一種提高臍孢木霉菌合成木霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物技術(shù)和生物防治領(lǐng)域，特別是涉及一種提高臍孢木霉菌（ Trichoderma brevicompactum ）0248合成木霉素的方法。本發(fā)明通過獲得含潮霉素B抗性基因的臍孢木霉菌轉(zhuǎn)化菌株AZ1，并在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入潮霉素B，從而提高發(fā)酵液中木霉素的濃度。該發(fā)明為提高木霉素的發(fā)酵單位提供了一種可靠的方法。CGMCC No. 69852012.12.12
【專利說明】一種提高臍孢木霉菌合成木霉素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物技術(shù)和生物防治領(lǐng)域，特別是涉及一種提高臍孢木霉菌iTrichoderma brevicompacturn) 0248 合成木霉素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]木霉素(trichodermin)-單端孢霉烯類化合物的一種，該化合物對常見9種植物病原真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)均有不同程度的抑制作用，對黃瓜立枯病和番茄灰霉病等真菌病害有良好的生防效果，因此被認為是具有廣闊生防應(yīng)用前景的抗真菌物。木霉素主要由木霉屬真菌臍孢木霉菌brevicompactum)發(fā)療產(chǎn)電。為了提高木霉素的開發(fā)價值和市場競爭力，不少研究者采用物理誘變和誘導(dǎo)等方法以期提高木霉素產(chǎn)量，但在現(xiàn)階段，木霉菌產(chǎn)素水平離工業(yè)化進程相距甚遠。研究組從大蒜中分離篩選到一株產(chǎn)木霉素的內(nèi)生真菌-臍孢木霉菌(J.bre vi compac turn ) 0248,也一直致力于提高木霉素發(fā)酵單位的研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]在研究提高臍孢木霉菌0248產(chǎn)素水平的試驗中發(fā)現(xiàn)，一株具有潮霉素B抗性基因的臍孢木霉菌轉(zhuǎn)化株在含有潮霉素B的培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)木霉素的濃度比臍孢木霉菌0248要高。
[0004]本發(fā)明通過獲得含潮霉素B抗性基因的臍孢木霉菌轉(zhuǎn)化菌株，并在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入潮霉素B，從而提高發(fā)酵液中木霉素的濃度。該發(fā)明為提高木霉素的發(fā)酵單位提供了一種可靠的方法。
[0005]本發(fā)明的目的是針對野生型菌株臍孢木霉菌0248產(chǎn)素水平低的不足，提供一種提高木霉素產(chǎn)素水平的方法；本發(fā)明的另一目的是提供了一株高產(chǎn)木霉素的轉(zhuǎn)化菌株。
[0006]本發(fā)明所述的臍孢木霉菌0248,分類命名為brevicompactum。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號CGMCC N0.6985。
[0007]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
1.以PCAMBIA0380質(zhì)粒為基礎(chǔ)，通過限制性內(nèi)切酶酶切和T4DNA連接酶連接反應(yīng)，將pSilent-Ι質(zhì)粒上的潮霉素B抗性基因連接到pCAMBIA0380質(zhì)粒的T-DNA區(qū)形成新的質(zhì)粒PCAMBIA0380-H 質(zhì)粒；
2.通過熱激轉(zhuǎn)化，將pCAMBIA0380-H質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL-1中，并提取陽性克隆子中質(zhì)粒，然后通過PCR驗證陽性克隆子是否正確；
3.將經(jīng)PCR驗證了的陽性克隆子農(nóng)桿菌(命名為AP03H)與臍孢木霉菌0248孢子懸液共同培養(yǎng)，使潮霉素B抗性基因轉(zhuǎn)化并整合至臍孢木霉菌0248中，通過含潮霉素B的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板篩選陽性轉(zhuǎn)化株，獲得的陽性轉(zhuǎn)化株(命名為AZ1)；
4.使用含潮霉素B的液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成為:牛肉膏10g/L，葡萄糖8 g/L，NaCl2 g/L，潮霉素B 0.1 g/L )培養(yǎng)AZ1，培養(yǎng)條件為:28 °C，180 r/min，振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心lOmin,上清液用于木霉素含量的測定；
5.木霉素的檢測
方法:采用氣相色譜法測定，色譜柱HP-5彈性石英毛細管柱(以5 %苯基甲基硅氧烷為固定液，30 mX320 ymX0.25 μ m);檢測器:氫火焰離子檢測器(FID);檢測器溫度270V ;進樣口溫度250 V ;柱溫度:程序升溫，初始溫度100 °C，保持5 min,以10 V /min升溫至260 °C保持5 min ;載氣:氮氣；流速1.5 mL/min。
[0008]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明獲得了含有潮霉素B抗性基因的臍孢木霉菌轉(zhuǎn)化菌株AZ1，該菌株在含潮霉素B的液體培養(yǎng)基中木霉素產(chǎn)量為野生型菌株的6.1倍，顯著提高了發(fā)酵液中木霉素的濃度，這為木霉素產(chǎn)量的提高提供了一種可靠的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1質(zhì)粒pCAMBIA0380-H構(gòu)建流程圖。

【具體實施方式】
[0010]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提高木霉素產(chǎn)量的方法作進一步描述。
[0011]實施例1 (含潮霉素B抗性基因片段質(zhì)粒的制備)
按以下步驟進行:
(1)使用LB培養(yǎng)基在37 °C，180 r/min的條件下培養(yǎng)pSilent-1及pCAMBIA0380質(zhì)粒的宿主菌，12 h后采用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，分別提取pSilent_l及PCAMBIA0380 質(zhì)粒。
[0012](2)使用限制性內(nèi)切酶fciX I和為a I酶，分別對pSilent_l、pCAMBIA0380質(zhì)粒進行雙酶切，酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離，割取目標條帶，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收目標條帶。
[0013](3)使用T4 DNA連接酶將pSilent-Si質(zhì)粒上的潮霉素B抗性基因片段(Hygr)連接到pCAMBIA0380質(zhì)粒的BstX I/Xma I酶切位點，此時的質(zhì)粒命名為pCAMBIA0380_H。
[0014]實施例2 (農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化)
按以下步驟進行:
(1)將pCAMBIA0380-H質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL-1感受態(tài)細胞中，在YEB培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成為:蔗糖5 g/L，酵母提取物1 g/L，蛋白胨10 g/L，硫酸鎂0.5 g/L) 28°C培養(yǎng)兩天后挑取單菌落，并提取質(zhì)粒，使用潮霉素B抗性基因驗證引物H-F/H-R (H-F:GAAGAGGTAAACCCGAAACG, H-R:GGCA AACTGTGA TGGACGAC)進行菌液 PCR，進一步篩選陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)驗證的農(nóng)桿菌陽性克隆子命名為AP03H。
[0015](2)將陽性克隆子AP03H菌與臍孢木霉菌0248的孢子懸液共同培養(yǎng)，使潮霉素B抗性基因轉(zhuǎn)化并整合至0248菌中，通過含潮霉素B (100 μ g/mL)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化株(命名為AZ1)；
(3)使用含潮霉素B的液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成為:牛肉膏10 g/L，葡萄糖8 g/L，NaCl
2g/L，潮霉素 B 0.1 g/L ),28 °C，180 r/min，振蕩培養(yǎng) 72 h，發(fā)酵液經(jīng) 5000r/min 離心lOmin，氣相色譜法分別檢測臍孢木霉菌0248和轉(zhuǎn)化菌株AZ1中發(fā)酵液中木霉素的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AZ1菌發(fā)酵液中木霉素濃度為680.39mg/L，而臍孢木霉菌0248菌發(fā)酵液中木霉素的濃度為111.54mg/L，提高了約6.1倍。
【權(quán)利要求】
1.一種提高臍孢木霉菌合成木霉素的方法，其特征在于首先獲得具有潮霉素B抗性基因片段的質(zhì)粒PCAMBIA0380-H，將pCAMBIA0380_H質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL-1感受態(tài)細胞中，篩選獲得農(nóng)桿菌陽性克隆子(命名為AP03H)，將陽性克隆子AP03H與臍孢木霉菌0248的孢子懸液共同培養(yǎng)，使潮霉素B抗性基因轉(zhuǎn)化并整合至臍孢木霉菌0248中，通過含潮霉素B的平板篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化株(命名為AZl);轉(zhuǎn)化株AZl在含有潮霉素B的液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中臍孢木霉菌brevicompactum),定名為臍孢木霉菌0248，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號CGMCCN0.6985ο
【文檔編號】C12R1/885GK104342461SQ201410543923
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】申屠旭萍, 袁小楓, 俞曉平, 劉衛(wèi)平, 湯谷 申請人:中國計量學(xué)院