α-L-鼠李糖苷酶Rha1及其表達基因和應用的制作方法
【專利摘要】α-L-鼠李糖苷酶Rha1及其表達基因和應用，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；編碼所述α-L-鼠李糖苷酶Rha1的基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。該α-L-鼠李糖苷酶在酶用量13U/mL，pH6.5，35℃的條件下水解1.5g/L的蘆丁20min,水解效率高達98%以上；該酶能在低溫下生物催化和轉化蘆丁、柚皮苷等黃酮類化合物，大大降低了能耗。
【專利說明】a -L-鼠李糖苷酶Rhal及其表達基因和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及酶工程【技術領域】，具體涉及對黑曲霉來源的a -L-鼠李糖 苷酶Rhal及其表達基因和應用。

【背景技術】
[0002] a -L-鼠李糖苷酶（a -L-rhamnosidase，EC3. 2. 1. 40)廣泛存在于動物、植物和 微生物中，能夠特異性地水解許多糖苷類物質，如柚皮苷、蘆丁、橙皮苷等糖苷類物質末端 a -L-鼠李糖基，可用于食品、醫(yī)藥等領域。主要的功能和作用包括：
[0003] (1)脫苦作用：黃烷酮糖苷類物質是柑桔中的主要苦味物質，a -L-鼠李糖苷酶可 以作用于黃烷酮糖苷類物質，脫去一個鼠李糖分子之后，轉化為單糖苷，其苦味為原來的三 分之一。
[0004] (2)增香作用：葡萄糖中存在大量鍵合態(tài)芳香物質，鍵合態(tài)芳香物質本身并沒有 呈香功能，但可以在糖苷酶的作用下裂解糖苷鍵釋放糖苷配基，產生游離態(tài)芳香物質。許多 品種葡萄鍵合態(tài)芳香物質含量多于游離態(tài)芳香物質，因為鍵合態(tài)芳香物質構成了葡萄中重 要的、潛在的芳香成分，6-0-a-L-鼠李吡喃-β-D-葡萄吡喃糖苷是葡萄中主要的鍵合態(tài) 芳香物質。利用a-L-鼠李糖苷酶可以有效釋放這些香氣物質。
[0005] (3)生物轉化：a -L-鼠李糖苷酶還可用于黃酮類物質的生物轉化。不同的糖鏈決 定了黃酮類物質的不同生理功能，a-L-鼠李糖苷酶可以專一性的水解黃酮類物質糖鏈中 的鼠李糖苷，如a-L-鼠李糖苷酶可以轉化蘆丁生產藥用價值更高的異斛皮素。
[0006] 黑曲霉具有產生α-L-鼠李糖苷酶的能力，但其產量不高，而且直接通過菌株發(fā) 酵獲得a-L-鼠李糖苷酶一般和β-葡萄糖苷酶緊密結合在一起形成柚苷酶，分離得到 純的a-L-鼠李糖苷酶用于生物轉化具有一定的難度。另一方面，黑曲霉來源的a-L-鼠 李糖苷酶還沒有被克隆和表達，本實驗室在前期的研究中發(fā)現(xiàn)了黑曲霉NL-I發(fā)酵生產的 a -L-鼠李糖苷酶能有效應用于蘆丁的生物轉化，因此對黑曲霉NL-I來源的a -L-鼠李糖 苷酶展開了研究。
[0007] [1]Soares NF, Hotchkiss JH. Naringinase immobilization in packaging films for reducing naringin concentration in grapefruit juice[J]. J Food Sci 1998,63:61-65；
[0008] [2] Spagna G, Barbagallo RN1Martino A, et al.A simple method for purifying glycosidases: a -L-rhamnopyranosidase from Aspergillus niger to increase the aroma of Moscato wine[J]. Enzyme Microb Technol, 2000, 27:522-530 ;
[0009] [3] Gonzalez BR, Trindade LM, Manzanares P, et al. Production of bioavailable flavonoid glucosides in fruit juices and green tea by use of fungal a -L-rhamnosidases. Agric. Food Chem, 2004, 52(20):6136-6142.


【發(fā)明內容】

[0010] 解決的技術問題：直接通過黑曲霉菌株發(fā)酵獲得的a -L-鼠李糖苷酶，不僅酶活 力低，而且粗酶液富含β_葡萄糖苷酶。針對目前還沒有黑曲霉來源的α-L-鼠李糖苷酶 基因被克隆表達，且難以低成本大規(guī)模獲得用于黃酮類物質生物轉化的黑曲霉a-L-鼠李 糖苷酶純酶的缺點，本發(fā)明提供一種來源于黑曲霉的a -L-鼠李糖苷酶Rhal及其表達基因 和應用。
[0011] 技術方案：a -L-鼠李糖苷酶Rhal，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 編碼所述a -L-鼠李糖苷酶Rhal的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] 一種插入了 SEQ ID NO. 1所示a -L-鼠李糖苷酶Rhal基因的重組質粒。
[0014] 所述重組質粒的制備方法，其特征在于：
[0015] (1)按照真菌鼠李糖苷酶的同源性設計簡并引物Pl和Ρ2,以黑曲霉菌株 (Aspergillus niger)NL-l的mRNA反轉錄的cDNA為模板，以Pl和Ρ2為引物進行PCR擴 增，得到鼠李糖苷酶Rhal基因的PCR擴增產物，所述引物為 ：
[0016] Pl :5, -ATGGCS(G/C)2(A/G/T)GCCAAATCTI(C/T)TM(A/C)TTGAA-3,；
[0017] P2 :5' -GGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3' ；
[0018] (2)將步驟⑴所得PCR擴增產物與pMD-19T克隆載體在16°C下過夜連接；將連 接產物轉化大腸桿菌ToplOF'感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的 克隆提取質粒，獲得含有a -L-鼠李糖苷酶基因的重組質粒pMD-19T_Rhal ;
[0019] (3)通過對鼠李糖苷酶Rhal全序列分析，設計引物P3和P4 :
[0020] P3 :5' -GGAATTCCATATGGCCAGCCAAATCTTCATTGAAA-3'，下劃線表示 Nde I 位點；
[0021] P4 :5' -CCCAAGCTTGGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3'，下劃線表示 Hind III位點；
[0022] 以P3和P4為引物，以pMD-19T-Rhal為模板進行PCR ;將所得的PCR擴增產物和 pET20b分別用Nde I和Hind III雙酶切，并分別割膠回收，16°C連接4h ;將連接產物轉化 大腸桿菌ToplOF'感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質 粒，獲得含有a -L-鼠李糖苷酶基因的重組質粒pET20b_Rhal。
[0023] 包含所述的重組質粒的大腸桿菌宿主細胞。
[0024] 所述a -L-鼠李糖苷酶Rhal在柚皮苷、蘆丁生物催化轉化中的應用。
[0025] 有益效果：本發(fā)明首次克隆并重組表達了黑曲霉菌株（Aspergillus niger) a -L-鼠李糖苷酶Rhal的基因，重組酶Rhal可以水解柚皮苷和蘆丁。該a -L-鼠李糖苷 酶在酶用量13U/mL，pH6. 5,35°C的條件下水解1.5g/L的蘆丁 20min，水解效率高達98%以 上；該酶能在低溫下生物催化和轉化蘆丁、柚皮苷等黃酮類化合物，大大降低了能耗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為重組a -L-鼠李糖苷酶電泳圖；圖1中M :Mark ;1 :粗酶液；2 :純化后酶液。
[0027] 圖2為重組a -L-鼠李糖苷酶Rhal水解柚皮苷的HPLC圖譜。其中，⑴圖譜為 使用滅活的a -L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷的HPLC圖譜，（2)圖譜為加 a -L-鼠李糖苷酶水 解柚皮苷的HPLC圖譜。
[0028] 圖3為重組a -L-鼠李糖苷酶Rhal水解蘆丁的HPLC圖譜；第一個峰為蘆丁（保 留時間為3. 630)，第二峰為異槲皮苷（保留時間為3. 788)。
[0029] 圖4為重組a -L-鼠李糖苷酶水解蘆丁條件的優(yōu)化結果。其中，圖a為溫度對蘆 丁水解率的影響，圖b為pH對蘆丁水解率的影響，圖c為時間對蘆丁水解率的影響，圖d為 酶用量對蘆丁水解率的影響。

【具體實施方式】
[0030] 下述實施例中的實驗方法僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明， 凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的 保護范圍之內，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。本發(fā)明的實施例中所用到的材料包括：大腸 桿菌（Escherichia coli)ToplOF' ；pMD-19T克隆載體試劑盒，限制性內切酶、修飾酶、連接 酶等（購自 Takara 公司）；pET2〇b vector (購自 Invitrogen 公司）、p-NPR 購自 Sigma 公 司。
[0031] 實施例1
[0032] 1.黑曲霉菌株（Aspergillus niger)總 RNA 的獲得
[0033] I. 1 黑曲霉菌株（Aspergillus niger)的培養(yǎng)
[0034] 黑曲霉菌株（Aspergillus niger)NL-I由本實驗室篩選獲得（黑曲霉cbhl基因 和耐高糖bgll基因克隆表達及定向改造，李國慶，南京林業(yè)大學，碩士論文，2012年），保 藏在南京林業(yè)大學微生物菌種保藏庫， 申請人:保證從申請日起二十年內向公眾發(fā)放生物材 料。黑曲霉菌株（Aspergillus niger)的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖30g/L，K2HPO4 ·3Η2018/1， KC10. 5g/L，MgSO4O. 5g/L，F(xiàn)eSO4O. 01g/L，NaNO3O. 2g/L，pH 調至 4· 8,接種新鮮的黑曲霉孢子 懸液，30°C下180rpm培養(yǎng)3-4天過濾收集菌絲體。
[0035] 1. 2 黑曲霉菌株（Aspergillus niger)總 RNA 的提取
[0036] 取收集的黑曲霉菌株（Aspergillus niger)的菌絲體用PBS緩沖溶液清洗一次 后，用在液氮下研磨菌絲體至粉末狀，收集到2mL離心管中，加入ImL Trizol后劇烈震蕩， 4°〇下1200(^離心1〇1^11后轉移上清液至21^離心管，加入2()(^1^氯仿震蕩15 8混勻后 30°C下孵育2-3min，4°C下12000g離心IOmin取上層清夜，加入0. 8倍體積異丙醇混勻后 4°C下12000g離心lOmin，去凈上清后用75wt. %乙醇水溶液（DEPC處理過的，去除了 mRNA 酶）清洗2次后4°C下7500g離心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入適量DEPC水溶解 RNA沉淀，作為模板RNA，-20°C下保存。
[0037] 2. a -L-鼠李糖苷酶Rhal編碼基因的克隆
[0038] 2. 1 黑曲霉（Aspergillus niger) cDNA 的獲得
[0039] 以黑曲霉（Aspergillus niger)菌株總RNA為模板，利用逆轉錄合成cDNA第一 鏈（以下各逆轉錄所用試劑均來自于試劑盒"PrimeScriptTMlstStrand cDNA Synthesis Kit"，購自 Takara 公司）。
[0040] 在微量離心管中配制下列模板RNA/Primer反應液：
[0041]

【權利要求】
1. a -L-鼠李糖苷酶Rhal，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 編碼權利要求1所述a-L-鼠李糖苷酶Rhal的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
3. -種插入了 SEQ ID NO. 1所示a -L-鼠李糖苷酶Rhal基因的重組質粒。
4. 權利要求3所述重組質粒的制備方法，其特征在于： (1) 按照真菌鼠李糖苷酶的同源性設計簡并引物Pl和P2,以黑曲霉菌株（Aspergillus niger) NL-I的mRNA反轉錄的cDNA為模板，以Pl和P2為引物進行PCR擴增，得到鼠李糖苷 酶Rhal基因的PCR擴增產物，所述引物為： Pl :5, -ATGGCS(G/C)2(A/G/T)GCCAAATCI1 (C/T)TM(A/C)TTGAA-3,； P2 :5' -GGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3' ； (2) 將步驟（1)所得PCR擴增產物與pMD-19T克隆載體在16°C下過夜連接；將連接產 物轉化大腸桿菌ToplOF'感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆 提取質粒，獲得含有Q-L-鼠李糖苷酶基因的重組質粒pMD-19T-Rhal ; (3) 通過對鼠李糖苷酶Rhal全序列分析，設計引物P3和P4 : P3 :5' -GGAATTCCATATGGCCAGCCAAATCTTCATTGAAA-3'，下劃線表示 Nde I 位點； P4 :5' -CCCAAGCTTGGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3'，下劃線表示 Hind III位點；以 P3和P4為引物，以pMD-19T-Rhal為模板進行PCR ;將所得的PCR擴增產物和pET20b分 別用Nde I和Hind III雙酶切，并分別割膠回收，16°C連接4h;將連接產物轉化大腸桿菌 ToplOF'感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質粒，獲得含 有a-L-鼠李糖苷酶基因的重組質粒pET20b_Rhal。
5. 包含權利要求3所述的重組質粒的大腸桿菌宿主細胞。
6. 權利要求1所述a -L-鼠李糖苷酶Rhal在柚皮苷、蘆丁生物催化轉化中的應用。
【文檔編號】C12N15/56GK104312996SQ201410504753
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權日:2014年9月26日
【發(fā)明者】趙林果, 裴建軍, 馮翊陽, 湯鋒, 岳永德, 操海群, 余曉丹 申請人:南京林業(yè)大學