Amz1基因在制備診斷試劑盒中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了AMZ1基因在制備診斷結(jié)腸癌的試劑盒中的用途。本發(fā)明利用NCBI?GEO數(shù)據(jù)檢索將符合要求的5套結(jié)腸癌病例和正常人群基因組mRNA表達芯片數(shù)據(jù)納入研究范圍，通過對上述芯片數(shù)據(jù)進行Meta分析，篩選出AMZ1基因是差異顯著基因，相比正常組織，AMZ1基因在結(jié)腸癌組織中表達下調(diào)，并使用熒光實時定量PCR方法驗證了上述結(jié)論。據(jù)此，本發(fā)明還公開了一種診斷結(jié)腸癌的試劑盒以及利用該試劑盒診斷結(jié)腸癌的方法。本發(fā)明一方面為研究結(jié)腸癌的分子機理提供新的思路，另一方面為早期診斷結(jié)腸癌提供了更為靈敏的診斷試劑盒。
【專利說明】AMZ1基因在制備診斷試劑盒中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種結(jié)腸癌診斷試劑盒及AMZl基因在制備結(jié)腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]在轉(zhuǎn)錄組研究中應(yīng)用最早及最廣泛的為基因芯片技術(shù)，首先從待檢測樣品中提取RNA,并利用熒光標記的核苷酸將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)過標記的核苷酸序列可與基因芯片特定位點上的探針雜交，經(jīng)檢測雜交信號而獲取細胞基因表達信息?；蛐酒夹g(shù)已成為一項非常穩(wěn)定可信的實驗技術(shù)，目前公布的大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)主要是利用基因芯片技術(shù)產(chǎn)生的。
[0003]結(jié)腸癌是男性和女性第三位的常見惡性腫瘤，2013年美國癌癥統(tǒng)計報告中指出2012年度美國結(jié)腸癌新發(fā)病例103170。而在我國，隨著近年來生活方式和飲食習慣的改變，結(jié)腸癌發(fā)病及死亡均快速攀升，據(jù)2011年統(tǒng)計結(jié)果顯示，結(jié)腸癌位居我國惡性腫瘤發(fā)病率第三位，是第四位導(dǎo)致死亡的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均已接近同時期世界水平，成為嚴重威脅人群生命健康的公共衛(wèi)生問題。結(jié)腸癌的發(fā)病機制尚未完全闡明，但病因?qū)W研究已經(jīng)表明，絕大部分結(jié)腸癌的發(fā)生是一個多步驟、多階段，環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的復(fù)雜過程。它的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因的改變，表現(xiàn)為多基因多步驟的協(xié)同累積以及相互作用。近些年，國內(nèi)外已應(yīng)用基因芯片及高通量篩選等技術(shù)對結(jié)腸癌基因表達譜進行了較多研究。但是不同的實驗平臺及樣本的差異導(dǎo)致分析結(jié)果存在很多不一致性。
[0004]Meta分析可對同一個問題所發(fā)表相關(guān)研究報告的結(jié)果進行收集、統(tǒng)計上的整合，以期獲得更準確或更多的結(jié)果。這個分析能產(chǎn)生很多顯著的差異表達基因，能避免單個研究帶來的不正確性。Meta分析是在多個芯片實驗研究中識別差異表達基因的強有力工具。此外，用Meta分析能識別出單個研究不能識別的差異基因，并且能有效地降低單個芯片數(shù)據(jù)的假陽性。
[0005]本發(fā)明通過對已發(fā)表的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)進行Meta分析，篩選出影響結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，并使用熒光實時定量PCR(QPCR)檢測驗證臨床樣本中的表達，本發(fā)明通過生物信息學手段發(fā)掘這些基因在結(jié)腸癌中的作用，從而對結(jié)腸癌的發(fā)病機理進行探究，為其診斷和治療提供一定的研究基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明通過對已發(fā)表的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)進行Meta分析和QPCR驗證，發(fā)現(xiàn)AMZl基因在結(jié)腸癌組織中的表達與在正常組織中的表達存在差異。與正常組織相比，AMZl基因在結(jié)腸癌組織中表達下調(diào)，通過檢測AMZl基因轉(zhuǎn)錄水平的表達情況，可以判斷受試者是否患有結(jié)腸癌。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供AMZl基因在制備結(jié)腸癌診斷試劑盒中的用途。所述診斷試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈式反應(yīng)體系、用于擴增AMZl基因和管家基因的引物對。SYBR Green聚合酶鏈式反應(yīng)體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0008]上述技術(shù)方案中，PCR緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)選地，PCR緩沖液包含:25mM KCl, 2.5mM MgCl2, 200mM(NH4)2SO40
[0009]引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)引物設(shè)計的常規(guī)設(shè)計原則設(shè)計。優(yōu)選的實施方案中，擴增AMZI基因的正向引物序列為5，-AAGAACAACAAGCCAGGGGACG-3 ’，反向引物序列為5’ -CTGGAAGGAACTTGCTGAAGGTGA-3，；管家基因優(yōu)選GAPDH，擴增該基因的正向引物序列為5’ -1TTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列為 5’ -GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
[0010]在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系，該逆轉(zhuǎn)錄體系包含:τ重復(fù)寡核苷酸Oligo (dT)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。
[0011]優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含:250mMPH8.3 的 Tris-HCL，375mM 的 KCL，15mM 的 MgCl2,50mM 的 DTT。
[0012]RNA酶抑制劑可選用本領(lǐng)域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為大腸桿菌表達的非競爭性抑制RNA酶的重組蛋白酶。
[0013]在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑，RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
[0014]本發(fā)明的診斷試劑盒保存于_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0015]本發(fā)明的又一個目的在于提供一種診斷結(jié)腸癌的試劑盒。所述診斷試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈式反應(yīng)體系、用于擴增AMZl基因和管家基因的引物對。所述SYBRGreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0016]上述技術(shù)方案中，PCR緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)選地，PCR緩沖液包含:25mM KCl, 2.5mM MgCl2, 200mM(NH4)2SO40
[0017]引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)引物設(shè)計的常規(guī)設(shè)計原則設(shè)計；優(yōu)選的實施方案中，擴增AMZI基因的正向引物序列為5，-AAGAACAACAAGCCAGGGGACG-3 ’，反向引物序列為5’ -CTGGAAGGAACTTGCTGAAGGTGA-3’ ；管家基因優(yōu)選GAPDH，擴增該基因的正向引物序列為5’ -1TTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列為 5’ -GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
[0018]在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系，該逆轉(zhuǎn)錄體系包含:τ重復(fù)寡核苷酸Oligo (dT)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。
[0019]優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含:250mMPH8.3 的 Tris-HCL，375mM 的 KCL，15mM 的 MgCl2,50mM 的 DTT。
[0020]RNA酶抑制劑可選用本領(lǐng)域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為大腸桿菌表達的非競爭性抑制RNA酶的重組蛋白酶。
[0021]在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑，RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
[0022]本發(fā)明還提供了診斷結(jié)腸癌的方法，所述方法包括:
[0023](I)利用RNA提取試劑提取樣本總RNA ；
[0024](2)將步驟(1)獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
[0025](3)在熒光實時定量PCR儀上將AMZl基因和管家基因進行擴增檢測；
[0026](4)通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Δ ACT法進行相對定量；
[0027](5) AMZl基因表達下調(diào)，表明研究對象為結(jié)腸癌患者。
[0028]步驟(1)的具體實施方法為:收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預(yù)冷的研缽中進行研磨，待組織樣本成粉末狀后:
[0029]①加入Trizol,室溫保存5min ；
[0030]②加氯仿0.2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5min-10min ；
[0031]③12000rpm高速離心15min后吸取上層水相(吸70%)到另一新離心管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的_20°C預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上1min ；
[0032]④12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液,按lml/ml Trizol的比例加入75%DEPC乙醇洗滌沉淀(4°C保存)，洗滌沉淀物，振蕩混合，4°C下12000rpm高速離心5min ；
[0033]⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；
[0034]⑥用NanOdrOp2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于_70°C。
[0035]步驟(2)的具體實施方法為:用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對IygS RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用25 μ I反應(yīng)體系，每個樣品取IygS RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分:DEPC水，5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmol/L dNTP，0.lmmol/1 DTT, 30 μ mmol/1 OligodT, 200U/ μ I M-MLV RT，模板 RNA。42°C孵育 lh，72°C lOmin，短暫離心。
[0036]步驟(3)的具體實施方法為:采用25μ I反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)置3個平行管，所有擴增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。配制以下反應(yīng)體系=SYBRGreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系12.5 μ 1，正向引物(5 μ M/μ I) I μ 1，反向引物(5 μ M/μ I) I μ 1，模板cDNA 2.0 μ 1，無酶水8.5 μ I ;擴增AMZl基因的正向引物序列為5’ -AAGAACAACAAGCCAGGGGACG-3’，反向引物序列為 5’ -CTGGAAGGAACTTGCTGAAGGTGA-3’ ；擴增GAPDH基因的正向引物序列為5 ’ -TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3 ’，反向引物序列為5’ -GGTGGAATCATATTGGAACA-3’，各項操作均于冰上進行。擴增程序為:95°C 1min,(95°〇158，601:608)*45個循環(huán)。以SYBR Green作為熒光標記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Λ Λ CT法進行相對定量。
[0037]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果在于:(I)本發(fā)明首次公開了 AMZl基因與結(jié)腸癌相關(guān)，AMZl基因有望成為診斷結(jié)腸癌的分子標志物，并為研究結(jié)腸癌的分子機理提供新的思路。
(2)利用檢測基因表達的方式診斷結(jié)腸癌的存在與否的方法更加靈敏，有利于疾病早期的診斷。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0038]圖1表示熒光實時定量PCR測定在正常組織和結(jié)腸癌組織中AMZl基因mRNA的相對表達量。
[0039]具體的實施方式:
[0040] 下面結(jié)合具體的實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不意味著限制本發(fā)明的保護范圍。
[0041]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043]實施例1篩選與結(jié)腸癌相關(guān)的基因
[0044]1.1 NCBI GEO (Gene Express1n Omnibus)數(shù)據(jù)檢索
[0045]GEO(Gene Express1n Omnibus)數(shù)據(jù)庫是由NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心)開發(fā)維護，GEO數(shù)據(jù)庫作為最大的基因表達數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫以芯片數(shù)據(jù)為主，此外亦包含一些非芯片類型的數(shù)據(jù)如SAGE (基因表達系列分析)數(shù)據(jù)、SARST (核糖體序列標簽連續(xù)分析)數(shù)據(jù)、MS (質(zhì)譜)數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和新一代高通量測序數(shù)據(jù)(MPSS，大規(guī)模平行測序技術(shù))等。
[0046]a.檢索關(guān)鍵詞:("colorectal cancer" [MeSH Terms] OR^colorectal cancer"
[0047][All Fields])AND^Homo sapiens"[porgn]
[0048]b.研究中的樣本篩選策略:
[0049]限制研究類型為“express1n profiling by array”符合以下標準的數(shù)據(jù)集將納入我們的研究中:①所選數(shù)據(jù)集必須是全基因組的表達mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，且都為RNA-seq數(shù)據(jù)集；②這些數(shù)據(jù)來自于大腸癌病例組和對照組的活檢組織或培養(yǎng)的細胞；③本研究均考慮經(jīng)標準化或者原始數(shù)據(jù)集；最后，有5套RNA-seq數(shù)據(jù)集納入我們的研究中(表1)。
[0050]表1 8套結(jié)腸癌全基因組數(shù)據(jù)集的基本情況
[0051]

【權(quán)利要求】
1.AMZl基因在制備結(jié)腸癌診斷試劑盒中的用途，其特征在于，所述診斷試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈式反應(yīng)體系、用于擴增AMZl基因和管家基因的引物對；所述SYBRGreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系包含:PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述擴增AMZl基因的引物對的序列如下:正向引物序列為5’ -AAGAACAACAAGCCAGGGGACG-3’，反向引物序列為5，-CTGGAAGGAACTTGCTGAAGGTGA-3，;所述管家基因是GAPDH，擴增GAPDH基因的正向引物序列為 5’ -1TTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列為 5’ -GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述PCR緩沖液包含:25mMKCL、2.5mMMgCL2,200mM (NH4)2SO40
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的用途，其特征在于，所述診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系或RNA提取試劑；所述逆轉(zhuǎn)錄體系包含T重復(fù)寡核苷酸Oligo dT、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs ;所述RNA提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含:250mMPH8.3的Tris-HCL、375mM 的 KCL、15mM 的 MgCL2、50mM 的 DTT。
6.—種結(jié)腸癌的診斷試劑盒,其特征在于,所述診斷試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈式反應(yīng)體系、用于擴增AMZl基因和管家基因的引物對；所述SYBR Green聚合酶鏈式反應(yīng)體系包含:PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述擴增AMZl基因的引物對的序列如下:正向引物序列為5 ’ -AAGAACAACAAGCCAGGGGACG-3 ’，反向引物序列為5，-CTGGAAGGAACTTGCTGAAGGTGA-3 所述管家基因是GAPDH，擴增GAPDH基因的正向引物序列為 5’ -1TTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列為 5’ -GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液包含:25mMKCL、2.5mM MgCL2,200mM(NH4)2SO40
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系或RNA提取試劑；所述逆轉(zhuǎn)錄體系包含T重復(fù)寡核苷酸Oligo dT、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs ;所述RNA提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含:250mMPH8.3 的 Tris-HCL、375mM 的 KCL、15mM 的 MgCL2、50mM 的 DTT。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131103SQ201410389636
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】肖文華, 屈雪玲, 王碩, 李小梅, 董偉偉, 趙慧霞 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院