一種高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(gad)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法：從9種微生物中，通過底物誘導(dǎo)篩選出高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)的產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacer?aerogenes)菌株；經(jīng)過考察發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度、底物濃度、初始發(fā)酵液pH值等單因子以及3因素3水平的響應(yīng)面分析和模型修正，確定該降解菌株的最佳發(fā)酵條件，并進行驗證；再通過溶劑萃取和中壓柱分離，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)98％以上的焦性沒食子酸，為微生物法降解沒食子酸生產(chǎn)焦性沒食子酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的實踐基礎(chǔ)。
【專利說明】一種高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及微生物降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法。

二、【背景技術(shù)】
[0002]五倍子富含沒食子單寧，由沒食子酸與不同構(gòu)型的葡萄糖結(jié)合的混合物，以五倍酰葡萄糖為核心，在C2、C3、C4位以縮酚鍵連接不同數(shù)目的倍?；Y(jié)構(gòu)。沒食子單寧通過化學(xué)法水解或生物法在單寧酶(tannase)的作用下發(fā)生降解生成沒食子酸；沒食子酸再經(jīng)過化學(xué)法脫羧或在沒食子酸脫羧酶(gallic acid decarboxylases, GAD)的作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)生成焦性沒食子酸(如圖1所示)。焦性沒食子酸(1，2，3-三羥基苯)作為一種多元酚，在工業(yè)上具有廣泛的用途。在攝影行業(yè)中，焦性沒食子酸可以作為顯影劑使膠片成像；在燃料工業(yè)上，焦性沒食子酸與二羥代苯砜縮合產(chǎn)物是染制皮毛、皮革的優(yōu)良染料；在醫(yī)藥工業(yè)中，焦性沒食子酸可作為輔酶-QlO的抗氧化穩(wěn)定劑，是重要的醫(yī)藥中間體；分析化學(xué)中，在重量分析上用以測定鉍及銻，并用作磷鎢酸的還原劑，紅外線照相術(shù)的熱敏劑，也是煤氣、煙道氣、煉焦煤氣、水煤氣等氣體的除氧劑。
[0003]
[0004]
[0005]目前工業(yè)上主要通過化學(xué)法，將沒食子酸在在6N HCl的作用下催化脫羧生產(chǎn)焦性沒食子酸，但由于產(chǎn)生大量高濃度鹽和高色度的廢酸水，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染問題和設(shè)備腐蝕等問題，急需開發(fā)環(huán)境友好和反應(yīng)溫和的微生物制備新工藝，關(guān)鍵在于產(chǎn)高活性沒食子酸脫羧酶菌株及其降解工藝的優(yōu)選。由于相較化學(xué)法，利用GAD來降解沒食子酸生產(chǎn)焦性沒食子酸的收率并不高，國內(nèi)的研究基本上屬于空白，國外雖然早在上世紀(jì)60年代就有相應(yīng)的研究，但目前已發(fā)現(xiàn)可有高效降解效果的菌株仍然很少，但目前已發(fā)現(xiàn)可有高效降解效果的菌株仍然很少，諸如克雷伯氏菌(K.aerogenes)、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、成團泛菌(P.agglomerans)、氧化還原真桿菌(E.0xidoreducens)、植物乳桿菌(L.planetarium)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)、黏紅酵母菌(R.glutinis)等。研究發(fā)現(xiàn),某些微生物菌種可以產(chǎn)生脫羧酶而將多羥基苯甲酸羧基脫去；某些微生物菌種可以在特定的培養(yǎng)基上產(chǎn)生高活性沒食子酸脫羧酶(GAD)，將沒食子酸降解成焦性沒食子酸。Hajim等利用檸檬菌株(C.sp.64-1)，在厭氧條件下降解沒食子酸生產(chǎn)焦性沒食子酸，產(chǎn)率達到97.4%。Kumar等采用固定檸檬酸桿菌(C.freundii)生物反應(yīng)，進行連續(xù)發(fā)酵沒食子酸，焦性沒食子酸的產(chǎn)率達到98.5%。Soni等從印度Rfjasthan地區(qū)的土壤中利用EDAE纖維素離子交換柱和交聯(lián)葡萄糖G-50凝膠過濾色譜分離得到了一種腸桿菌(E.spp.)，該細(xì)菌可以產(chǎn)高活性沒食子酸脫羧酶(GAD)，焦性沒食子酸產(chǎn)率14.48%。Spiros等利用基因工程菌將葡萄糖生物合成沒食子酸和焦性沒食子酸，來代替生物催化生產(chǎn)焦性沒食子酸的方法，產(chǎn)率可達93~97%。Grant利用產(chǎn)氣桿菌研究了非氧化脫羧酶對多羥基苯甲酸的脫羧作用及部分脫羧酶的性質(zhì)，主要是鄰苯二酚、間苯二酚母核結(jié)構(gòu)型多羥基苯甲酸和氨基苯甲酸的脫羧，微生物為黑曲霉菌、產(chǎn)氣桿菌、假單胞菌、大腸桿菌等。目前已從多種細(xì)菌中分離得到?jīng)]食子酸脫羧酶，如成團泛菌(P.agglomerans T71)、檸檬酸桿菌(C.freundii TB3)、檸檬酸桿菌(C.sp.64-1)、腸桿菌屬(E.Spp),除細(xì)菌外還發(fā)現(xiàn)一株酵母菌(R.Glutinis)也可以產(chǎn)生沒食子酸脫羧酶。

三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于將負(fù)壓空化和負(fù)壓微波噴霧干燥技術(shù)應(yīng)用于中藥五倍子提取中，通過對負(fù)壓空
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，本發(fā)明的技術(shù)方案是采用如下步驟來實現(xiàn):
[0008]第一步，培養(yǎng)基制備
[0009](I)種子培養(yǎng)基稱取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g在IL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，用lmol/L鹽酸將pH值調(diào)至6.5~7.0，在121°C下滅菌20min，冷卻后為種子培養(yǎng)基；
[0010](2)試管斜面保藏培養(yǎng)基稱取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g、瓊脂15.0g,在IL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，用lmol/L鹽酸將pH值調(diào)至6.5~7.0，在121°C下滅菌20min，冷卻后為試管斜面保藏培養(yǎng)基；
[0011](3)發(fā)酵培養(yǎng)基成團泛菌發(fā)酵培養(yǎng)基:0.3%沒食子酸、0.5%丙三醇、0.5%蛋白胨、0.001% FeSO4.7Η20、0.I % KH2PO4^0.05% MgSO4.7Η20、1.0 %酵母提取物;弗氏檸檬酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:2.0%沒食子酸、0.2% (NH4)2ΗΡ04、0.1% ΚΗ2Ρ04、0.05% MgSO4.7Η20、0.05%酵母提取物；克雷伯氏菌發(fā)酵培養(yǎng)基:1.0 %沒食子酸、3.0% C13H15N3O2 (4-氨酰安替比林)、
2.0% (NH4)2SO4^0.8M 飽和 Na2B4O7.1H2 水溶液、0.5M Na2HPO4.12H20 緩沖溶液(ρΗ7.2 可由 12.535g Na2HPO4.Iffi2O 或者 4.969g Na2HPO4 與 2.340g NaH2PO4.2H20 溶于 10mL 蒸餾水制得)；氧化還原真桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:30mM C6H7O8Na, 30mM HCOONa.2Η20、I %細(xì)菌瓊脂粉、0.2%沒食子酸；植物乳桿菌、解沒食子酸鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)基:包含5.0%去纖維蛋白的馬血、20mM沒食子酸的肉湯培養(yǎng)基；黏紅酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)基:0.5% C6H12O6^0.9% NaCU0.5mM沒食子酸、0.5%酵母提取物；腸桿菌屬、產(chǎn)氣腸桿菌屬發(fā)酵培養(yǎng)基:0.06% MgSO4.7H20、0.4% (NH4)2S04、0.2%~0.5%沒食子酸、0.5%麥芽糖并取30mM pH值為6.0~7.0的磷酸鹽緩沖溶液，其中沒食子酸于100°C下滅菌5min，麥芽糖于115°C下滅菌30min，其余成分在121°C下滅菌20min，制備發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0012]第二步，高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)的菌種篩選
[0013]初篩的方法:將培養(yǎng)好的克雷伯氏菌(K.aerogenes)、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、成團泛菌(P.agglomerans)、氧化還原真桿菌(E.0xidoreducens)、植物乳桿菌(L.planetarium)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)、黏紅酵母菌(R.glutinis)等菌液,分別放入相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，如腸桿菌屬(E.sp.)、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)的發(fā)酵培養(yǎng)基如第一步中所示，溫度30~37°C，每隔12h取樣一次，然后取用3倍體積的乙醚萃取發(fā)酵液3次，合并萃取液、減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，經(jīng)TLC和HPLC分析沒食子酸和焦性沒食子酸，篩選出高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)的產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)和黏紅酵母菌(R.glutinis)。
[0014]第三步，菌種底物誘導(dǎo)
[0015]配制CDM缺碳培養(yǎng)基:0.06% MgSO4.7Η20、0.4% (NH4)2SO4^0.2%沒食子酸及 30mMpH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液，將培養(yǎng)好的斜面菌種以無菌操作取兩環(huán)，轉(zhuǎn)接到250mL搖瓶(裝液量10mL) CDM培養(yǎng)基中，在水浴溫度為25~30°C，轉(zhuǎn)速為180~200r/min的搖床中培養(yǎng)，每12h取樣一次，HPLC檢測培養(yǎng)發(fā)酵液中沒食子酸和焦性沒食子酸；
[0016]第四步，種子液制備及發(fā)酵培養(yǎng)
[0017]將培養(yǎng)好的斜面菌種以無菌操作取五環(huán)，轉(zhuǎn)接到250mL搖瓶(裝液量10mL)種子培養(yǎng)基中，溫度30~40°C，靜置培養(yǎng)6~8h，將培養(yǎng)好的種子液按照4~6%接種量，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度30~35°C，180~200r/min搖床培養(yǎng)50~70h ；
[0018]第五步，搖瓶生理脅迫培養(yǎng)及響應(yīng)面優(yōu)化
[0019]通過考察接種量、發(fā)酵時間、磷酸鹽濃度、底物濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液起始pH值等因素對焦性沒食子酸的收率的單因素影響，采用Box-Behnken實驗設(shè)計進行3因素(底物濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液起始PH值)3水平的響應(yīng)面優(yōu)化，并進行驗證。
[0020]第六步，發(fā)酵液中焦性沒食子酸提取
[0021]取第五步最佳工藝條件下發(fā)酵液原液，于6000r/min條件下離心20min，取上清液用其體積3倍的有機溶劑萃取3次，合并萃取相、濃縮，得焦性沒食子酸濃縮物；
[0022]第七步，中壓柱分離制備
[0023]將焦性沒食子酸濃縮物與中壓柱填料按質(zhì)量比1: 10~30吸附，洗脫劑為氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水中的一種或幾種的混合溶液，中壓柱柱長20~300cm，柱直徑2~30cm，柱壓為3~lOMPa，檢測波長220~360nm，流速2~100mL/min，富集焦性沒食子酸，室溫真空同收溶劑，經(jīng)HPLC分析，制備得到98%以上焦性沒食子酸；
[0024]本專利采用克雷伯氏菌(K.aerogenes)、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、成團泛菌(P.agglomerans)、氧化還原真桿菌(E.0xidoreducens)、大腸桿菌(E.coli)、植物乳桿菌(L.planetarium)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)、黏紅酵母菌(R.glutinis) 10種菌種進行篩選,配制不同的培養(yǎng)基，如產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.) CDM缺碳培養(yǎng)基為0.06 % MgSO4.7H20、
0.4% (NH4)2SO4^0.2%沒食子酸及30mM pH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液；弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii) CDM 缺碳培養(yǎng)基為 2.0 % 沒食子酸，0.2 % (NH4)2HP04,0.1 % KH2PO4,0.05%MgSO4.7Η20，0.05%酵母提取物。在培養(yǎng)48h后產(chǎn)生了焦性沒食子酸，通過初選，TLC和HPLC檢測，選出具有高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes),腸桿菌為(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌為(C.freundii)、解沒食子酸鏈球菌為(S.gallolyticus)，黏紅酵母菌為(R.glutinis)。
[0025]本發(fā)明采用pH值為6.0~7.0的磷酸鹽緩沖溶液，隨著初始pH值的上升，焦性沒食子酸的收率不斷下降，當(dāng)初始PH值為6.0時最大收率76.21 %，當(dāng)初始pH值小于5.4和大于7.6時，均并未檢測出焦性沒食子酸，培養(yǎng)基pH值對菌種的影響很大。單因素實驗中，過高或者過低的初始PH值的培養(yǎng)基下，都不會使沒食子酸降解產(chǎn)生焦性沒食子酸，因此實驗的最適初始PH值選擇在5.6~6.0之間。而沒食子酸的降解率則隨著pH值的增加呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢，說明整個過程中在PH值較低時沒食子酸的主要降解產(chǎn)物為焦性沒食子酸，而隨著PH值的增加，沒食子酸其他的降解產(chǎn)物也逐漸生成，故在焦性沒食子酸的收率下降的時候沒食子酸的降解率仍然很高。
[0026]本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)溫度25~40°C，優(yōu)選25~35°C，發(fā)酵溫度達到35°C時，收率達到最大值為63.56%，隨著溫度的繼續(xù)升高，過高的溫度破壞了酶的產(chǎn)生的環(huán)境以及所產(chǎn)生的GAD的本身的穩(wěn)定性，在溫度為45~50°C時收率下降，整個過程與沒食子酸的降解率呈相同的趨勢。
[0027]本發(fā)明在180~300r/min搖床培養(yǎng)，優(yōu)選180~220r/min。在培養(yǎng)4~6h時，高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)的菌種處于對數(shù)生長期，將此時間段的細(xì)菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，細(xì)菌適應(yīng)新環(huán)境所需的調(diào)整期會大大縮短，同時提高細(xì)菌在新的培養(yǎng)基中的成活率，本發(fā)明優(yōu)選培養(yǎng)5h的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在往復(fù)式水浴恒溫振蕩器中以180r/min的振蕩速度恒溫培養(yǎng)后，將發(fā)酵液萃取、濃縮之后HPLC檢測分析，沒食子酸的轉(zhuǎn)化率97%以上，焦性沒食子酸收率60~80%。
[0028]本發(fā)明發(fā)酵采用0.2~0.5%沒食子酸為底物濃度，隨著底物濃度的增加，沒食子酸的降解率隨著底物濃度的增加而增加，過高的底物濃度會對培養(yǎng)基的PH值改變較大，從而抑制細(xì)菌的生長或者其所產(chǎn)生的GAD的活性。因此優(yōu)選底物濃度為0.4%為宜。
[0029]本發(fā)明采用搖瓶生理脅迫培養(yǎng)及響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝,采用Box-Behnken實驗設(shè)計進行3因素(底物濃度0.3%、0.4%、0.5% ;發(fā)酵溫度25°C、30°C、35°C ;初始pH值
5.6、6.0、6.4) 3水平的響應(yīng)面優(yōu)化，并進行驗證實驗。利用Design Expert軟件,進行多元線性回歸擬合，獲得焦性沒食子酸的收率對編碼自變量的二次多項回歸方程為:Y =68.63-8.68ΧΧΑ11.80ΧΧ2_18.26XX3+20.STXX1XX2-?.QeXX1XX3+^.80ΧΧ2ΧΧ3_6.46ΧΧ/-23.69ΧΧ22-10.91 XX12XXjH.SSXX12XX3-?.62 X X1X X22
[0030]對響應(yīng)面結(jié)果利用軟件進行最優(yōu)化分析，確定最優(yōu)條件如下:發(fā)酵溫度31.58°C，發(fā)酵液初始pH值為6.07，底物濃度為0.32%，在該條件下的預(yù)測值為80.0222%。為了方便操作，將發(fā)酵溫度調(diào)整為32°C，發(fā)酵液初始pH值調(diào)整為6.0，底物濃度調(diào)整為0.32%，在此工藝條件下進行3次平行實驗，得到的焦性沒食子酸的平均得率為77.86% (RSD =1.21% )與預(yù)測值相差2.70%，說明吻合性良好，驗證所建模型的正確性。
[0031]本發(fā)明采用HPLC分析焦性沒食子酸，色譜柱Thermo 0DS-2C18 (5 μ m250X4.6mm)分離柱，流動相為甲醇-水(含0.5%醋酸)=37-63 (v/v)，通過0.45 μ m孔徑濾膜過濾，流速lmL/min，檢測波長263nm，檢測器PDA 二極管陣列檢測器，室溫。焦性沒食子酸收率利用焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.5%)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其保留時間分別為:
3.443min，焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 1318523.5x+6474.1，相關(guān)系數(shù)R = 0.99951。分析時以焦性沒食子酸的收率為指標(biāo)，其計算公式為:
[0032]焦性沒食子酸收率y = (5Xc/Vl) X v0/m0X 100% ；
[0033]式中
[0034]vl:萃取體積；v0:發(fā)酵液實際體積；m0:焦性沒食子酸的理論產(chǎn)量；c =HPLC檢測時的焦性沒食子酸濃度，由其標(biāo)準(zhǔn)曲線算出；數(shù)字5:進行檢測的萃取液濃縮后用5mL流動相溶解的。
[0035]本發(fā)明采用有機溶劑萃取發(fā)酵液中的焦性沒食子酸，選擇乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯等其中I種或任2種混合溶劑，優(yōu)選乙醚和乙酸乙酯。采用中壓柱分離純化萃取物中焦性沒食子酸。中壓柱填料選擇200~300目的硅膠和氧化鋁中的I種或2種任意比，洗脫劑為叔丁基甲醚、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇中的I種或幾種的混合溶液，優(yōu)選氯仿:甲醇=50: 1-10 (v/v)混合溶劑。填料也可選擇孔徑為60A，40~60μπι的ODS C18、C8和SephedexLH-20材料，洗脫劑為甲醇、乙醇和水中的I種或幾種的混合溶液，優(yōu)選I~20%的甲醇水溶液。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0036]附圖1為焦性沒食子酸制備路線；
附圖2為菌種篩選過程中產(chǎn)氣腸桿菌降解沒食子酸生產(chǎn)焦性沒食子酸的HPLC檢測圖；
[0037]附圖3為接種量對焦性沒食子酸收率的影響圖；
[0038]附圖4為底物濃度對焦性沒食子酸收率的影響圖；
[0039]附圖5為磷酸鹽緩沖溶液含量對焦性沒食子酸收率的影響圖；
[0040]附圖6為發(fā)酵時間對焦性沒食子酸收率的影響；
[0041]附圖7為發(fā)酵溫度對焦性沒食子酸收率的影響；
[0042]附圖8為初始pH對焦性沒食子酸收率的影響。

【具體實施方式】
[0043]以下實施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)被看做是對本發(fā)明的限定。
[0044]實施例1沒食子酸和焦性沒食子酸的HPLC分析及計算方法
[0045]準(zhǔn)確稱取10mg的焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品流動相溶解，于10mL容量瓶中定容。分別取2、4、6、8、10mL至1mL的容量瓶中定容，得0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后在流動相為:甲醇:水(0.5%醋酸水)=37: 63的條件下，于高效液相分析儀中檢測。采用HPLC分析焦性沒食子酸，色譜柱Thermo 0DS-2C18 (5 μ m250X4.6mm)分離柱，流動相為甲醇-水(含0.5%醋酸)=37-63 (v/v)，通過0.45 μ m孔徑濾膜過濾，流速ImL/min,檢測波長263nm，檢測器PDA 二極管陣列檢測器，室溫。焦性沒食子酸收率利用焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.5%)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其保留時間分別為:3.443min，焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為I = 1318523.5X+6474.1，相關(guān)系數(shù)R = 0.99951。分析時以焦性沒食子酸的收率為指標(biāo)，其計算公式為:
[0046]焦性沒食子酸收率y = (5Xc/n,) X v0/m0X 100% ；
[0047]式中
[0048]vl:萃取體積；v0:發(fā)酵液實際體積；m0:焦性沒食子酸的理論產(chǎn)量；c =HPLC檢測時的焦性沒食子酸濃度，由其標(biāo)準(zhǔn)曲線算出；數(shù)字5:進行檢測的萃取液濃縮后用5mL流動相溶解的。
[0049]實施例2.焦性沒食子酸的制備方法
[0050]第一步，培養(yǎng)基制備
[0051](I)種子培養(yǎng)基稱取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g在IL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，用lmol/L鹽酸將pH值調(diào)至6.5~7.0，在121°C下滅菌20min，冷卻后為種子培養(yǎng)基；
[0052](2)試管斜面保藏培養(yǎng)基稱取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g、瓊脂15.0g,在IL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，用lmol/L鹽酸將pH值調(diào)至6.5~7.0，在121°C下滅菌20min，冷卻后為試管斜面保藏培養(yǎng)基；
[0053](3)發(fā)酵培養(yǎng)基成團泛菌發(fā)酵培養(yǎng)基:0.3%沒食子酸、0.5%丙三醇、0.5%蛋白胨、0.001% FeSO4.7Η20、0.I % KH2PO4^0.05% MgSO4.7Η20、1.0 %酵母提取物;弗氏檸檬酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:2.0%沒食子酸、0.2% (NH4)2ΗΡ04、0.1% ΚΗ2Ρ04、0.05% MgSO4.7Η20、0.05%酵母提取物；克雷伯氏菌發(fā)酵培養(yǎng)基:1.0 %沒食子酸、3.0% C13H15N3O2 (4-氨酰安替比林)、
2.0% (NH4)2SO4^0.8M 飽和 Na2B4O7.1H2O 水溶液、0.5M Na2HPCM.12H20 緩沖溶液(ρΗ7.2 可由 12.535g Na2HPO4.12H20 或者 4.969g Na2HPO4 與 2.340g NaH2P04.2Η20 溶于 10mL 蒸餾水制得)；氧化還原真桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:30mM C6H7O8Na, 30mM HCOONa.2Η20、I %細(xì)菌瓊脂粉、
0.2%沒食子酸；植物乳桿菌、解沒食子酸鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)基:包含5.0%去纖維蛋白的馬血、20mM沒食子酸的肉湯培養(yǎng)基；黏紅酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)基:0.5% C6H12O6^0.9% NaCU0.5mM沒食子酸、0.5%酵母提取物；腸桿菌屬、產(chǎn)氣腸桿菌屬發(fā)酵培養(yǎng)基:0.06% MgSO4.7H20、
0.4% (NH4)2S04、0.2%~0.5%沒食子酸、0.5%麥芽糖并取30mM pH值為6.0~7.0的磷酸鹽緩沖溶液，其中沒食子酸于100°C下滅菌5min，麥芽糖于115°C下滅菌30min，其余成分在121°C下滅菌20min， 制備發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0054]第二步，高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)的菌種篩選
[0055]初篩的方法:將培養(yǎng)好的克雷伯氏菌(K.aerogenes)、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、成團泛菌(P.agglomerans)、氧化還原真桿菌(E.0xidoreducens)、植物乳桿菌(L.planetarium)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)、黏紅酵母菌(R.glutinis)等菌液,分別放入相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，如腸桿菌屬(E.sp.)、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)的發(fā)酵培養(yǎng)基如第一步中所示，溫度30~37°C，每隔12h取樣一次，然后取用3倍體積的乙酸乙酯萃取發(fā)酵液3次，合并萃取液，減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，經(jīng)TLC和HPLC分析沒食子酸和焦性沒食子酸，篩選出高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)的產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)和黏紅酵母菌(R.glutinis)。
[0056]第三步，菌種底物誘導(dǎo)
[0057]配制CDM缺碳培養(yǎng)基:0.06% MgSO4.7Η20、0.4% (NH4)2SO4^0.2%沒食子酸及 30mMpH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液，將培養(yǎng)好的斜面菌種以無菌操作取兩環(huán)，轉(zhuǎn)接到250mL搖瓶(裝液量10mL) CDM培養(yǎng)基中，在水浴溫度為25~30°C，轉(zhuǎn)速為180~200r/min的搖床中培養(yǎng)，每12h取樣一次，HPLC檢測培養(yǎng)發(fā)酵液中沒食子酸和焦性沒食子酸；
[0058]第四步，種子液制備及發(fā)酵培養(yǎng)
[0059]將培養(yǎng)好的斜面菌種以無菌操作取五環(huán)，轉(zhuǎn)接到250mL搖瓶(裝液量10mL)種子培養(yǎng)基中，溫度30~40°C，靜置培養(yǎng)6~8h，將培養(yǎng)好的種子液按照4~6%接種量，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度30~35°C，180~200r/min搖床培養(yǎng)50~70h ；
[0060]第五步，搖瓶生理脅迫培養(yǎng)及響應(yīng)面優(yōu)化
[0061]通過考察接種量、發(fā)酵時間、磷酸鹽濃度、底物濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液起始pH值等因素對焦性沒食子酸的收率的單因素影響，采用Box-Behnken實驗設(shè)計進行3因素(底物濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液起始PH值)3水平的響應(yīng)面優(yōu)化，并進行驗證。
[0062]第六步，發(fā)酵液中焦性沒食子酸提取
[0063]取第五步最佳工藝條件下發(fā)酵液原液，于6000r/min條件下離心20min，取上清液用其體積3倍的有機溶劑萃取3次，合并萃取相、濃縮，得焦性沒食子酸濃縮物；
[0064]第七步，中壓柱分離制備
[0065]將焦性沒食子酸濃縮物與中壓柱填料按質(zhì)量比1: 10~30吸附，洗脫劑為甲基叔丁基醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水中的I種或幾種的混合溶液，中壓柱柱長20~300cm,柱直徑2~30cm,柱壓為3~1MPa,檢測波長220~360nm,流速2~lOOmL/min,富集焦性沒食子酸，室溫真空回收溶劑，經(jīng)HPLC分析，制備得到98%以上焦性沒食子酸；
[0066]本實施配制不同的培養(yǎng)基，如產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)CDM缺碳培養(yǎng)基為 0.06% MgSO4.7Η20、0.4% (NH4)2SO4'0.2%沒食子酸及 30mM pH 值為 6.6 的磷酸鹽緩沖溶液；弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii) CDM缺碳培養(yǎng)基為2.0 %沒食子酸，0.2%(NH4)2HPO4,0.1 % KH2PO470.05 % MgSO4.7H20，0.05 % 酵母提取物。在進行培養(yǎng) 48h 后產(chǎn)生了焦性沒食子酸，通過初選，TLC(條件為:展開劑為乙醚:乙醇=7: 3 ;顯色劑:碘蒸氣)和HPLC檢測，選出具有高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)，腸桿菌(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus),黏紅酵母菌(R.glutinis)。
[0067]本實施采用pH值為6.0~7.0的磷酸鹽緩沖溶液，優(yōu)選5.6~6.0，發(fā)酵培養(yǎng)溫度25~40°C，優(yōu)選25~35°C，發(fā)酵溫度達到35°C時，在180~300rpm搖床培養(yǎng)，優(yōu)選180~220rpm。在培養(yǎng)4~6h時，高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)的菌種處于對數(shù)生長期，將此時間段的細(xì)菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，細(xì)菌適應(yīng)新環(huán)境所需的調(diào)整期會大大縮短，同時提高細(xì)菌在新的培養(yǎng)基中的成活率，本發(fā)明優(yōu)選培養(yǎng)5h的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在往復(fù)式水浴恒溫振蕩器中以180r/min的振蕩速度恒溫培養(yǎng)后，將發(fā)酵液萃取、濃縮之后HPLC檢測分析，沒食子酸的轉(zhuǎn)化率97%以上，焦性沒食子酸收率60~80%。
[0068]本實例發(fā)酵采用0.2~0.5%沒食子酸為底物濃度，優(yōu)選0.4%。采用搖瓶生理脅迫培養(yǎng)及響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝，采用Box-Behnken實驗設(shè)計進行3因素(底物濃度0.3%,
0.4%,0.5% ;發(fā)酵溫度25°C、30°C、35°C ;初始pH值5.6、6.0、6.4) 3水平的響應(yīng)面優(yōu)化，并進行驗證實驗。
[0069] 本實例采用有機溶劑萃取發(fā)酵液中的焦性沒食子酸，選擇乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯等其中I種或任2種混合溶劑，優(yōu)選乙醚和乙醇。采用中壓柱分離純化萃取物中焦性沒食子酸。中壓柱填料選擇200~300目的硅膠和氧化鋁中的I種或2種任意比，洗脫劑為甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙醚、正丁醇和乙醇中的一種或幾種的混合溶液，優(yōu)選甲基叔丁基醚:甲醇=50:1~30 (v/v)混合溶劑。填料也可選擇孔徑為60A, 40~60 μ m的ODS C18、C8和S^hedex LH-20材料，洗脫劑為乙酸乙酯、乙醚和乙醇中的一種或幾種的混合溶液，優(yōu)選I~20%的乙醇水溶液。
[0070]實施例3.發(fā)酵單因素工藝
[0071](I)接種量對于焦性沒食子酸收率的影響
[0072]配制CDM培養(yǎng)基，組成為0.2%沒食子酸，0.5 %麥芽糖，0.06 % Mg (SO4) 2，0.4 %(NH4)2S04，30mM磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6.6)，將沒食子酸、麥芽糖以及剩余鹽溶液分開滅菌后，分別混合裝到11瓶250mL的三角燒瓶里，在雙人單面凈化工作臺中用移液槍分別接入
0、l、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL菌液，然后放入轉(zhuǎn)速180r/min、溫度30V的往復(fù)式水浴恒溫?fù)u床中發(fā)酵60h。將上述發(fā)酵好的11瓶三角燒瓶取出至雙人單面凈化工作臺中，每瓶取樣20mL。將取樣后的菌液放入離心機中，在轉(zhuǎn)速為6000r/min的條件下分離20min。分離好的菌液用乙醚萃取兩次，每次乙醚用量30mL。再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進行濃縮，得到焦性沒食子酸樣品。樣品用5mL流動相溶解，然后用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾至1mL的一次性離心管中，最后進樣HPLC檢測分析。結(jié)果見附圖3，可以發(fā)現(xiàn):隨著接種量的增加，焦性沒食子酸的收率在不斷的增加，當(dāng)接種量達到5%時焦性沒食子酸收率為48.97%，此后焦性沒食子酸的收率趨于穩(wěn)定；當(dāng)接種量為8%時收率達到最大為49.99%，但從經(jīng)濟效益考慮選擇5%接種量為宜。
[0073](2)底物濃度對于焦性沒食子酸收率的影響
[0074]配制CDM 培養(yǎng)基，組成為 0.5%麥芽糖，0.06% Mg(SO4)2,0.4% (NH4)2S04，30mM 磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6.6)，沒食子酸含量分為0,0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%,
0.7%,0.8%,0.9%Λ.0%,2.0%,2.5%等13種不同含量，將沒食子酸分別放入250mL的三角燒瓶里。分開滅菌后，分別接入5mL菌液于13瓶三角燒瓶中，然后放入轉(zhuǎn)速180r/min、溫度30°C的往復(fù)式水浴恒溫?fù)u床中發(fā)酵60h,分別取樣20mL,在轉(zhuǎn)速為6000r/min的條件下離心20min ;然后，乙醚萃取兩次，每次乙醚用量30mL ;再進行濃縮，得到焦性沒食子酸樣品。樣品用5mL流動相溶解，然后用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾至1mL的一次性離心管中，最后HPLC檢測分析。結(jié)果見附圖4，可以發(fā)現(xiàn):隨著底物濃度的增加焦性沒食子酸的收率不斷上升，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.4%時，焦性沒食子酸的收率達到57.98%，此后趨于平穩(wěn)；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.7%時，收率達到最大為65.27%，但從經(jīng)濟效益考慮選擇底物濃度為0.4%為宜；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.8、0.9、1.0%時未檢測出焦性沒食子酸，原因是因為沒食子酸本身作為一種酸對培養(yǎng)基的PH的存在影響，過高的底物濃度會對培養(yǎng)基的pH改變較大，從而抑制了產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)生GAD，這樣就無法降解沒食子酸產(chǎn)生焦性沒食子酸。
[0075](3)磷酸鹽緩沖溶液的含量對于焦性沒食子酸收率的影響
[0076]配制CDM培養(yǎng)基，組成為0.4%沒食子酸，0.5 %麥芽糖，0.06 % Mg (SO4) 2，0.4 %(NH4)2S04，10、30、50、70、90、110mM磷酸鹽緩沖溶液各兩個，將沒食子酸、麥芽糖以及剩余鹽溶液分開滅菌后，分別混合裝到12瓶250mL的三角燒瓶里，分別接入5mL菌液于12瓶三角燒瓶中，然后放入轉(zhuǎn)速180r/min、溫度30°C的往復(fù)式水浴恒溫?fù)u床中發(fā)酵60h。取樣20mL,在轉(zhuǎn)速為6000r/min的條件下離心20min,然后用乙醚萃取兩次,每次乙醚用量30mL ;再進行濃縮，得到焦性沒食子酸樣品。樣品用5mL流動相溶解，然后用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾至1mL的一次性離心管中，最后HPLC檢測分析。結(jié)果見附圖5，可以發(fā)現(xiàn):隨著磷酸鹽緩沖溶液體積的上升，焦性沒食子酸的收率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)磷酸鹽緩沖溶液含量為70mM時收率達到最大為56.39%。當(dāng)磷酸鹽緩沖溶液含量為10、30mM時未檢測出焦性沒食子酸，可能是由于磷酸鹽緩沖溶液主要作用是調(diào)節(jié)平衡培養(yǎng)基的PH，所以過少的磷酸鹽無法發(fā)揮作用，在培養(yǎng)基滅菌和在后續(xù)的培養(yǎng)過程中由于菌種本身的發(fā)酵使得培養(yǎng)基的PH改變較大卻無法平衡，故導(dǎo)致較少的磷酸鹽緩沖溶液沒有焦性沒食子酸的產(chǎn)生。當(dāng)磷酸鹽溶液含量大于70mM時，由于高濃度磷酸鹽對培養(yǎng)基溶液的鹽濃度的改變，使得菌種細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了相應(yīng)的改變，從而導(dǎo)致了整體上菌種活性的下降，如細(xì)胞產(chǎn)生GAD的減少，故隨著磷酸鹽含量的增加，焦性沒食子酸的收率逐漸下降。因此，綜合考慮，在實際的后續(xù)試驗中選擇50mM的磷酸鹽緩沖溶液的含量作為最佳選擇。
[0077](4)發(fā)酵時間對于焦性沒食子酸收率的影響
[0078]配制CDM培養(yǎng)基，組成為0.4%沒食子酸，0.5%麥芽糖，0.06% Mg (S04) 2,0.4 %(NH4) 2S04，70mM磷酸鹽緩沖溶液，將沒食子酸、麥芽糖以及剩余鹽溶液分開滅菌后，混合裝到13瓶250mL的三角燒瓶里，分別接入5mL菌液，然后放入轉(zhuǎn)速180r/min、溫度30°C的往復(fù)式水浴恒溫?fù)u床中分別發(fā)酵0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132h。將上述發(fā)酵好的13瓶三角燒瓶取出至雙人單面凈化工作臺中，每瓶取樣20mL，在轉(zhuǎn)速為6000r/min的條件下離心20min ;然后，用乙醚萃取兩次，每次乙醚用量30mL ;再進行濃縮，得到焦性沒食子酸樣品。樣品用5mL流動相溶解，然后用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾至1mL的一次性離心管中，最后HPLC檢測分析。結(jié)果見附圖6，可以發(fā)現(xiàn):隨著發(fā)酵時間的增加，焦性沒食子酸的收率呈先上升后下降的趨勢，并且在24~48h和72~120h趨于穩(wěn)定，當(dāng)發(fā)酵時間達到60h時焦性沒食子酸收率達到最大為63.41%。當(dāng)發(fā)酵時間小于60h時由于菌種本身接種到一個新的培養(yǎng)基上需要一定的時間進行調(diào)整，因此在發(fā)酵開始的時候隨著時間的延長，焦性沒食子酸的收率越來越大；當(dāng)發(fā)酵時間大于72~120h時由于菌種經(jīng)歷了調(diào)整期、增長期開始進入穩(wěn)定期，因此這個過程中，菌種數(shù)量上基本上變化不大，因此這個過程中的焦性沒食子酸的收率基本上趨于穩(wěn)定；120h之后菌種逐步進入到衰亡期，培養(yǎng)基的內(nèi)部環(huán)境也由于發(fā)酵等原因，如PH和營養(yǎng)物質(zhì)開始大量減少，因此這個過程中的焦性沒食子酸的收率是逐漸下降的。
[0079](5)發(fā)酵溫度對于焦性沒食子酸收率的影響
[0080]配制CDM培養(yǎng)基，組成為0.4%沒食子酸，0.5%麥芽糖，0.06% Mg (S04) 2,0.4 %(NH4) 2S04，35mL磷酸鹽緩沖溶液，將沒食子酸、麥芽糖以及剩余鹽溶液分開滅菌后，混合裝到21瓶250mL的三角燒瓶里，分別接入5mL菌液。每3瓶三角燒瓶為一組，放入轉(zhuǎn)速180r/min往復(fù)式水浴恒溫?fù)u床中在溫度分別為20、25、30、35、40、45、50°C的條件下發(fā)酵60h。將上述發(fā)酵好的14瓶三角燒瓶取出至雙人單面凈化工作臺中，每瓶取樣20mL，，在轉(zhuǎn)速為6000r/min的條件下離心20min ;然后,用乙醚萃取兩次,每次乙醚用量30mL ;再進行濃縮，得到焦性沒食子酸樣品。樣品用5mL流動相溶解，然后用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾至1mL的一次性離心管中，最后HPLC檢測分析。結(jié)果見附圖7，可以發(fā)現(xiàn):剛開始隨著溫度的上升焦性沒食子酸的收率變化并不大，當(dāng)溫度達到35°C時，收率達到最大值為63.56%,隨著溫度的繼續(xù)升高，收率在下降，在溫度為45、50°C時未檢測出焦性沒食子酸。原因是過高的溫度破壞了酶的產(chǎn)生的環(huán)境以及所產(chǎn)生的GAD的本身的穩(wěn)定性，因此后續(xù)試驗中45、50°C時菌種無法降解沒食子酸產(chǎn)生焦性沒食子酸。
[0081](6)初始pH值對于焦性沒食子酸收率的影響
[0082]配制CDM培養(yǎng)基，組成為0.4%沒食子酸，0.5%麥芽糖，0.06% Mg (S04) 2,0.4 %(NH4)2S04，35mL磷酸鹽緩沖溶液，將沒食子酸、麥芽糖以及剩余鹽溶液分開滅菌后(滅菌條件參考2.3.3)，混合裝到12瓶250mL的三角燒瓶里。每3瓶為一組，分別調(diào)pH為5.6、6.0、6.4、6.8。在雙人單面凈化工作臺中用移液槍分別接入5mL備用菌液于12瓶三角燒瓶中。然后放入轉(zhuǎn)速180r/min、溫度30°C的往復(fù)式水浴恒溫?fù)u床中分別發(fā)酵60h。將上述發(fā)酵好的12瓶三角燒瓶取出至雙人單面凈化工作臺中，每瓶取樣20mL。將取樣后的菌液放入離心機中，在轉(zhuǎn)速為6000r/min的條件下分離20min。分離好的菌液用乙醚萃取兩次，每次乙醚用量30mL。再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進行濃縮，得到焦性沒食子酸樣品。結(jié)果見附圖8，可以發(fā)現(xiàn):樣品用5mL流動相溶解，然后用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾至1mL的一次性離心管中，最后HPLC檢測分析。隨著初始pH的上升，焦性沒食子酸的收率不斷下降，最大值為初始pH5.6時的70.79%，最小值為pH6.8時的29.27%，當(dāng)初始pH為5.2和7.2時，并未檢測出焦性沒食子酸。由上述表圖可以看出，培養(yǎng)基PH對菌種的影響是很大的，因此在此單因素實驗中，過高或者過低的初始pH的培養(yǎng)基下，都不會使沒食子酸降解產(chǎn)生焦性沒食子酸，因此實驗的最適初始pH可以選擇在5.6~6.0。
[0083]實施例4.響應(yīng)面優(yōu)化工藝
[0084]在上述單因素結(jié)果中，可以發(fā)現(xiàn)微生物降解過程中底物濃度、pH值、溫度三個因素，各個因素之間有較大的相互影響，另外底物沒食子酸，本身作為一種酸，對發(fā)酵液的PH值的也有一定的影響。因此，為了更進一步的了解各個因素對焦性沒食子酸收率的影響，該實驗部分利用Box-Behnken實驗設(shè)計進行3因素3水平的響應(yīng)面分析，建立分析模型，找到收率最大的區(qū)域。
[0085]表1響應(yīng)面分析實驗因素水平
[0086]

【權(quán)利要求】
1.一種高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于由以下步驟組成: 第一步，培養(yǎng)基制備 (1)種子培養(yǎng)基稱取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g在IL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，用lmol/L鹽酸將pH值調(diào)至6.5~7.0，在121°C下滅菌20min，冷卻后為種子培養(yǎng)基; (2)試管斜面保藏培養(yǎng)基稱取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g、瓊脂15.0g，在IL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，用lmol/L鹽酸將pH值調(diào)至6.5~7.0，在121°C下滅菌20min，冷卻后為試管斜面保藏培養(yǎng)基； (3)發(fā)酵培養(yǎng)基成團泛菌發(fā)酵培養(yǎng)基:0.3%沒食子酸、0.5%丙三醇、0.5%蛋白胨、.0.001% FeSO4.7Η20、0.1% ΚΗ2Ρ04、0.05% MgSO4.7Η20、1.0 %酵母提取物;弗氏檸檬酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:2.0 % 沒食子酸、0.2% (NH4) 2ΗΡ04、0.1% ΚΗ2Ρ04、0.05% MgSO4.7Η20、0.05%酵母提取物；克雷伯氏菌發(fā)酵培養(yǎng)基:1.0 %沒食子酸、3.0% C13H15N3O2 (4-氨酰安替比林)、.2.0% (NH4)2SO4^0.8M 飽和 Na2B4O7.1H2 水溶液、0.5M Na2HPO4.12H20 緩沖溶液(ρΗ7.2 可由 12.535g Na2H PO4.Iffi2O 或者 4.969g Na2HPO4 與 2.340g NaH2PO4.2H20 溶于 10mL 蒸餾水制得)；氧化還原真桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:30mM C6H7O8Na, 30mM HCOONa.2Η20、I %細(xì)菌瓊脂粉、.0.2%沒食子酸；植物乳桿菌、解沒食子酸鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)基:包含5.0%去纖維蛋白的馬血、20mM沒食子酸的肉湯培養(yǎng)基；黏紅酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)基:0.5% C6H12O6^0.9% NaCU0.5mM沒食子酸、0.5%酵母提取物；腸桿菌屬、產(chǎn)氣腸桿菌屬發(fā)酵培養(yǎng)基:0.06% MgSO4.7H20、.0.4% (NH4)2S04、0.2%~0.5%沒食子酸、0.5%麥芽糖并取30mM pH值為6.0~7.0的磷酸鹽緩沖溶液，其中沒食子酸于100°C下滅菌5min，麥芽糖于115°C下滅菌30min，其余成分在121°C下滅菌20min，制備發(fā)酵培養(yǎng)基； 第二步，沒食子酸脫羧酶(GAD)的高產(chǎn)菌種篩選 初篩的方法:將培養(yǎng)好的克雷伯氏菌(K.aerogenes)、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬Φ.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、成團泛菌(P.agglomerans)、氧化還原真桿菌(E.0xidoreducens)、植物乳桿菌(L.planetarium)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)、黏紅酵母菌(R.glutinis)等菌液,分別放入相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，如腸桿菌屬(E.sp.)、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)的發(fā)酵培養(yǎng)基如第一步中所示,溫度30~37°C，每隔12h取樣一次，然后取用3倍體積的乙醚萃取發(fā)酵液3次，合并萃取液，減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，經(jīng)TLC和HPLC分析沒食子酸和焦性沒食子酸，篩選出高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)的產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)和黏紅酵母菌(R.glutinis)； 第三步，菌種底物誘導(dǎo) 配制 CDM 缺碳培養(yǎng)基:0.06% MgSO4.7Η20、0.4% (NH4)2SO4^0.2%沒食子酸及 30mM pH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液，將培養(yǎng)好的斜面菌種以無菌操作取兩環(huán)，轉(zhuǎn)接到10mL CDM培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在水浴溫度為25~30°C，轉(zhuǎn)速為180~200r/min的搖床中培養(yǎng)，每12h取樣一次，HPLC檢測發(fā)酵液中沒食子酸和焦性沒食子酸； 第四步，種子液制備及發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的斜面菌種以無菌操作取五環(huán)，轉(zhuǎn)接到10mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，溫度30~40°C，靜置培養(yǎng)6~8h，將培養(yǎng)好的菌液按照4~6%接種量，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度30~35°C，180~200r/min搖床培養(yǎng)50~70h ； 第五步，搖瓶生理脅迫培養(yǎng)及響應(yīng)面優(yōu)化 通過考察接種量、發(fā)酵時間、磷酸鹽濃度、底物濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液起始PH值等因素對焦性沒食子酸的收率的單因素影響，采用Box-Behnken實驗設(shè)計進行3因素(底物濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液起始PH值)3水平的響應(yīng)面優(yōu)化，并進行驗證； 第六步，發(fā)酵液中焦性沒食子酸提取 取第五步最佳工藝條件下發(fā)酵液原液，于6000r/min條件下離心20min,取上清液用其體積3倍的有機溶劑萃取3次，合并萃取相、濃縮，得焦性沒食子酸濃縮物； 第七步，中壓柱分離制備 將焦性沒食子酸濃縮物與中壓柱填料按質(zhì)量比1: 10~30吸附，洗脫劑為甲基叔丁基醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水中的I種或幾種的混合溶液，中壓柱柱長20~300cm,柱直徑2~30cm,柱壓為3~1MPa,檢測波長220~360nm,流速2~lOOmL/min,富集焦性沒食子酸，室溫真空回收溶劑，經(jīng)HPLC分析，制備得到98%以上焦性沒食子酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于步驟2中產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)等菌種具有降解沒食子酸生產(chǎn)焦性沒食子 酸的能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于權(quán)利I中沒食子酸和焦性沒食子酸TLC條件為:展開劑為乙醚:乙醇=7: 3 ;顯色劑:碘蒸氣。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于權(quán)利I中焦性沒食子酸HPLC條件為:色譜柱Thermo0DS-2C18(5ym250X4.6mm)分離柱，流動相為甲醇-水(含 0.5%醋酸)=37-63 (v/v)，通過0.45 μ m孔徑濾膜過濾,流速:lmL/min,檢測波長:263nm,檢測器:PDA 二極管陣列檢測器，檢測溫度:室溫。焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= 1318523.5X+6474.1，相關(guān)系數(shù)R =0.99951。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于第五步焦性沒食子酸收率測定計算公式為: 焦性沒食子酸收率y = (5 XcA1) Xv0Ai0X 100% ； 式中 V1:有機溶劑萃取體積；V(1:菌種發(fā)酵液實際體積噸:焦性沒食子酸的理論產(chǎn)量；c:HPLC檢測時菌種發(fā)酵液中焦性沒食子酸濃度；數(shù)字5:進行檢測的萃取液濃縮后用5mL流動相溶解的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于步驟中第六步萃取用的有機溶劑，選自乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯等其中I種或任2種混合溶劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于第七步中壓柱填料，選擇200~300目的硅膠和氧化鋁中的I種或2種任意比，洗脫劑為甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙醚、正丁醇和乙醇中的I種或幾種的混合溶液，優(yōu)選乙醚:乙醇=50:1~30 (v/v)混合溶劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于第七步中壓柱填料，選擇孔徑為60A，40~60μπι的ODS C18、C8和S^hedex LH-20材料中任一種，洗脫劑為乙酸乙酯、乙醚和乙醇的I種或者幾種的混合溶液，優(yōu)選1~20% (v/v)的乙醇水溶液。
【文檔編號】C12Q1/14GK104178552SQ201410366064
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】王成章, 李文君, 閔凡芹 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所