一種納米材料整體柱固載酶生物微反應器的制備及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種納米材料整體柱固載酶生物微反應器的制備及應用。該方法首先由功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑以及引發(fā)劑的混合溶液在柱內通過原位熱引發(fā)或光引發(fā)聚合制備多孔有機聚合物整體柱，經功能化修飾后鍵合納米材料，得到納米材料整體柱。再以納米材料為中間配體，實現(xiàn)酶在整體柱上的固定化，制備的納米材料整體柱固載酶生物微反應器。該生物微反應器成功地應用于蛋白質組學分析、藥物手性拆分和催化酯交換反應中。本發(fā)明具有以下優(yōu)點：制備方法簡單，酶的固載量大，催化活性高，酶解速率快、效率高，使用壽命長，可重復使用。
【專利說明】一種納米材料整體柱固載酶生物微反應器的制備及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及整體柱固載酶生物微反應器的制備及其應用，具體是一種基于納米材 料為中間配體的多孔有機聚合物整體柱固載酶生物微反應器的制備方法，并研究其在蛋白 質組學分析、藥物手性拆分和催化酯交換反應中的應用。

【背景技術】
[0002] 酶固定化技術是一門交叉學科技術。固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催 化反應特性的同時，又具有更高的酶/底物比和酶解效率、更快的酶解速率、可連續(xù)使用并 能減少酶的自身降解和交叉感染等優(yōu)點；且酶解反應可控，酶與產物易于分開，產物容易提 純，反應所需的空間小，可以實現(xiàn)和分離鑒定系統(tǒng)的聯(lián)用。固定化酶的性能主要取決于固定 化方法和所使用的載體材料，二者能直接影響固定化酶的催化活性。然而目前國內外報道 的固定化載體和方法均有一定的局限性，如二氧化娃、人工合成微粒、介孔分子篩、大孔樹 脂和合成纖維等載體對酶的固載量較低，且傳質速度慢，不利于快速高效的進行酶催化反 應。而常規(guī)的酶固定化方法，如包埋法、交聯(lián)法、共價結合、離子結合和物理吸附等均具有一 定的缺陷。例如，離子結合法和物理吸附法制備簡單、活力回收率高、載體可以再生，然而酶 的固定化程度較弱，催化過程中酶容易脫落。共價結合法、交聯(lián)法和包埋法對酶的固定化程 度強，然而制備較難、活力回收率低、載體不能再生。因此，目前迫切需要開發(fā)酶固定化載體 和固定化方法，增強酶的催化活性，增大使用壽命和可再生性，提高酶解反應的反應速率和 效率。
[0003] 有機高聚物整體柱具有制備簡單、滲透性好、背壓低、傳質速度快、易于改性和化 學穩(wěn)定性高等優(yōu)點，可以為酶和底物提供快速的對流傳質性能，因而是固定化酶的理想載 體之一。例如Krenkova和 Urban等人（Anal. Chem. 2009,81，2004-2012 ;Biotechnology and Bioengineering, 2012,109,371-380)分別應用環(huán)氧基團或Π 丫內酯基團與酶的氨基反應，通 過共價法在整體柱上固載酶，分別用于蛋白質組學分析和催化酯交換反應。Spross (Anal. Chem. 2010,82,1434-1443)則利用戊二醛交聯(lián)法在整體柱上固載酶，用于蛋白質消化。Ma， Wu 和 Zhang 等人（Proteomics 2011，11，991-995 J.Chromatogr. A 2012,1256,136-143; Anal. Bioanal. Chem. 2012,402, 703-710)分別通過金屬離子螯合和離子鍵固載酶，酶解蛋 白質，進行蛋白質組學分析。整體柱固載酶生物微反應器雖然能為酶和底物提供良好的對 流傳質性能，提高酶解反應速率，但是使用過程中仍然存在兩個問題，一是整體柱由于具有 連續(xù)的貫穿大孔，其比表面積較小，因此酶固載量較低。二是傳統(tǒng)的整體柱固載酶方法，如 共價法和離子交換法等存在一定的弊端，不利于提高酶的穩(wěn)定性和使用壽命。
[0004] 納米材料由于其獨特的尺寸和物理性質，比如具有小粒徑效應、表面效應及界面 效應等，具有比表面積大等諸多優(yōu)點。作為載體用于酶的固定化，有利于保持酶的活性和穩(wěn) 定性，大大提高酶的固載量和催化效率。本專利中將納米材料和整體柱相結合，首先對整體 柱聚合物進行功能化修飾，鍵合納米材料；再以納米材料為中間配體，通過開發(fā)納米材料與 酶的親和超分子識別作用實現(xiàn)酶的固定化，合成納米材料整體柱固定化酶生物微反應器。 有機聚合物整體柱化學穩(wěn)定性高，通透性好，能為酶和底物提供快速的對流傳質性能。納米 材料巨大的比表面積與體積比，有利于大大提高酶的固載量；親和作用力強，能防止酶從載 體上的脫落；且反應條件溫和，可以保持酶的三維結構和生物活性。將二者有機結合，一方 面可以解決傳統(tǒng)固載酶生物微反應器傳質速率慢、固載量低和催化效率低等問題，大大提 高固載酶的穩(wěn)定性、使用壽命、催化速率和效率；另一方面親和超分子作用力可逆，酶在多 次使用失活后可洗脫，重新鍵合新酶，固載酶反應器可再生，大大降低了成本，為固載酶生 物微反應器的制備提供新方法。


【發(fā)明內容】
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[0005] 本發(fā)明的目的之一是研究一種納米材料整體柱固載酶微生物微反應器，通過將納 米材料和整體柱二者有機結合，解決傳統(tǒng)固載酶生物微反應器傳質速率慢、酶固載量低、催 化效率低和使用壽命差等問題，從而獲得催化速率快、效率高的可再生固載酶生物微反應 器。
[0006] 本發(fā)明的目的之二是研究納米材料整體柱固載酶生物微反應器在催化酯交換反 應、藥物手性拆分和蛋白質組學分析中的應用，實現(xiàn)酶催化反應的快速、高效進行。
[0007] 本發(fā)明借由以下技術方案措施實現(xiàn)：在功能化修飾的有機聚合物毛細管整體柱孔 表面鍵合一層排列規(guī)則、致密、連續(xù)、不同粒徑的高密度納米材料，以納米材料為中間配體， 將酶固定到整體柱上，從而獲得納米材料整體柱固載酶生物微反應器。
[0008] -種納米材料整體柱固載酶生物微反應器的制備，包括：步驟A，制備納米材料； 步驟B，有機聚合物整體柱的合成：由功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑的混合溶液，通過 原位熱引發(fā)或光引發(fā)合成多孔有機聚合物整體柱；步驟C，合成納米材料整體柱：對整體柱 進行功能化修飾，引入高密度的特異性功能基團，通過功能基團與納米材料的特異性親和 作用，在整體柱的孔表面上鍵合納米材料；步驟D，固載酶生物微反應器的制備：以納米材 料為中間配體，通過納米材料與酶的特異性親和作用，在整體柱上實現(xiàn)目標酶的固定化，設 計制備納米材料固載酶生物微反應器。
[0009] 步驟A中合成的納米材料包括納米金、納米銀、納米二氧化娃、足球烯C6(l、碳納米 管、石墨烯、磁性四氧化三鐵、金屬-有機框架材料M0F或共價有機骨架C0F。納米材料膠體 為球形，粒徑在5?100nm。
[0010] 步驟B中合成整體柱所用的功能單體包括甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸 甲酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸月桂酯、丙烯酸、丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、甲基 丙烯酸丙炔基酯、縮水甘油基炔丙基醚、2-乙烯基-4,4-二甲基-2-惡唑啉-5-酮、2-甲 基-2-丙烯酸_2, 3-二羥基丙酯、苯乙烯、或4-乙烯基吡啶。交聯(lián)劑包括乙二醇二甲基丙 烯酸酯、三烯丙基異三聚氰酸酯、二乙烯基苯、Ν，Ν' -亞甲基雙丙烯酰胺等。致孔劑包括甲 苯、正庚烷、環(huán)己醇、十二醇、正丙醇、1，4_ 丁二醇、或不同分子量的聚乙二醇。引發(fā)劑包括偶 氮二異丁臆、偶氮二異庚臆、2, 2-二甲氧基_2_苯基苯乙酮、或2-輕基-2-甲基-1-苯基丙 酮。5?30% (w/w)功能單體、5?30% (w/w)交聯(lián)劑、30?80% (w/w)致孔劑，并且功能 單體、交聯(lián)劑和致孔劑的質量總和為100%。另外加入是功能單體和交聯(lián)劑質量的〇. 2? 5%的引發(fā)劑，熱引發(fā)反應溫度為45?851：，反應時間6?4811。光引發(fā)波長為25411111或 365nm，光強為6-30mw/cm 2,光照時間為5_60min。整體柱在不銹鋼色譜柱（內徑3_6mm，長 度6_30cm)、毛細管（內徑50-600 μ m，長度5_50cm)、聚丙烯基槍頭（體積0· 01-10mL)、聚 丙烯基注射器（體積〇. Ι-lOmL)、高硼硅玻璃板或硅晶片中合成。
[0011] 步驟C中通過對多孔有機聚合物整體柱進行表面功能化修飾，鍵合一層排列規(guī) 貝1J、致密、連續(xù)的高密度納米材料。
[0012] 步驟D中所用的酶溶液是用pH 6. 5?8. 0的磷酸緩沖溶液配制，其濃度為5? 50mg/mL〇 【專利附圖】

【附圖說明】 圖1不同粒徑的納米金顆粒的透射電子顯微鏡（TEM)圖。（a)15nm，（b)17nm，（c)30nm, (d) 40nm，(e) 50nm。 圖2磁性四氧化三鐵（Fe304)納米微球的透射電子顯微鏡圖。 圖3 Fe304@Si02核-殼結構納米微球的透射電子顯微鏡圖。 圖4 Poly(GMA-co-EDMA)毛細管整體柱截面的掃描電子顯微鏡（SEM)圖。 圖5 Poly(MS-co-CMS-co-DVB)毛細管整體柱截面的掃描電子顯微鏡（SEM)圖。 圖6基于聚丙烯注射器的聚合物整體柱截面的掃描電子顯微鏡（SEM)圖 (poly (GMA-c〇-EDMA) (a), poly (BMA-c〇-EDMA) (b), poly (LMA-c〇-EDMA) (c)) 〇 圖7鍵合15nm納米金的p〇ly(GMA-C〇-EDMA)毛細管整體柱截面的掃描電子顯微鏡 (SEM)圖。 圖8 37°C下游離酶與固定化酶對細胞色素 C酶解的高效液相色譜（HPLC)對比圖。（1) 細胞色素 C，（2)納米金整體柱固定化酶催化1.6min，（3)游離酶催化24h。 圖9納米金整體柱固定化酶對細胞色素 C進行酶解的多肽片段的MALDI-T0D-MS圖。 圖10 37°C下游離酶與固定化酶對牛血清白蛋白（BSA)酶解的高效液相色譜（HPLC)對 比圖。（1)牛血清白蛋白（BSA)，（2)納米金整體柱固定化酶催化1.6min，（3)游離酶催化 24h。 圖11納米金整體柱固定化酶對牛血清白蛋白（BSA)進行酶解的多肽片段的 MALDI-T0D-MS 圖。 【具體實施方式】 下面將結合實施例來詳細說明本發(fā)明，這些實例僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明 的應用范圍。 實施例 實施例1 :納米金的合成 (1)不同粒徑的納米金的合成 向2000mL的錐形瓶中加入50mg的氯金酸，500mL的超純水，磁力攪拌下加熱至98°C, 再加入一定量的檸檬酸鈉，維持溫度在98°C下反應，反應液顏色幾秒內變藍繼而變黑，再變 為紅色，繼續(xù)加熱l〇min后停止加熱，繼續(xù)攪拌0. 5h，制備得到納米金膠體溶液，室溫冷卻 后高速離心純化，保存?zhèn)溆?。通過改變檸檬酸鈉的用量改變合成的納米金的粒徑大小，如表 1所示。利用透射電子顯微鏡（TEM)研究合成的納米金膠體的粒徑大小和形貌（圖1)。 實施例2 :Fe304@Si02-NH2磁性納米顆粒的合成 (1) 溶劑熱法合成磁性Fe304納米顆粒 將 FeCl3. 6H20(1.35g，5mmol)和 NaAc(3. 6g)溶解在乙二醇（50mL)中，超聲 30min 使固 體充分溶解分散，將分散液轉移到帶聚四氟乙烯內襯的不銹鋼高壓釜中密封，200°C下反應 8h，反應結束后自然冷卻，借助磁鐵用無水乙醇和水交替洗4次，60°C真空干燥6h得到磁性 Fe304納米顆粒，其透射電子顯微鏡照片如圖2所示。 (2) Fe304@Si02核-殼結構納米顆粒的合成 將（1)中制備的磁性Fe304納米顆粒350mg分散在160mL的乙醇中，超聲處理0. 5h。依 次加入lmL氨水（25wt% )、40mL H20和lmL正娃酸乙酯，室溫下機械攪拌6h，借助磁鐵用 50mL乙醇清洗3次，得到Fe30 4@Si02核-殼結構的磁性納米顆粒，其透射電子顯微鏡照片如 圖3所示。 ⑶Fe304@Si02-NH2磁性納米顆粒的合成 將Fe304@Si02核-殼結構納米顆粒分散在60mL異丙醇中，將lmL 3-氨丙基三乙氧基硅 烷滴加到分散液中，室溫下機械攪拌24h，借助磁鐵用無水乙醇洗4-5次，50°C真空干燥6h 得到Fe304@Si02-NH2磁性納米顆粒。 實施例3 :金屬有機框架材料MIL-101的合成 利用水熱法合成MIL-101，具體的步驟如下：稱取2. 0g的Cr (N03) 3. 6H20溶于25mL去 離子水，充分溶解后加入〇. 83g對苯二甲酸，再加入410 μ L氫氟酸。然后將混合溶液移入 100mL的帶有聚四氟乙烯內襯的不銹鋼高壓反應釜中，放置于220°C的烘箱中反應8h。冷 卻后將產物過濾、洗滌，60°C下抽空干燥，即得到綠色粉末和白色針狀晶體的混合物。產物 依次利用Ν，Ν' -二甲基甲酰胺、三氯甲烷和無水乙醇，以除去白色針狀晶體和堵塞在孔道 內的未反應的無機和有機雜質，得到粒徑約為500nm的MIL-101。利用BET法測定MIL-101 的比表面積，為3000m 2/g。 實施例4 :有機聚合物整體柱在毛細管中的合成 (1) 毛細管內壁的活化 將內徑為1〇〇 μ m、外徑為365 μ m的石英毛細管，其內壁首先依次采用丙酮和水清洗， 再利用2M NaOH在120°C下活化3h。毛細管內壁利用水洗至中性后，再利用0. 25M的鹽酸 在室溫下活化0. 5h，用水洗至中性，之后用丙酮清洗，氮氣吹干，放置在120°C的真空干燥 箱里干燥2h。 (2) 毛細管內壁鍵合雙鍵 將3-(三甲氧基甲硅烷基）丙基丙烯酸酯溶于無水甲苯中，濃度為20% (v/v)。利用 注射泵以〇. 5 μ L/min的流速將30 μ L的上述溶液連續(xù)泵入活化后的毛細管內反應。之后 用丙酮將毛細管內壁沖洗干凈，放置24h后使用。 (3) Poly(GMA-c〇-EDMA)毛細管整體柱的合成 將24% (wt% )的甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA)，16% (wt% )的乙二醇二甲基丙烯酸 酯（EDMA)，30% (wt% )的環(huán)己醇，30% (wt% )的十二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑的 質量）的引發(fā)劑的混合溶液超聲混勻，通氮氣5min后裝入內壁鍵合雙鍵的石英毛細管內， 通過原位熱引發(fā)或光引發(fā)合成毛細管整體柱。其中，熱引發(fā)采用偶氮二異丁腈（AIBN)為引 發(fā)劑，反應條件為在60°C下反應24h。光引發(fā)采用2,2_二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA) 為引發(fā)劑，光引發(fā)波長為365nm，光強為12mw/cm 2,光照時間為15min。反應完成后利用甲醇 沖洗毛細管柱2h，以除去柱內的致孔劑和未反應的物質，從而制得poly (GMA-co-EDMA)毛 細管整體柱。合成的整體柱截面的掃描電子顯微鏡（SEM)分析如圖4所示。 (4) Poly(BMA-c〇-EDMA)毛細管整體柱的合成 將24% (wt% )的甲基丙烯酸丁酯（BMA)，16% (wt% )的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，40% (wt% )的正丙醇，20% (wt% )的1，4_ 丁二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑 的質量）的引發(fā)劑的混合溶液超聲混勻，通氮氣5min后裝入內壁鍵合雙鍵的石英毛細管 內，按照（3)中的方法通過原位熱引發(fā)或光引發(fā)合成poly(BMA-co-EDMA)毛細管整體柱。 (5) Poly(LMA-c〇-EDMA)毛細管整體柱的合成 將24% (wt% )的甲基丙烯酸月桂酯（LMA)，16% (wt% )的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，40% (wt%)的正丙醇，20% (wt%)的1，4_ 丁二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑 的質量）的引發(fā)劑的混合溶液超聲混勻，通氮氣5min后裝入內壁鍵合雙鍵的石英毛細管 內，按照（3)中的方法通過原位熱引發(fā)或光引發(fā)合成poly(LMA-co-EDMA)毛細管整體柱。 (6) Poly (MS-co-CMS-co-DVB)毛細管整體柱的合成 將21% (wt% )的甲基苯乙烯（MS)，7% (wt% )的氯甲基苯乙烯（CMS)，12%二乙烯 基苯（DVB)，13% (wt%)的甲苯，47% (wt%)的月桂醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑的質 量）的偶氮二異丁腈（AIBN)引發(fā)劑的混合溶液超聲混勻，通氮氣5min后裝入內壁鍵合雙 鍵的石英毛細管內，按照（3)中的方法通過原位熱引發(fā)合成poly (MS-co-CMS-co-DVB)毛細 管整體柱。合成的整體柱截面的掃描電子顯微鏡（SEM)分析如圖5所示。 實施例5 :有機聚合物整體柱在聚丙烯注射器中的合成 (1) 聚丙烯注射器內壁鍵合雙鍵 將內徑為5. 6mm、長度為5. 5cm的聚丙烯注射器，其內壁首先依次采用乙醇和丙酮清 洗，氮氣吹干后，加入〇. 5mL濃度為5wt%的脫氧苯甲酮的甲醇溶液，UV 365nm下光照3min， 光強為20mw/cm2。采用甲醇徹底清洗后，利用氮氣吹干，再加入0. 5mL濃度為15wt%的二 甲基丙烯酸乙二醇酯的甲醇溶液，UV 365nm下光照3min，光強為20mw/cm2。最后利用甲醇 徹底清洗注射器內壁，采用氮氣吹干。 (2) P〇ly(GMA-C〇-EDMA)注射器整體柱的合成 將24% (wt%)的甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA)，16% (wt%)的乙二醇二甲基丙烯酸 酯（EDMA)，20% (wt%)的環(huán)己醇，40% (wt%)的十二醇和1 % (是功能單體和交聯(lián)劑的質 量）的2,2_二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA)的混合溶液超聲混勻，通氮氣5min后裝入內 壁鍵合雙鍵的聚丙烯注射器內，通過原位光引發(fā)合成注射器整體柱，光引發(fā)波長為365nm， 光強為20m W/cm2,光照時間為6min。反應完成后利用甲醇沖洗注射器整體柱，以除去柱內 的致孔劑和未反應的物質，從而制得P〇ly(GMA- c〇-EDMA)注射器整體柱，其截面的掃描電 子顯微鏡（SEM)如圖6(a)所示。 (3) P〇ly(BMA-C〇-EDMA)注射器整體柱的合成 將24% (wt% )的甲基丙烯酸丁酯（BMA)，16% (wt% )的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，26% (wt% )的正丙醇，34% (wt% )的1，4_ 丁二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑 的質量）的2, 2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA)的混合溶液超聲混勻，通氮氣5min后 裝入內壁鍵合雙鍵的聚丙烯注射器內，通過原位光引發(fā)合成注射器整體柱，光引發(fā)波長為 365nm，光強為20m W/cm2,光照時間為6min。反應完成后利用甲醇沖洗注射器整體柱，以除 去柱內的致孔劑和未反應的物質，從而制得P〇ly(BMA-c〇-EDMA)注射器整體柱，其截面的 掃描電子顯微鏡（SEM)如圖6(b)所示。 (4)P〇ly(LMA-C〇-EDMA)注射器整體柱的合成 將24% (wt%)的甲基丙烯酸月桂酯（LMA)，16% (wt%)的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，26% (wt% )的正丙醇，34% (wt% )的1，4_ 丁二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑 的質量）的2, 2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA)的混合溶液超聲混勻，通氮氣5min后 裝入內壁鍵合雙鍵的聚丙烯注射器內，通過原位光引發(fā)合成注射器整體柱，光引發(fā)波長為 365nm，光強為20m W/cm2,光照時間為6min。反應完成后利用甲醇沖洗注射器整體柱，以除 去柱內的致孔劑和未反應的物質，從而制得poly (LMA-co-EDMA)注射器整體柱，其截面的 掃描電子顯微鏡（SEM)如圖6(c)所示。 實施例6 :有機聚合物整體柱在聚丙烯移液槍槍頭中的合成 (1) 聚丙烯移液槍槍頭的內壁鍵合雙鍵 將10?200 μ L的聚丙烯移液槍槍頭，其內壁首先依次采用乙醇和丙酮清洗，氮氣吹干 后，加入5 μ L濃度為5wt%的脫氧苯甲酮的甲醇溶液，UV 365nm下光照3min，光強為20mw/ cm2。采用甲醇徹底清洗后，利用氮氣吹干，再加入5 μ L濃度為15wt %的二甲基丙烯酸乙二 醇酯的甲醇溶液，UV 365nm下光照3min，光強為20mw/cm2。最后利用甲醇徹底清洗槍頭內 壁，采用氮氣吹干。 (2) Poly(GMA-c〇-EDMA)槍頭整體柱的合成 將24% (wt% )的甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA)，16% (wt% )的乙二醇二甲基丙烯 酸酯（EDMA)，20% (wt% )的環(huán)己醇，40% (wt% )的十二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑 的質量）的2, 2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA)的混合溶液超聲混勻，通氮氣5min后裝 入內壁鍵合雙鍵的聚丙烯移液槍槍頭內，通過原位光引發(fā)合成槍頭整體柱，光引發(fā)波長為 365nm，光強為20mw/cm 2,光照時間為6min。反應完成后利用甲醇沖洗槍頭整體柱，以除去 柱內的致孔劑和未反應的物質，從而制得poly (GMA-co-EDMA)槍頭整體柱。 (3) Poly(BMA-c〇-EDMA)槍頭整體柱的合成 將24% (wt% )的甲基丙烯酸丁酯（BMA)，16% (wt% )的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，20% (wt%)的環(huán)己醇，40% (wt%)的十二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑的 質量）的2, 2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA)的混合溶液超聲混勻，通氮氣5min后裝 入內壁鍵合雙鍵的聚丙烯移液槍槍頭內，通過原位光引發(fā)合成槍頭整體柱，光引發(fā)波長為 365nm，光強為20mw/cm 2,光照時間為6min。反應完成后利用甲醇沖洗槍頭整體柱，以除去 柱內的致孔劑和未反應的物質，從而制得poly (BMA-co-EDMA)槍頭整體柱。 (4) Poly(LMA-c〇-EDMA)槍頭整體柱的合成 將24% (wt%)的甲基丙烯酸月桂酯（LMA)，16% (wt%)的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，20% (wt%)的環(huán)己醇，40% (wt%)的十二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑的 質量）的2, 2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA)的混合溶液超聲混勻，通氮氣5min后裝 入內壁鍵合雙鍵的聚丙烯移液槍槍頭內，通過原位光引發(fā)合成槍頭整體柱，光引發(fā)波長為 365nm，光強為20mw/cm 2,光照時間為6min。反應完成后利用甲醇沖洗槍頭整體柱，以除去 柱內的致孔劑和未反應的物質，從而制得poly (LMA-co-EDMA)槍頭整體柱。 實施例7 :Poly(BMA-c〇-EDMA)和Poly(LMA-co-EDMA)整體柱的表面接枝改性 分別將Poly(BMA-co-EDMA)和Poly(LMA-co-EDMA)整體柱進行表面接枝甲基丙烯酸縮 水甘油酯，鍵合環(huán)氧基團，以便于后續(xù)的功能化修飾。具體步驟如下：向整體柱中充滿濃度 為5wt%的脫氧苯甲酮的甲醇溶液，UV 365nm下光照15min，光強為20mw/cm2。利用甲醇將 整體柱徹底清洗后，再充滿濃度為15wt%的甲基丙烯酸縮水甘油酯的甲醇溶液，UV 365nm 下光照15min，光強為20mw/cm2,最后將整體柱利用甲醇徹底清洗。 實施例8 :納米金有機聚合物毛細管整體柱的合成 將實例4(3)中合成的？〇17(6嫩-(：〇40嫩）毛細管整體柱首先和1111〇1/1的胱胺溶液反 應，反應溫度為50°C，反應時間2h。反應完成后，用水將整體柱沖至中性。之后，將整體柱 與0. 25mol/L的二硫蘇糖醇（DTT)或三（2-羰基乙基）磷（TCEP)溶液在室溫下反應2h， 即可得到表面修飾巰基的SH-p 〇ly(GMA-C〇-EDMA)整體柱。能量彌撒光譜（EDS)測定顯示 整體柱上的S元素含量為7. 23wt %，表明在整體柱上成功鍵合了巰基（-SH)。最后，將實例 1中合成的粒徑為15nm的納米金膠體水溶液用注射泵泵入表面修飾巰基的整體柱內，在整 體柱上鍵合納米金，直至飽和，得到納米金整體柱，其截面的掃描電子顯微鏡（SEM)如圖7 所示。能量彌撒光譜（EDS)測定顯示納米金整體柱上的Au元素含量為52. 70wt%,表明在 整體柱上成功鍵合了納米金。 實施例9 :納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應器的制備方法 將實施例8中制備好的AuNPs-poly (GMA-co-EDMA)整體柱，用50mmol/L pH 7. 2的磷酸 緩沖溶液沖洗平衡后，將lmL濃度為50mmol/L的胰蛋白酶泵入AuNPS-p〇ly(GMA- C〇-EDMA) 整體柱中，使酶固定到整體柱表面納米金載體上至飽和，用50mmol/L pH 7. 2的磷酸緩沖液 沖洗該整體柱，除去未被固定的酶，得到納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應器。 實施例10 :納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應器酶解細胞色素 C 將實施例9中合成的納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應器應用于酶解細胞色素 C。具體步驟如下：在100mmol/L(pH 8. 2)的碳酸氫銨溶液中，配置濃度為1.5mg/mL的細 胞色素 C。采用注射泵在0. 5 μ L/min的流速下，將細胞色素 C溶液泵入實施例9中合成的 納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應器中，在37°C下發(fā)生酶解反應。將流出液體收集于 1. 5mL的樣品瓶中，進行液相色譜（HPLC)分析酶解后的多肽片段（圖8)，同時，利用基質輔 助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS)分析酶解后的多肽片段（圖9)。 將上述配置的濃度為1. 5mg/mL的細胞色素 C，用pH = 8. 75的乙酸銨溶液稀釋到 0. 15mg/mL，按物質質量比為50 : l(w/w)加入胰蛋白酶液，在搖床中37°C下反應24h，之后 加入lmL的乙酸溶液終止反應，將溶液過濾，進行液相色譜質譜聯(lián)用（HPLC-MS)分析酶解后 的多肽片段（圖8)。 實施例11 :納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應器酶解牛血清白蛋白（BSA) 將實例2中合成的納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應器應用于酶解牛血清白蛋 白（BSA)。具體步驟如下： (1)在pH值為8. 2的含有8mol/L尿素的碳酸氫銨溶液中，得到濃度為5mg/mL的BSA 溶液。 ⑵取步驟（1)中配置的BSA溶液lmL，加入lmL的45mM的二硫蘇糖醇（DTT)溶液，在 60°C 下反應 45min。 (3)將步驟（2)中得到的溶液取出，恢復至室溫。再加入lmL濃度為100mM的碘乙酰胺 (IAA)溶液，于黑暗環(huán)境中反應30min。 (4) 將步驟（3)中得到的溶液加入濃度為50mM的乙酸銨溶液（pH = 8. 75)，用截留分 子量為30000的超濾離心管在6000rpm的轉速下離心3次，每次30min。 (5) 將步驟（4)中離心后的溶液用濃度為50mM的乙酸銨溶液（pH = 8. 75)稀釋至 0· 15mg/mL〇 (6) 采用注射泵在0. 5 μ L/min的流速下，將步驟（5)中得到的BSA溶液泵入實例2中 合成的納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應器中，在37°C下發(fā)生酶解反應。將流出液體 收集于1. 5mL的樣品瓶中，進行液相色譜（HPLC)分析酶解后的多肽片段（圖10)，同時，利 用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS)分析酶解后的多肽片段（圖11)。 ⑵將步驟（5)中配置的濃度為0. 15mg/mL的BSA溶液，按物質質量比為50 : 1 (w/w) 加入胰蛋白酶液，在搖床中37°C下反應24h，之后加入lmL的乙酸溶液終止反應，將溶液過 濾，進行液相色譜（HPLC)分析酶解后的多肽片段（圖10)。 實施例12 :納米金整體柱固載米根毛霉脂肪酶生物微反應器的制備方法 將米根毛霉脂肪酶溶解在pH 7. 6的磷酸緩沖溶液中，濃度為50mmol/L。利用注射泵以 0. 5 μ L/min的流速，室溫下將米根毛霉脂肪酶溶液泵入實例1中合成的納米金整體柱內， 直至飽和。之后，用0. 5mL 50mmol/L pH 7. 2的磷酸緩沖溶液沖洗該整體柱，除去未鍵合的 米根毛霉脂肪酶，即得到納米金固定化米根毛霉脂肪酶生物微反應器。 實例13 :納米金整體柱固載米根毛霉脂肪酶生物微反應器手性拆分布洛芬丙酯 將實例10中合成的納米金整體柱固載米根毛霉脂肪酶生物微反應器應用于手性拆分 布洛芬。在40°C下，0· 03mol/L的外消旋布洛芬和0· 06mol/L的正丙醇溶于正己烷中，以 0. 5uL/min的流速，進行連續(xù)催化，對外消旋布洛芬進行手性拆分，轉化率為46,選擇性E值 為9。而米根毛霉脂肪酶在游離狀態(tài)下的選擇性E值僅為2。 表1合成不同粒徑大小的納米金膠體所用的氯金酸和檸檬酸鈉的用量。 表2納米金整體柱固定化酶對細胞色素 C進行酶解的多肽片段經過二級分析后比對 正確的多肽片段。 表3納米金整體柱固定化酶對牛血清白蛋白（BSA)進行酶解的多肽片段經過二級分 析后比對正確的多肽片段。 表1

【權利要求】
1. 一種納米材料整體柱固載酶生物微反應器的制備方法，其特征在于包括：步驟A，制 備納米材料；納米材料包括納米金、納米銀、納米二氧化娃、足球烯C 6(l、碳納米管、石墨烯、 磁性四氧化三鐵、金屬-有機框架材料MOF或共價有機骨架COF ;其中，納米材料的粒徑在 5 ?lOOOnm ; 步驟B，有機聚合物整體柱的合成：包括質量百分比為5?30%功能單體、5?30%交 聯(lián)劑和30?80%致孔劑，并且功能單體、交聯(lián)劑和致孔劑的質量總和為100%，另外還加 入功能單體和交聯(lián)劑質量的〇. 2?5%的引發(fā)劑的混合溶液，通過原位熱引發(fā)或光引發(fā)在 不銹鋼色譜柱、毛細管、聚丙烯基槍頭、聚丙烯基注射器、高硼硅玻璃板和硅晶片中合成多 孔有機聚合物整體柱；其中不銹鋼色譜柱的內徑為3-6mm，長度為6-30cm ;毛細管的內徑為 50-600 μ m，長度為5-50cm ;聚丙烯基槍頭的體積為0. Ol-lOmL ;聚丙烯基注射器的體積為 0· Ι-lOmL ;熱引發(fā)反應溫度為45?85°C，反應時間6?48h ;光引發(fā)波長為254nm或365nm， 光強為6-30mW/cm2,光照時間為5-60min ;功能單體包括甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯 酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸月桂酯、丙烯酸、丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、甲基 丙烯酸丙炔基酯、縮水甘油基炔丙基醚、2-乙烯基-4,4-二甲基-2-惡唑啉-5-酮、2-甲 基-2-丙烯酸_2, 3-二羥基丙酯、苯乙烯或4-乙烯基吡啶；交聯(lián)劑包括乙二醇二甲基丙烯 酸酯、三烯丙基異三聚氰酸酯、二乙烯基苯、Ν，Ν' -亞甲基雙丙烯酰胺；致孔劑包括甲苯、正 庚烷、環(huán)己醇、十二醇、正丙醇、1，4_ 丁二醇或不同分子量的聚乙二醇；引發(fā)劑包括偶氮二 異丁臆、偶氮二異庚臆、2, 2-二甲氧基_2_苯基苯乙酮或2-輕基-2-甲基-1-苯基丙酮； 步驟C，合成納米材料整體柱：對多孔有機聚合物整體柱進行功能化修飾； 步驟D，以納米材料為中間配體，在整體柱上實現(xiàn)酶的固定化，設計制備納米材料整體 柱固載酶生物微反應器。
2. 如權利要求1所述的納米材料整體柱固載酶生物微反應器的制備方法，其特征在 于：酶溶液是用pH 6. 5?8. 0的磷酸緩沖溶液配制，其濃度為5?50mg/mL。
3. 用權利要求1或2所述的制備方法制備的納米材料整體柱固載酶生物微反應器。
【文檔編號】C12M1/40GK104195042SQ201410361654
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月27日 優(yōu)先權日:2014年7月27日
【發(fā)明者】呂永琴, 譚天偉, 王紅霞, 朱正禮, 林祥華 申請人:北京化工大學