一種文心蘭病毒檢測(cè)引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明根據(jù)建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒和菜豆黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)合成了三對(duì)相應(yīng)的特異性引物；并同時(shí)公開了利用該三對(duì)特異性引物同時(shí)對(duì)文心蘭葉片中的建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒和菜豆黃花葉病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法。本發(fā)明建立了一種通過(guò)一次反應(yīng)就能同時(shí)檢測(cè)出3種文心蘭病毒即建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒和菜豆黃花葉病毒的檢測(cè)方法，具有檢測(cè)效率高、所需成本低的特點(diǎn)，且即使樣本中3種文心蘭病毒的RNA含量很低，本發(fā)明也能檢測(cè)出來(lái)，因而本發(fā)明具有很高的檢測(cè)靈敏度。
【專利說(shuō)明】-種文心蘭病毒檢測(cè)引物及方法 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域的一種植物病毒檢測(cè)引物及方法，具體涉及一種文心蘭病 毒檢測(cè)引物及方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV)、齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，0RSV)和菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV)是危害文 心蘭的三種主要病毒。
[0003] 文心蘭（Oncidium)花形優(yōu)美，花期長(zhǎng)，是目前極具競(jìng)爭(zhēng)力和發(fā)展?jié)摿Φ囊环N高經(jīng) 濟(jì)價(jià)值的花卉。但病毒病的危害嚴(yán)重影響其觀賞和利用價(jià)值，使植株表現(xiàn)出花葉、壞死、畸 形、花瓣變色、花穗短小以及花期縮短等癥狀，使其品質(zhì)嚴(yán)重下降，已成為制約文心蘭產(chǎn)業(yè) 發(fā)展的主要限制因素。目前國(guó)際上還沒有防治植物病毒病的有效藥劑，因此，有針對(duì)性地進(jìn) 行隔離檢疫、銷毀病株，或培育無(wú)毒種苗等，是防控病毒病的重要措施。而這些都需要對(duì)種 苗及植株進(jìn)行病毒檢測(cè)，建立快速有效地檢測(cè)方法顯得尤為重要。
[0004] 目前，文心蘭病毒檢測(cè)大多采用基于抗血清的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA方 法），但抗血清不僅價(jià)格較高、一種抗血清只能檢測(cè)一種病毒、檢測(cè)程序繁瑣，而且還存在一 定程度的假陽(yáng)性反應(yīng)、檢測(cè)靈敏性相對(duì)較低等問題。近年來(lái)，為了提高病毒檢測(cè)效率，基于 PCR技術(shù)的病毒檢測(cè)技術(shù)正在迅速發(fā)展，但單重PCR檢測(cè)技術(shù)，一個(gè)反應(yīng)只能檢測(cè)一種病 毒，若應(yīng)用于田間多種病毒復(fù)合侵染的文心蘭病毒的檢測(cè)，則存在著耗時(shí)、耗力、費(fèi)用高的 問題；有鑒于此，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者逐步將多重RT-PCR技術(shù)運(yùn)用到植物病毒檢測(cè)，與單 重PCR檢測(cè)方法相比，多重PCR檢測(cè)技術(shù)具有在一個(gè)mRT-PCR反應(yīng)中可同時(shí)檢測(cè)多種病毒， 操作更為簡(jiǎn)單，縮短了檢測(cè)時(shí)間與降低了實(shí)驗(yàn)成本等優(yōu)點(diǎn)。但是，目前尚未發(fā)現(xiàn)采用多重 PCR檢測(cè)技術(shù)同時(shí)檢測(cè)文心蘭葉片中的CyMV、ORSV和BYMV的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種文心蘭病毒檢測(cè)引物，并同時(shí)揭露了利 用所述檢測(cè)引物檢測(cè)文心蘭三種相應(yīng)病毒的檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的：一種文心蘭病毒檢測(cè)引物，其 具體包括如下三個(gè)引物對(duì)：
[0007] 建蘭花葉病毒引物對(duì)：正向引物5' -GAAATCAAGGCCATAACCCA-3'，反向引物 5'-CCACACGCCTTATTAAGTTTG-3' ；
[0008] 齒蘭環(huán)斑病毒引物對(duì)：正向引物5' -CTGATGTTTGGCAGCCGGTT-3'，反向引物 5'-GAAGAGGTCCAAGTAAGTCCAG-3' ；
[0009] 菜豆黃花葉病毒引物對(duì)：正向引物5' -AATGTTGGAACAGACGAGGAGA-3'，反向引物 5,-ACCCTGTCAGAGTAGAGAGAATGA-3,。
[0010] 進(jìn)一步地，所述建蘭花葉病毒引物對(duì)對(duì)建蘭花葉病毒PCR擴(kuò)增出571bp的產(chǎn)物；所 述齒蘭環(huán)斑病毒引物對(duì)對(duì)齒蘭環(huán)斑病毒PCR擴(kuò)增出325bp的產(chǎn)物；所述菜豆黃花葉病毒引 物對(duì)對(duì)菜豆黃花葉病毒PCR擴(kuò)增出212bp的產(chǎn)物。
[0011] 進(jìn)一步地，利用上述三個(gè)引物對(duì)對(duì)文心蘭病毒進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)方法如下：根據(jù)建 蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒及菜豆黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列分別 設(shè)計(jì)合成出如權(quán)利要求1中所述建蘭花葉病毒引物對(duì)、齒蘭環(huán)斑病毒引物對(duì)、菜豆黃花葉 病毒引物對(duì)；然后建立mRT-PCR檢測(cè)體系，并利用建蘭花葉病毒引物對(duì)對(duì)文心蘭葉片中的 建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒引物對(duì)對(duì)文心蘭葉片中的齒蘭環(huán)斑病毒、菜豆黃花葉病毒引 物對(duì)對(duì)文心蘭葉片中的菜豆黃花葉病毒進(jìn)行mRT-PCR反應(yīng)，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂 糖凝膠電泳分析和克隆測(cè)序比對(duì)。
[0012] 進(jìn)一步地，所述mRT-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下：
[0013] 反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為25 μ L，含有0· 15 μ L5U/ μ L的Taq酶、2. 5 μ L的 IOXTaq 酶 buffer、2 μ L2. 5mmol/L 的 dNTPs、1 μ L 模板、0· 2 μ L 濃度為 10 μ mol/L 的建蘭 花葉病毒正向引物、〇. 2yL濃度為lOymol/L的建蘭花葉病毒反向引物、0.8yL濃度為 10 μ mol/L的齒蘭環(huán)斑病毒引物正向引物、0· 8 μ L濃度為10 μ mol/L的齒蘭環(huán)斑病毒反向 引物、0· 8 μ L濃度為10 μ mol/L的菜豆黃花葉病毒正向引物、0· 8 μ L濃度為10 μ mol/L的 菜豆黃花葉病毒反向引物，其余成分為滅菌雙蒸水；
[0014] 反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，48-60°C退火30s，72°C延伸45s，循環(huán) 35次；72°C延伸IOmin ;4°C終止反應(yīng)。
[0015] 需要說(shuō)明的是，反應(yīng)體系中，每對(duì)引物對(duì)中的正向引物和反向引物的濃度均相等。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0017] 針對(duì)建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒和菜豆黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的 核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)合成了三對(duì)相應(yīng)的特異性引物，并利用該三對(duì)特異性引物同時(shí)對(duì)文 心蘭葉片中的建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒和菜豆黃花葉病毒進(jìn)行mRT-PCR反應(yīng)，建立了 一種通過(guò)一次反應(yīng)就能同時(shí)檢測(cè)出3種文心蘭病毒即建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒和菜豆 黃花葉病毒的檢測(cè)方法，不僅具有檢測(cè)效率高、所需成本低的特點(diǎn)，且即使樣本中3種文心 蘭病毒的RNA含量很低，本發(fā)明也能檢測(cè)出來(lái)，即本發(fā)明檢測(cè)方法具有很高的檢測(cè)靈敏度。 【【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】】
[0018] 下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0019] 圖1為本發(fā)明中實(shí)施例一的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0020] 圖2為本發(fā)明中實(shí)施例二的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0021] 圖3為本發(fā)明中實(shí)施例三的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。 【【具體實(shí)施方式】】
[0022] 本發(fā)明列舉了以下幾個(gè)代表性實(shí)施例，這些實(shí)施例僅是示例性的，且不用于限制 本發(fā)明的范圍，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方法。
[0023] 實(shí)施例一
[0024] 本發(fā)明一種文心蘭病毒的檢測(cè)方法，根據(jù)建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒和菜豆黃 花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的保守核苷酸序列分別設(shè)計(jì)合成了建蘭花葉病毒引物 對(duì)、齒蘭環(huán)斑病毒引物對(duì)及菜豆黃花葉病毒引物對(duì)，然后建立mRT-PCR檢測(cè)體系，并利用建 蘭花葉病毒引物對(duì)對(duì)文心蘭葉片中的建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒引物對(duì)對(duì)文心蘭葉片中 的齒蘭環(huán)斑病毒、菜豆黃花葉病毒引物對(duì)對(duì)文心蘭葉片中的菜豆黃花葉病毒進(jìn)行mRT-PCR 反應(yīng)，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳分析和克隆測(cè)序比對(duì)。
[0025] 其中，各引物對(duì)具體為：（1)建蘭花葉病毒引物對(duì)（如SEQ ID NO :1、2所示）：正 向引物 5' -GAAATCAAGGCCATAACCCA-3'，反向引物 5' -CCACACGCCTTATTAAGTTTG-3' ；（2)齒 蘭環(huán)斑病毒引物對(duì)（如SEQ ID N0:3、4所示）：正向引物5'-CTGATGTTTGGCAGCCGGTT-3'， 反向引物5'-GAAGAGGTCCAAGTAAGTCCAG-3' ；（3)菜豆黃花葉病毒引物對(duì)（如 SEQ ID N0:5、6 所示）：正向弓丨物 5'-AATGTTGGAACAGACGAGGAGA-3'，反向弓丨物 5,-ACCCTGTCAGAGTAGAGAGAATGA-3,。
[0026] 另外， 申請(qǐng)人:為方便描述，以下可將建蘭花葉病毒簡(jiǎn)稱為CyMV，齒蘭環(huán)斑病毒簡(jiǎn)稱 為0RSV，菜豆黃花葉病毒簡(jiǎn)稱為BYMV。且本發(fā)明文心蘭病毒檢測(cè)方法的具體操作步驟如 下：
[0027] 步驟100 :根據(jù)建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒和菜豆黃花葉病毒三種病毒的外殼 蛋白基因核苷酸序列，并應(yīng)用Primer5. 0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出三對(duì)特異性引物（即所述建 蘭花葉病毒引物對(duì)、齒蘭環(huán)斑病毒引物對(duì)及菜豆黃花葉病毒引物對(duì)），再用DNAman軟件對(duì) 所設(shè)計(jì)的三對(duì)特異性引物進(jìn)行校正，證實(shí)三對(duì)引物間不存在自身匹配和競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增，以確 保上述三種病毒能擴(kuò)增出差異明顯的特異性片段，且由上海生工生物工程有限公司合成上 述三對(duì)特異性引物。
[0028] 步驟200 :RNA提?。簩⑼瑫r(shí)被CyMV、0RSV和BYMV三種病毒復(fù)合侵染的文心蘭葉片 〇. 2g、健康葉片0. 2g分別進(jìn)行RNA提取，并以健康葉片為陰性對(duì)照。RNA提取采用Trizol 法：0. 2g文心蘭帶病毒葉片或健康葉片放入研缽中，加入液氮研磨成粉狀；接著將粉狀葉 片置于第一離心管中，再加入ImL Trizol并劇烈震蕩20?30S，然后將第一離心管置于室 溫下靜置5min以使葉片充分裂解，接著將第一離心管于IOOOOrpm下離心5min，將上清液移 至第二離心管中；往第二離心管中加入200uL氯仿，并振蕩混勻，于室溫下放置3min，接著 在4°C、IOOOOrpm下離心15min，然后吸取上層水相至第三離心管中；往第三離心管中加入 0. 5mL異丙醇混勻，并于室溫下放置lOmin，接著將第三離心管于4°C、IOOOOrpm條件下離心 lOmin，并棄去上清液，則RNA沉于管底；之后加 lmL75 %乙醇（DEPC處理水配制）于第三離 心管中并溫和振蕩第三離心管，得到懸浮液，再于4°C、IOOOOrpm條件下離心5min，并棄去 上清液，然后將第三離心管置于冰上晾干lOmin，最后用30uL DEPC處理水溶解RNA樣品。
[0029] 步驟300 :反轉(zhuǎn)錄cDNA :將經(jīng)步驟200處理所得的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體內(nèi)容為： 將反應(yīng)管置于冰上，加入 IuL Primer 01igo(dt)、luL dNTP 混合物（10mmol/L)、4uL DEPC 處理水、4uL RNA樣品至反應(yīng)管中，輕輕混勻再進(jìn)行稍微離心，接著將反應(yīng)管置于65°C水浴 中加熱5min后，立即將反應(yīng)管置于冰上5min，接著將反應(yīng)管稍微離心后再將反應(yīng)管置于冰 上，并加入4uL5 X反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、0. 5uL20U/uL的RNAase抑制劑、luL200U/uL反轉(zhuǎn)錄酶、 4. 5uL DEPC處理水至反應(yīng)管中，然后將反應(yīng)管置于42°C水浴中加熱60min,再將反應(yīng)管置 于70°C下熱擊IOmin,最后終止反應(yīng)。
[0030] 步驟400 :PCR擴(kuò)增：以經(jīng)步驟300處理所得的cDNA為模板，并以步驟100中獲得 的三對(duì)引物為引物對(duì)同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0031] 為了進(jìn)行對(duì)比，本實(shí)施例同時(shí)進(jìn)行了單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)和多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其 中，單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)和多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序一致而反應(yīng)體系不同。PCR擴(kuò)增反應(yīng) 的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序具體內(nèi)容如下：
[0032] 單重PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為25 μ L，包括0. 15 μ L5U/ μ L的Taq酶、 2· 5μ L 的 IOXTaq 酶 buffer、2y L2. 5mmol/L 的 dNTPs、l μ L 模板、1 μ LlOymol/LCyMV 或 ORSV或BYMV的正向引物、1 μ LlOy mol/L CyMV或ORSV或BYMV的反向引物，其余成分為滅 菌雙蒸水。
[0033] 多重PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為25 μ L，含有0. 15 μ L5U/ μ L的Taq酶、 2. 5μ 10 X Taq SI buffer, 2 μ L2. 5mmol/L ^ dNTPsU μ L 2 μ L IOymol/ L的建蘭花葉病毒正向引物、0. 2 μ L濃度為10 μ mol/L的建蘭花葉病毒反向引物、0. 8 μ L濃 度為10 μ mol/L的齒蘭環(huán)斑病毒引物正向引物、0· 8 μ L濃度為10 μ mol/L的齒蘭環(huán)斑病毒 反向引物、〇· 8 μ L濃度為10 μ mol/L的菜豆黃花葉病毒正向引物、0· 8 μ L濃度為10 μ mol/ L的菜豆黃花葉病毒反向引物，其余成分為滅菌雙蒸水。
[0034] PCR反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min、94°C變性30s、52°C退火30s、72°C延伸45s，循環(huán) 35次；72°C延伸IOmin ;4°C終止反應(yīng)。
[0035] 步驟500 :取5 μ L PCR產(chǎn)物以1 %瓊脂糖凝膠（熒光染料）為電泳支持介質(zhì)，在 0. 5 X TBE和130V電壓下電泳35min，然后在0. 5 μ g/mL溴化乙錠染色液中染色8min，用紫 外透射儀觀察，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。
[0036] 本實(shí)施例1 %瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，CyMV引物對(duì)的單重PCR擴(kuò)增 反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識(shí)1所示，ORSV引物對(duì)的單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識(shí)2 所示，BYMV引物對(duì)的單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識(shí)3所示，由CyMV引物對(duì)、ORSV 引物對(duì)、BYMV引物對(duì)的三對(duì)引物參與的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識(shí)4所示，健 康葉片的單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識(shí)5所示。由圖1可知，CyMV引物對(duì)的單重 PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為571bp的條帶，ORSV引物對(duì)的單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò) 增片段長(zhǎng)度為325bp的條帶，BYMV引物對(duì)的單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為212bp 的條帶，由CyMV引物對(duì)、ORSV引物對(duì)、BYMV引物對(duì)三對(duì)引物參與的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可同 時(shí)得到擴(kuò)增片段長(zhǎng)度571bp、325bp和212bp的三條明亮清晰的條帶，可見，本發(fā)明可以一次 性同時(shí)檢測(cè)出球根鳶尾的CyMV、0RSV、BYMV三種病毒，且特異性好、檢測(cè)效率高。
[0037] 實(shí)施例二
[0038] 將實(shí)施例一步驟400中的多重PCR反應(yīng)體系得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)割膠回收，然 后分別與PMD18-T simple vector進(jìn)行體外連接，再挑取陽(yáng)性克隆，最后提取質(zhì)粒測(cè)序，以 檢查CyMV、ORSV和BYMV三種病毒的擴(kuò)增結(jié)果。
[0039] 且測(cè)序結(jié)果為：CyMV、0RSV和BYMV的擴(kuò)增產(chǎn)物分別是由571、325和212個(gè)核苷酸 組成的序列，其中所述CyMV擴(kuò)增產(chǎn)物序列如SEQ ID NO :7所示，所述ORSV擴(kuò)增產(chǎn)物序列如 SEQ ID NO :8所示，所述BYMV擴(kuò)增產(chǎn)物序列如SEQ ID NO :9所示。用NCBI分析同源性結(jié)果 表明，所得的擴(kuò)增產(chǎn)物序列SEQ ID NO :7與參考序列即CyMV的外殼蛋白基因序列的同源率 達(dá)到99%，序列SEQ ID NO :8與參考序列ORSV的外殼蛋白基因序列的同源率達(dá)到100%，序 列SEQ ID NO :9與參考序列BYMV的外殼蛋白基因序列的同源率達(dá)到100%。由此可見，所 得的擴(kuò)增產(chǎn)物 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8 和 SEQ ID NO :9 序列分別為 CyMV、ORSV 和 BYMV 的外殼蛋白基因的部分序列，從而證明了本發(fā)明檢測(cè)方法結(jié)果的可靠性。
[0040] 此外，為了考察本發(fā)明球根鳶尾病毒的檢測(cè)方法的靈敏度， 申請(qǐng)人:對(duì)實(shí)施例一 步驟200中的RNA樣品進(jìn)行10'10'10'10'1〇4-系列的梯度稀釋，然后經(jīng)過(guò)多重 mRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，再進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，具體結(jié)果如圖2所示。由圖2可知， CyMV、0RSV和BYMV三種病毒在樣品濃度稀釋100倍后均仍能擴(kuò)增出特異條帶，由此可見本 發(fā)明具有很高的靈敏度。
[0041] 實(shí)施例三
[0042] 多重mRT-PCR同時(shí)檢測(cè)CyMV、ORSV和BYMV的應(yīng)用：
[0043] 步驟1 :取樣地點(diǎn)為福建省農(nóng)科院花卉研究中心種質(zhì)資源圃。隨機(jī)選取8個(gè)大田 中有帶毒癥狀的文心蘭葉片樣品，且8個(gè)文心蘭葉片樣品均為0. 2g ;接著對(duì)各樣品進(jìn)行RNA 提取（操作同實(shí)施例一的步驟200)，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA (操作同實(shí)施例一的步驟300)。
[0044] 步驟2 :以處理所得的cDNA為模板，并以本發(fā)明所述的三對(duì)引物為引物對(duì)同時(shí)進(jìn) 行單重與多重mRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，且具體步驟同實(shí)施例一的步驟400。
[0045] 步驟3 :取5μ L PCR產(chǎn)物以1 %瓊脂糖凝膠（熒光染料）為電泳支持介質(zhì)，在 0· 5 X TBE和120V電壓下電泳40min，然后在0· 5 μ g/mL溴化乙錠染色液中染色lOmin，用紫 外透射儀觀察，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。
[0046] 本實(shí)施例的1 %瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)如圖3所示，利用本實(shí)施例mRT-PCR體系對(duì)8 個(gè)文心蘭葉片樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，樣品1、6、7、8攜帶CyMV病毒，樣品5攜帶CyMV、BYMV兩種 病毒，樣品2、3、4攜帶CyMV、0RSV、BYMV3種病毒，得到擴(kuò)增片段長(zhǎng)度571bp、325bp和216bp 的三條明亮清晰的條帶，與單重PCR檢測(cè)結(jié)果一致，可見本發(fā)明檢測(cè)方法特異性好、檢測(cè)效 率高。
[0047] 本發(fā)明針對(duì)CyMV、ORSV和BYMV三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列，分別設(shè) 計(jì)合成了三對(duì)相應(yīng)的特異性引物，并利用該三對(duì)特異性引物同時(shí)對(duì)文心蘭葉片中的CyMV、 ORSV和BYMV進(jìn)行mRT-PCR反應(yīng)，建立了一種新的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，使mRT-PCR反 應(yīng)得到了大小差異明顯，長(zhǎng)度分別為571bp、325bp和212bp的三條CyMV、0RSV和BYMV的擴(kuò) 增片段序列；本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了一次反應(yīng)就能同時(shí)檢測(cè)出3種文心蘭病毒即CyMV、0RSV和BYMV 的目標(biāo)，因而本發(fā)明檢測(cè)效率高，本發(fā)明所用試劑為分子生物學(xué)常用試劑，所需成本低，且 即使樣本中3種文心蘭病毒的RNA含量很低，本發(fā)明也能檢測(cè)出來(lái)，因而本發(fā)明具有很高的 檢測(cè)靈敏度。
【權(quán)利要求】
1. 一種文心蘭病毒檢測(cè)引物，其特征在于：具體包括如下三個(gè)引物對(duì)： 建蘭花葉病毒引物對(duì)：正向引物5' -GAAATCAAGGCCATAACCCA-3'，反向引物 5'-CCACACGCCTTATTAAGTTTG-3' ； 齒蘭環(huán)斑病毒引物對(duì)：正向引物5' -CTGATGTTTGGCAGCCGGTT-3'，反向引物 5' -GAAGAGGTCCAAGTAAGTCCAG-3'； 菜豆黃花葉病毒引物對(duì)：正向引物5' -AATGTTGGAACAGACGAGGAGA-3'，反向引物 5,-ACCCTGTCAGAGTAGAGAGAATGA-3,。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一文心蘭病毒檢測(cè)引物，其特征在于：所述建蘭花葉病毒引物 對(duì)對(duì)建蘭花葉病毒PCR擴(kuò)增出571bp的產(chǎn)物；所述齒蘭環(huán)斑病毒引物對(duì)對(duì)齒蘭環(huán)斑病毒 PCR擴(kuò)增出325bp的產(chǎn)物；所述菜豆黃花葉病毒引物對(duì)對(duì)菜豆黃花葉病毒PCR擴(kuò)增出212bp 的產(chǎn)物。
3. -種文心蘭病毒檢測(cè)方法，其特征在于：根據(jù)建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒及菜豆 黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)合成出如權(quán)利要求1中所述 建蘭花葉病毒引物對(duì)、齒蘭環(huán)斑病毒引物對(duì)、菜豆黃花葉病毒引物對(duì)；然后建立mRT-PCR檢 測(cè)體系，并利用建蘭花葉病毒引物對(duì)對(duì)文心蘭葉片中的建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒引物 對(duì)對(duì)文心蘭葉片中的齒蘭環(huán)斑病毒、菜豆黃花葉病毒引物對(duì)對(duì)文心蘭葉片中的菜豆黃花葉 病毒進(jìn)行mRT-PCR反應(yīng)，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳分析和克隆測(cè)序比對(duì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述一種文心蘭病毒檢測(cè)方法，其特征在于：所述mRT-PCR反應(yīng)的 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下： 反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為25iiL，含有0. 15iiL 5U/iiL的Taq酶、2. 5iiL的 10父了&9酶1311打61'、21112.5臟〇1/1的（1階1^、11114莫板、0.2111濃度為1011111〇1/1的建 蘭花葉病毒正向引物、〇. 2 y L濃度為10 y mol/L的建蘭花葉病毒反向引物、0. 8 y L濃度為 10 ii mol/L的齒蘭環(huán)斑病毒引物正向引物、0? 8 ii L濃度為10 ii mol/L的齒蘭環(huán)斑病毒反向 引物、0? 8 y L濃度為10 y mol/L的菜豆黃花葉病毒正向引物、0? 8 y L濃度為10 y mol/L的 菜豆黃花葉病毒反向引物，其余成分為滅菌雙蒸水； 反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，48-60°C退火30s，72°C延伸45s，循環(huán)35 次；72°C延伸10min ;4°C終止反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104372108SQ201410591218
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】黃敏玲, 樊榮輝, 鐘淮欽, 葉秀仙, 羅遠(yuǎn)華, 吳建設(shè), 林兵 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所