本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別涉及基因的甲基化檢測。

背景技術(shù)：

本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種能夠提高基因甲基化檢測靈敏度的方法及其試劑盒。DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它是腫瘤發(fā)生的一個早期事件，由于CPG島的高度甲基化早于腫瘤增生，故檢測某些DNA位點的甲基化可以作為腫瘤標(biāo)志物，是腫瘤早期輔助診斷、患病預(yù)測及療效評估的一個潛在指標(biāo)。DNA甲基化分析通常需要對DNA進行高溫硫化轉(zhuǎn)化修飾。高溫硫化轉(zhuǎn)化后，雙鏈DNA會解離成兩條不互補的單鏈。目前在現(xiàn)有的甲基化檢測技術(shù)中還沒有同時檢測同一基因兩條單鏈的甲基化總體水平的先例，現(xiàn)有的基因甲基化檢測技術(shù)都是針對一條單鏈進行PCR反應(yīng)，從而檢測基因甲基化情況。在某類腫瘤檢測中，DNA甲基化的程度不是很明顯，單鏈檢測基因甲基化的靈敏度較低，必須采用定量法才可確定基因甲基化的程度，進而區(qū)分癌與非癌。定量法分析較為麻煩復(fù)雜，遠(yuǎn)不如定性法分析簡單。單鏈檢測基因甲基化沒有充分考慮基因兩條鏈甲基化的總體水平。例如申請?zhí)枮?01610264899.7《一種人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒及檢測方法》。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明其中一個目的在于提高基因甲基化檢測靈敏度，能夠充分檢測基因兩條鏈的甲基化總水平。以內(nèi)參基因為標(biāo)準(zhǔn)衡量本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性和有效性。

本發(fā)明提供了一種基因甲基化檢測方法，該方法首先針對目的基因設(shè)計目的基因甲基化正義鏈的引物對和目的基因甲基化反義鏈的引物對，以及設(shè)計檢測目的基因甲基化的正、反義鏈的兩條探針，目的基因甲基化正義鏈的引物對為目的基因甲基化正義鏈的正向引物和目的基因甲基化正義鏈的反向引物，目的基因甲基化反義鏈的引物對為目的基因甲基化反義鏈的正向引物和目的基因甲基化反義鏈的反向引物，目的基因甲基化的正、反義鏈的兩條探針分別為目的基因甲基化正義鏈探針和目的基因甲基化反義鏈探針。由于該方法考慮基因兩條鏈甲基化的情況設(shè)計相關(guān)引物和探針，使用設(shè)計的引物和探針可以檢測目的基因甲基化的整體水平。以內(nèi)參基因為標(biāo)準(zhǔn)衡量本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性和有效性。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，目的基因為septin9基因，所述septin9甲基化位點為啟動子區(qū)的CpG島，序列為轉(zhuǎn)錄起始位點上游的-670～-555bp區(qū)；

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，

目的基因septin9甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.1：

5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’

目的基因septin9甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.2：

5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’

目的基因septin9甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.3：

5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’

目的基因septin9甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.4：

5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，

目的基因septin9甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.5：

5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’

目的基因septin9甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.6：

5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，目的基因septin9甲基化正義鏈探針、目的基因septin9甲基化反義鏈探針5'端報告熒光基團為FAM，目的基因septin9甲基化正義鏈探針、目的基因septin9甲基化反義鏈探針3'端的猝滅基團為BHQ1。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，使用內(nèi)參基因甲基化的引物對和內(nèi)參基因甲基化探針，內(nèi)參基因為ACTB，

內(nèi)參基因引物序列如SEQ No.7：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，

內(nèi)參基因引物序列如SEQ No.8：

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，

內(nèi)參基因甲基化探針序列如SEQ No.9：

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，方法步驟為：

A、從待測樣本中提取DNA，

B、對提取的DNA進行硫化轉(zhuǎn)化修飾，

C、對修飾后的DNA進行純化，得到樣本模板，

D、將所述目的基因甲基化正義鏈的正向引物、目的基因甲基化正義鏈的反向引物、目的基因甲基化反義鏈的正向引物序、所述目的基因甲基化反義鏈的反向引物、目的基因甲基化正義鏈探針和目的基因甲基化反義鏈探針、內(nèi)參基因甲基化的引物對和內(nèi)參基因甲基化探針以及所述樣本模板同時加到同一孔中進行PCR擴增反應(yīng)，

E、計算目的基因正、反義雙鏈熒光累積法中septin9基因CP值；以內(nèi)參基因為標(biāo)準(zhǔn)衡量本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性和有效性。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，PCR擴增反應(yīng)體系的終濃度組成為：1～10×PCR緩沖液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM目的基因甲基化正義鏈的引物對、0.1～1uM目的基因甲基化反義鏈的引物對、0.05～2ng/ul模板DNA、0.1～1uM目的基因甲基化正義鏈探針、0.1～1uM目的基因甲基化反義鏈探針、0.01～0.10U/ul TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化鎂，0.1～1uM內(nèi)參基因甲基化引物對，0.1～1uM內(nèi)參基因甲基化探針。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，目的基因為HOXA9基因，

目的基因HOXA9甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.10：

5’-TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG-3’

目的基因HOXA9甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.11：

5’-AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG-3’

目的基因HOXA9甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.12：

5’-CGTTCGCGTTTTTATTGGTC-3’

目的基因HOXA9甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.13：

5’-CGAACCATTAATAACGTACGAA-3’

目的基因HOXA9甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.14：

5’-AAATTACCGACGCCCGCG-3’

目的基因HOXA9甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.15：

5’-AAACGAACACGTAACGCG-3’；

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種直腸癌檢測方法，使用上述的基因甲基化檢測方法檢測目的基因甲基化程度判斷是否患有直腸癌；

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測試劑盒，包含目的基因甲基化正義鏈的正向引物、目的基因甲基化正義鏈的反向引物、目的基因甲基化反義鏈的正向引物、目的基因甲基化反義鏈的反向引物、目的基因甲基化正義鏈探針和目的基因甲基化反義鏈探針；

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測試劑盒，

目的基因甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.1：

5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’，

所述目的基因甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.2：

5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’，

所述目的基因甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.3：

5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’，

所述目的基因甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.4：

5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’，

所述目的基因甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.5：

5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’，

所述目的基因甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.6：

5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’，上述的目的基因為septin9。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測試劑盒，

目的基因甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.10：

5’-TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG-3’

目的基因甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.11：

5’-AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG-3’

目的基因甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.12：

5’-CGTTCGCGTTTTTATTGGTC-3’

目的基因甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.13：

5’-CGAACCATTAATAACGTACGAA-3’

目的基因甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.14：

5’-AAATTACCGACGCCCGCG-3’

目的基因甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.15：

5’-AAACGAACACGTAACGCG-3’，上述的目的基因為HOXA9。

根據(jù)本發(fā)明的一些方面，還提供了一類基因甲基化檢測試劑盒，目的基因甲基化正義鏈探針、目的基因甲基化反義鏈探針5'端報告熒光基團為FAM，目的基因甲基化正義鏈探針、目的基因甲基化反義鏈探針3'端的猝滅基團為BHQ1；

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含內(nèi)參基因甲基化的引物對和內(nèi)參基因甲基化探針，所述內(nèi)參基因為ACTB，

內(nèi)參基因引物序列如SEQ No.7：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，

所述內(nèi)參基因引物序列如SEQ No.8：

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，

所述內(nèi)參基因甲基化探針序列如SEQ No.9：

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’

根據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測試劑盒的應(yīng)用，基因甲基化檢測試劑盒用于直腸癌檢測。

本發(fā)明的整體思路如下：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種可以提高基因甲基化檢測靈敏度的方法，該檢測方法充分利用基因甲基化的兩條鏈，操作簡便、特異性強且檢測靈敏度高。

本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是：利用雙鏈檢測提高基因甲基化檢測的靈敏度，本發(fā)明的方法中包含目的基因甲基化正義鏈的引物對和目的基因甲基化反義鏈的引物對，作為衡量標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)參基因ACTB甲基化的通用引物對和探針，以及檢測目的基因甲基化的正、反義鏈的兩條探針。

本發(fā)明的一個目的基因為septin9基因；septin9甲基化位點為啟動子區(qū)的CpG島，序列為轉(zhuǎn)錄起始位點上游的-670～-555bp區(qū)。針對該位點，本發(fā)明設(shè)計的目的基因甲基化正、反義鏈的引物對序列如下所示。

目的基因甲基化正義鏈的正向引物：5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’；

目的基因甲基化正義鏈的反向引物：5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’；

目的基因甲基化反義鏈的正向引物：5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’；

目的基因甲基化反義鏈的反向引物：5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；

本發(fā)明的septin9甲基化基因的正、反義鏈探針5'端報告熒光基團為FAM，septin9甲基化基因的正、反義鏈探針3'端的猝滅基團為BHQ1。針對septin9甲基化位點設(shè)計的檢測目的基因甲基化正、反義鏈的兩個探針序列如下所示。

目的基因甲基化正義鏈探針序列：5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’；

目的基因甲基化反義鏈探針序列：5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’；

本發(fā)明的內(nèi)參ACTB甲基化基因的引物對和探針，序列如下：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’

本發(fā)明所述的方法還包括其他PCR擴增的常規(guī)試劑，主要包括：DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、PCR buffer等。所述PCR擴增反應(yīng)體系的終濃度組成為：1～10×PCR緩沖液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM septin9甲基化正義鏈引物對、0.1～1uM septin9甲基化反義鏈引物對、0.1～1uM ACTB甲基化通用引物對、0.05～2ng/ul模板DNA、0.1～1uM septin9甲基化正義鏈探針、0.1～1uM septin9甲基化反義鏈探針、0.1～1uM ACTB甲基化通用探針、0.01～0.10U/ul TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化鎂。

本發(fā)明的一種檢測步驟如下：

(1)從待測樣本中提取DNA。

(2)將提取后的DNA進行硫化轉(zhuǎn)化修飾。

(3)對修飾后的DNA進行純化，得到樣本模板。

(4)對樣本模板進行PCR擴增，擴增條件為：95℃預(yù)變性20分鐘，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增階段，95℃變性20s，56℃退火35s，并進行50個循環(huán)。

(5)比對正、反義雙鏈熒光累積法中septin9基因CP值和單用一條鏈檢測septin9基因的CP值，或者比對雙鏈檢測法和單鏈檢測法中腸癌樣本septin9基因甲基化的陽性檢出率判斷兩種檢測方法樣本模板中甲基化的檢測程度。以內(nèi)參基因ACTB的擴增曲線和CP值判斷實驗的準(zhǔn)確性和有效性。

本發(fā)明使用的DNA提取試劑和DNA硫化轉(zhuǎn)化試劑均為蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥有限公司自主生產(chǎn)的試劑，提取及硫化試劑對外銷售。

本發(fā)明首次使用同一基因的兩條鏈，即正、反義鏈甲基化熒光累積方法提高基因甲基化檢測靈敏度。與現(xiàn)有的甲基化檢測技術(shù)相比，本發(fā)明中的利用雙鏈檢測基因甲基化程度的方法具有較高的基因甲基化檢測靈敏度的優(yōu)點，本發(fā)明方法充分利用DNA的兩條鏈，增加熒光信號值，使甲基化熒光雙重累積，提高基因甲基化的檢測靈敏度，能在(95％)非甲基化DNA存在的背景下檢測到目的基因的甲基化，即甲基化DNA含量僅為5％時本發(fā)明的方法也能準(zhǔn)確檢出。本發(fā)明方法采用定性法即可區(qū)分甲基化程度高低，根據(jù)擴增曲線和Cp值即可區(qū)分甲基化程度高低。除此之外，本發(fā)明的利用雙鏈檢測提高基因甲基化檢測靈敏度的方法還具有以下優(yōu)點：(1)檢測過程為閉管同孔反應(yīng)，即在一個孔中可同時檢測到兩條鏈的甲基化情況，操作簡單快速，減少污染的可能性；(2)雙重反應(yīng)：目的基因與內(nèi)參基因處于不同的熒光通道，通過內(nèi)參基因可對整個實驗的準(zhǔn)確性和有效性進行監(jiān)測和評估。(3)安全，整個體系不包含有毒有害物質(zhì)，無需PCR產(chǎn)物的開管，對試驗人員以及環(huán)境都無危害。

本發(fā)明根據(jù)該雙鏈檢測法發(fā)明了相關(guān)的試劑盒，同時優(yōu)化了PCR擴增條件，進一步提高了擴增反應(yīng)效率。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明：

圖1為本發(fā)明的原理示意圖；

圖2為在1例腸癌血漿樣本中使用本發(fā)明和常規(guī)方法的對比結(jié)果圖；

圖3為使用本發(fā)明檢測甲基化靈敏度的實驗結(jié)果圖；

圖4為使用本發(fā)明檢測1例肺癌血漿樣本(三個復(fù)孔)的檢測擴增結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。

實施例1

下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

材料：待檢血漿樣本、濃度為2ng/ul的甲基化陽性DNA、濃度為2ng/ul的甲基化陰性DNA。

儀器：Lightcycler 480、旋轉(zhuǎn)混勻器、水浴鍋、漩渦震蕩儀、冰箱。

試劑：DNA聚合酶(羅氏公司)、10×PCR Buffer(羅氏公司)、MgCl₂(羅氏公司)、dNTP(TaKaRa)、純化水。

引物和探針：所有引物的純度應(yīng)達(dá)到電泳級(PAGE)或HPLC級，不含雜帶。所有探針5'端報告熒光基團為FAM，3'端的猝滅基團為BHQ1。所有引物和探針的序列由本發(fā)明研究人員自主設(shè)計，然后由供應(yīng)商提供，濃度為10μmol/L備用。

septin9甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.1：

5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’

septin9甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.2：

5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’

septin9甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.3：

5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’

septin9甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.4：

5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；

septin9甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.5：

5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’

septin9甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.6：

5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’。

使用內(nèi)參基因甲基化的引物對和內(nèi)參基因甲基化探針，內(nèi)參基因為ACTB，

內(nèi)參基因引物序列如SEQ No.7：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，

內(nèi)參基因引物序列如SEQ No.8：

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，

內(nèi)參基因甲基化探針序列如SEQ No.9：

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。

對待測樣本進行處理，所述待測樣本為正常人血漿或腸癌血漿。

A.從待測樣本中提取DNA(蘇州為真公司)。

B.對提取的DNA進行硫化轉(zhuǎn)化修飾(蘇州為真公司)。

C.對修飾后的DNA進行純化，得到樣本模板。

將自主設(shè)計的septin9正義鏈引物對和正義鏈探針、反義鏈引物對和反義鏈探針以及DNA模板、內(nèi)參基因甲基化的引物對和內(nèi)參基因甲基化探針同時加到同一孔中進行PCR擴增反應(yīng)。

PCR反應(yīng)體系和條件

PCR擴增反應(yīng)體系的終濃度組成為：1×PCR緩沖液、0.25mM dNTPs、350nM septin9甲基化正義鏈引物對、350nM septin9甲基化反義鏈引物對、0.05ng/ul模板DNA、70nM septin9甲基化正義鏈探針、70nM septin9甲基化反義鏈探針、1.5U TaqDNA聚合酶、2.5mM氯化鎂。

PCR擴增反應(yīng)的具體過程為：95℃預(yù)變性20分鐘，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增階段，95℃變性20s，56℃退火35s，并進行50個循環(huán)。若有擴增信號，且呈S型擴增曲線，則為陽性樣本，說明有甲基化出現(xiàn)；若無擴增曲線升起，說明為陰性樣本，即未發(fā)生甲基化。擴增的Cp值小于等于40時，結(jié)果為有效值。

收集北京協(xié)和醫(yī)院結(jié)直腸癌血漿87例，健康人血漿107例。用上述雙鏈檢測法對血漿樣本進行septin9基因甲基化檢測，以QIAGEN公司的血漿游離DNA提取、硫化純化試劑盒的單鏈檢測法檢測septin9基因甲基化作對比實驗。統(tǒng)計檢測結(jié)果，所有血漿樣本的內(nèi)參基因ACTB均有擴增且Cp值均小于40，證明該實驗準(zhǔn)確有效。觀察目的基因通道，87例結(jié)直腸癌血漿樣本，雙鏈檢測法檢出陽性的為67例，陽性符合率為77.01％；單鏈檢測法檢出的陽性為59例，陽性符合率為67.82％。對陰性樣本進行分析，107例健康人血漿樣本，雙鏈檢測法中9例檢測結(jié)果為陽性，陰性符合率為91.59％；單鏈檢測法中4例檢測結(jié)果為陽性，陰性符合率為96.26％。圖2為其中1例腸癌血漿樣本的兩種檢測方法的對比結(jié)果，如圖所示，雙鏈檢測法檢出的septin9基因甲基化的Cp值(曲線1)為29.71，熒光值為33左右；單鏈檢測法檢出的septin9基因甲基化的Cp值(曲線2)為33.37，熒光值為18左右。由此可見，雙鏈檢測法比單鏈檢測法檢出的septin9基因甲基化的Cp值高1-2個，且雙鏈檢測法檢出的熒光值也是單鏈檢測法檢出的2倍。

將甲基化陽性DNA和甲基化陰性DNA稀釋成相同濃度，即2ng/ul，分別在95％、85％、50％、30％的非甲基化DNA存在的背景下，用雙鏈檢測法檢測含量為5％、15％、50％、70％的甲基化DNA，所有檢測樣本的內(nèi)參基因ACTB均有擴增且Cp值均小于40，證明該實驗準(zhǔn)確有效。進而觀察目的基因通道，統(tǒng)計檢測結(jié)果如圖3所示，曲線1為甲基化含量為70％的擴增曲線，CP值為23.90；曲線2為甲基化含量為50％的擴增曲線，CP值為25.23；曲線3為甲基化含量為15％的擴增曲線，CP值為26.71；曲線4為甲基化含量為5％的擴增曲線，CP值為27.28，根據(jù)結(jié)果可得，雙鏈檢測法能在(95％)非甲基化DNA存在的背景下檢測到目的基因的甲基化，可大大的提高甲基化檢測靈敏度。

當(dāng)基因甲基化程度不高，樣本中目的基因甲基化的Cp值超過40時，單鏈檢測法定義為陰性，而此時雙鏈檢測法可充分利用兩條鏈，累積甲基化熒光，增加甲基化的檢出，從而提高目的基因甲基化的靈敏度和甲基化陽性檢出率。

實施例2

發(fā)明人還做了HOXA9基因甲基化的雙鏈檢測。

正義鏈的探針：AAATTACCGACGCCCGCG

正義鏈的正向引物：TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG

正義鏈的反向引物：AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG

反義鏈的探針：AAACGAACACGTAACGCG

反義鏈的正向引物：CGTTCGCGTTTTTATTGGTC

反義鏈的反向引物：CGAACCATTAATAACGTACGAA

檢測20例肺癌血漿樣本和13例健康人血漿樣本。用上述雙鏈檢測法對血漿樣本進行HOXA9基因甲基化檢測。所有血漿樣本的內(nèi)參基因ACTB均有擴增且Cp值均小于40，證明該實驗準(zhǔn)確有效。觀察目的基因通道，統(tǒng)計檢測結(jié)果，所有血漿樣本的內(nèi)參基因ACTB均有擴增且Cp值均小于40，證明該實驗準(zhǔn)確有效。觀察目的基因通道，20例肺癌血漿樣本，雙鏈檢測法檢出陽性的為15例，陽性符合率為75％；對陰性樣本進行分析，13例健康人血漿樣本，雙鏈檢測法中1例檢測結(jié)果為陽性，陰性符合率為92.31％。圖4為其中1例肺癌血漿樣本(三個復(fù)孔)的檢測擴增結(jié)果圖。由此可見，雙鏈檢測法不僅適用于septin9基因甲基化的檢測，對肺癌標(biāo)志物HOXA9基因的甲基化檢測也有較高的檢出靈敏度和特異性。

<110> 江蘇為真生物醫(yī)藥技術(shù)股份有限公司

<120> 基因甲基化檢測方法和檢測試劑盒及其應(yīng)用

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<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 1

tcgttgttta ttagttatta tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 2

tccgaaataa tcccatccc at 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 3

ttcgaaatga ttttatttag ttg 23

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 4

cgctacccac caaccatc 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 5

taaccgcgaa atccgacata 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 6

tataccgaac cccgcgatca 20

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 7

gaatttgtgt ttgttattgt gtgttgggt 29

<210> 8

<211>25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 8

cctactcctc ccttaaaaat tacaa 25

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 9

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 10

ttattgtttt gttggacggg tacg 24

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 11

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<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 12

cgttcgcgtt tttattggtc 20

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 13

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<210>14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 14

aaattaccga cgcccgcg 18

<210>15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 15

aaacgaacac gtaacgcg 18