究組發(fā)現(xiàn)了一種能催化丙烯腈水合停留在丙烯酰胺的微生物BrevbacteriumR312,從而開始了用微生物生產(chǎn)丙烯酰胺的研究。1985年，日本日東公司建成了世界上第一個微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的工業(yè)性裝置。上海農(nóng)藥所也在1986年從泰山的土壤中找到了一株產(chǎn)腈水合酶的菌株，并開始了微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的研究。腈水合酶是一種可以把腈化合物的腈基進行水合后轉(zhuǎn)變?yōu)轷０坊?，制造對?yīng)的酰胺化合物的微生物的酶，腈水合酶作為催化劑催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的方法正成為主流。與銅系催化法相比，微生物法有許多優(yōu)點:酶催化反應(yīng)在常溫、常壓下進行，提高了生產(chǎn)安全性；丙烯腈的轉(zhuǎn)化率接近100%，不需回收未反應(yīng)原料；由于省去了銅分離工段，產(chǎn)品中不含銅離子，產(chǎn)品純度高，特別適合生產(chǎn)超高分子量的聚丙烯酰胺；工藝過程簡單，設(shè)備投資少，生產(chǎn)經(jīng)濟效益高。微生物法催化生產(chǎn)丙烯酰胺是石油化工骨干產(chǎn)品利用酶催化技術(shù)成功的第一范例，具有劃時代的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發(fā)酵方法，本發(fā)明的光敏性腈水合酶菌株是一種惡臭假單胞菌，經(jīng)傳統(tǒng)發(fā)酵、催化合成丙烯酰胺，利用本發(fā)明菌株合成的丙烯酰胺水合產(chǎn)物濃度高，減少了濃縮的負(fù)擔(dān)，無副產(chǎn)物，產(chǎn)品純度高，適合工業(yè)化生產(chǎn)丙烯酰胺。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發(fā)酵方法。
[0006]一:催化劑制備
菌體發(fā)酵培養(yǎng):將惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)菌體接種于固體培養(yǎng)基,活化后挑取菌苔在搖床中發(fā)酵制備腈水合酶，經(jīng)光照、溫度為30°C,搖床轉(zhuǎn)速200r.mirT1,培養(yǎng)96h后得到具有腈水合酶活力的發(fā)酵液，且發(fā)酵液的總酶活達800~1200萬單位/毫升發(fā)酵液；
固體培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1%、酵母浸膏0.36%、K2HPO4.3Η200.2 %、NaCl 0.1%, MgSO4?7H20 0.015%，瓊脂2%、余量為脫鹽水；
發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I~3%，酵母浸膏0.5~1%，谷氨酸0.05~0.1%，尿素
0.5 ~1%，K2HPO4.3Η200.03 ~0.1%，KH2PO40.03 ~0.1%，MgSO4.7Η20 0.03 ~0.1%，F(xiàn)e3+
0.0001~0.003%, pH值7.5~8.5，余量為脫鹽水；上述百分比為質(zhì)量百分比。
[0007]上述發(fā)酵過程中添加的Fe3+為FeCl3、Fe2 (SO4) 3、Fe (NO)3中的任意一種。
[0008]上述所述光照條件為培養(yǎng)階段可見光照射發(fā)酵液。
[0009]催化劑懸浮液制備:將發(fā)酵液在分離因素> 3000離心分離，去上清液，將細(xì)胞懸浮于脫鹽水中，配成 菌體細(xì)胞與脫鹽水體積比為1:100~1:200的催化劑懸浮液備用。
[0010]含有光敏性腈水合酶菌株催化合成丙烯酰胺的方法包括如下步驟:向催化劑懸浮液中緩慢加入丙烯腈，常壓，溫度為30°c，200r.mirT1的攪拌速度下進行酶催化水合反應(yīng)，丙烯腈的添加量占反應(yīng)體系的20~30% (wt)，經(jīng)過一段時間的反應(yīng)，獲得丙烯酰胺溶液；
本發(fā)明所具有的有益效果是:通過在傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Fe3+，并在發(fā)酵過程中采用可見光照射發(fā)酵液的方法，產(chǎn)生含有腈水合酶的惡臭假單胞菌菌株或其誘變菌株細(xì)胞，并將該細(xì)胞從培養(yǎng)液中分離制成催化劑懸浮液，催化丙烯腈水合成丙烯酰胺水溶液，丙烯腈的轉(zhuǎn)化率可達99.99%，所獲得的丙烯酰胺水溶液經(jīng)過納濾、離子交換等工序，即可獲得高純度的丙烯酰胺水溶液。本發(fā)明通過在發(fā)酵過程中采用光照條件，并在培養(yǎng)基中加入Fe3+，顯著提高了腈水合酶的酶活性，將酶活性提高50%以上的同時使發(fā)酵的培養(yǎng)周期大大縮短了。利用本發(fā)明菌株及催化方法合成的丙烯酰胺水合產(chǎn)物濃度高，減少了濃縮的負(fù)擔(dān)，且無副產(chǎn)物，產(chǎn)品純度高，適合工業(yè)化生產(chǎn)丙烯酰胺。
[0011]本發(fā)明中菌株、Fe3+、光照條件互相協(xié)調(diào)作用才能高效生產(chǎn)含有腈水合酶的惡臭假單胞菌菌株或其誘變菌株細(xì)胞，進而催化丙烯腈水合成丙烯酰胺。本發(fā)明使用的惡臭假單胞菌菌株及其誘變菌株產(chǎn)生的腈水合酶可將丙烯腈高效轉(zhuǎn)化成丙烯酰胺，其操作過程簡單、反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境污染小、分離提純簡單、丙烯腈轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品純度高。
[0012]【具體實施方式】:
實施例1:
(I)、催化劑懸浮液的制取:按前述方法制備催化劑，得含腈水合酶菌株的發(fā)酵液。
[0013]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖1.5%，酵母浸膏0.5%，谷氨酸0.07%,尿素0.7%，K2HPO4.3Η200.05%, KH2PO40.05%, MgSO4.7Η20 0.05%，F(xiàn)e3+ 0.001%, pH 值 8，余量為脫鹽水；上述百分比為質(zhì)量百分比。
[0014]通過稱量法測定菌株生物量。取IOmL發(fā)酵液，在分離因素為3000，離心分離，去上清液，用蒸餾水洗滌三次后，將獲得的細(xì)胞置于紅外干燥箱內(nèi)，105°C干燥至恒重，取出放入干燥器內(nèi)，冷卻后稱量。由上述方法測得的產(chǎn)酶能力為25.3毫克/毫升發(fā)酵液。
[0015]采用高壓液相色譜法(HPLC)分析丙烯腈及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物丙烯酰胺，配制兩者的混合溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過外標(biāo)法定量，測定反應(yīng)液中腈水合酶活力.由上述方法測得的腈水合酶活力為950u/mL。
[0016]按前述方法制備催化劑懸浮液備用。
[0017](2)、按前述方法催化丙烯腈合成丙烯酰胺，丙烯腈的添加量占反應(yīng)體系的20%(wt)，經(jīng)過一段時間的反應(yīng)，獲得濃度為26.75%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈轉(zhuǎn)化率99.81%。
[0018]實施例2:(I)、催化劑懸浮液的制取:按前述方法制備催化劑，得含腈水合酶菌株的發(fā)酵液。
[0019]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖2%，酵母浸膏0.5%，谷氨酸0.075%,尿素0.7%，K2HPO4.3Η200.05%, KH2PO40.05%, MgSO4.7Η20 0.05%, Fe3+ 0.0015%, pH 值 8.4，余量為脫鹽水；上述百分比為質(zhì)量百分比。
[0020]通過上述稱量法測定菌株生物量為29.6暈克/毫升發(fā)酵液。
[0021]采用高壓液相色譜法測得的腈水合酶活力為1207u/mL。
[0022]按前述方法制備催化劑懸浮液備用。
[0023](2)、按前述方法催化丙烯腈合成丙烯酰胺，丙烯腈的添加量占反應(yīng)體系的25%(wt),經(jīng)過一段時間的反應(yīng)，獲得濃度為33.5%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈轉(zhuǎn)化率99.99%。
[0024]實施例3:
(1)、催化劑懸浮液的制取:按前述方法制備催化劑，得含腈水合酶菌株的發(fā)酵液。
[0025]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖2%，酵母浸膏0.6%，谷氨酸0.075%,尿素0.75%，K2HPO4.3Η200.05%, KH2PO40.05%, MgSO4.7Η20 0.05%, Fe3+ 0.003%, pH 值 8.4，余量為脫鹽水；上述百分比為質(zhì)量百分比。
[0026]通過上述稱量法測定菌株生物量為30.5暈克/毫升發(fā)酵液。
[0027]采用高壓液相色譜法測得的腈水合酶活力為1000u/mL。
[0028]按前述方法制備催化劑懸浮液備用。
[0029](2)、按前述方法催化丙烯腈合成丙烯酰胺，丙烯腈的添加量占反應(yīng)體系的30%(wt)，經(jīng)過一段時間的反應(yīng)，獲得濃度為40.17%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈轉(zhuǎn)化率99.93%。
[0030]實施例4:
本實施例在發(fā)酵過程中未加入Fe3+，也沒有光照條件，以和上述實施例3進行對比。
[0031](I)、催化劑懸浮液的制取:菌體發(fā)酵培養(yǎng):將惡臭假單胞菌體接種于固體培養(yǎng)基，活化后挑取菌苔在搖床中發(fā)酵制備腈水合酶，溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速200r.mirT1，培養(yǎng)96h后得到具有腈水合酶活力的發(fā)酵液。
[0032]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖2%，酵母浸膏0.5%，谷氨酸0.075%,尿素0.7%，K2HPO4.3Η200.05%，KH2PO40.05%，MgSO4.7Η20 0.05%, pH 值 8.4，余量為脫鹽水；上述百分比
為質(zhì)量百分比。
[0033]通過上述稱量法測定菌株生物量為13.7暈克/毫升發(fā)酵液。
[0034]采用高壓液相色譜法測得的腈水合酶活力為289u/mL。
[0035]按前述方法制備催化劑懸浮液備用。
[0036](2)、按前述方法催化丙烯腈合成丙烯酰胺，丙烯腈的添加量占反應(yīng)體系的30%(wt)，經(jīng)過一段時間的反應(yīng)，獲得濃度為8.2%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈轉(zhuǎn)化率20.4%.。
[0037]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下特點:
現(xiàn)有技術(shù)用于催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的菌株主要有紅球菌屬、棒桿菌及其經(jīng)誘變的菌種。本發(fā)明的菌種屬于假單胞菌屬。該菌株在發(fā)酵過程中加入Fe3+，并采用光照的條件時，使該菌種產(chǎn)酶能力大幅度提高，生物量最高達30mg/ml發(fā)酵液，而且其單位體積發(fā)酵液的總酶活可達1200萬單位/毫升發(fā)酵液。
【權(quán)利要求】
1.一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發(fā)酵方法，其特征在于:菌體發(fā)酵培養(yǎng):將惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)菌體接種于固體培養(yǎng)基,活化后挑取菌苔在搖床中發(fā)酵制備腈水合酶，經(jīng)光照、溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速200r.mirT1，培養(yǎng)96h后得到具有腈水合酶活力的發(fā)酵液，且發(fā)酵液的總酶活達800~1200萬單位/毫升發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I~3%，酵母浸膏0.5~1%，谷氨酸0.05~0.1%，尿素0.5~1%，K2HPO4.3Η200.03 ~0.1%，KH2PO40.03 ~0.1%，MgSO4.7Η20 0.03 ~0.1%，F(xiàn)e3+ 0.0001 ~0.003%, pH值7.5~8.5，余量為脫鹽水；上述百分比為質(zhì)量百分比。
2.權(quán)利要求1所述的催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發(fā)酵方法，其特征在于:菌體發(fā)酵培養(yǎng)中培養(yǎng)階段要有可見光照射發(fā)酵液。
3.權(quán)利要求1所述的催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發(fā)酵方法，其特征在于:所述的Fe3+為FeCl 3' Fe2 (SO4) 3、Fe (NO) 3中的任意一種。
【文檔編號】C12P13/02GK103834600SQ201410096647
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】孫安順 申請人:蔡建華