一種快速檢測(cè)登革病毒的分子信標(biāo)探針、引物及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種 快速檢測(cè)登革病毒的分子信標(biāo)探針、引物及檢測(cè)方法 ，其是通過選用針對(duì)DENV-1～DENV-4各亞型3’-UTR區(qū)的通用正反向引物及通用分子信標(biāo)探針，用于熒光分子信標(biāo)探針PCR檢測(cè)DENV。該探針5'標(biāo)記FAM，3'標(biāo)記DABCYL。使用該探針和引物對(duì)各種登革病毒標(biāo)準(zhǔn)血清及臨床血清進(jìn)行檢測(cè)，獲得用于DENV檢測(cè)的各種參數(shù)：特異性100%、檢測(cè)靈敏度可達(dá)102copies/μL。
【專利說明】一種快速檢測(cè)登革病毒的分子信標(biāo)探針、引物及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外生物醫(yī)學(xué)診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種熒光分子信標(biāo)PCR檢測(cè)技 術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0002] 登革病毒（Denguevirus,DEN)屬黃病毒科黃病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，依抗 原性不同分四個(gè)血清型，主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊等媒介昆蟲傳播，引起登革熱、登革 出血熱和登革休克綜合征。登革熱流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，每年約有5000萬?1億人感 染，已成為嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題。
[0003] 分子信標(biāo)(Molecular Beacon)技術(shù)是由Tyagi等1996年首先提出來的，分子信標(biāo) 是根據(jù)核酸堿基配對(duì)原則和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)現(xiàn)象設(shè)計(jì)的。當(dāng)一個(gè)熒光分子(供體 分子）的熒光光譜與另一個(gè)熒光分子(受體分子）的激發(fā)光譜相重疊時(shí)，供體熒光分子的激 發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時(shí)供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減，這種現(xiàn)象即是熒光 FRET，F(xiàn)RET程度與供、受體分子的空間距離緊密相關(guān)，一般為7?10nm時(shí)即可發(fā)生FRET， 隨著距離延長(zhǎng)，F(xiàn)RET呈106比例顯著減弱。分子信標(biāo)具有背景信號(hào)低、靈敏度高、特異性 識(shí)別性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單以及不必與未反應(yīng)的探針分離即可實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)已廣泛地應(yīng)用于實(shí) 時(shí)監(jiān)測(cè)聚合酶鏈反應(yīng)、基因突變的快速分析、DNA和RNA的檢測(cè)等領(lǐng)域。登革病毒分子信標(biāo) PCR熒光定量技術(shù)正是基于這樣的原理設(shè)計(jì)的，該技術(shù)為登革病毒感染的早期診斷、大規(guī)模 篩查、臨床治療動(dòng)態(tài)分析、新藥開發(fā)等提供良好的技術(shù)支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測(cè)登革病毒的分子信標(biāo)探針、引物及檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的登革病毒熒光分子信標(biāo)PCR檢測(cè)方法，其特 征在于選取登革病毒3'-UTR區(qū)保守序列作為RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的靶序列，設(shè)計(jì)合成特異性 的引物和分子信標(biāo)探針，對(duì)登革病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0006] 在所述的一種登革毒熒光分子信標(biāo)PCR檢測(cè)方法中設(shè)計(jì)合成了以下引物和分子 信標(biāo)探針： 其中引物為：

【權(quán)利要求】
1. 一種登革病毒熒光分子信標(biāo)PCR檢測(cè)方法，其特征在于選取登革病毒3'-UTR區(qū)保 守序列作為RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的靶序列，設(shè)計(jì)合成特異性的引物和分子信標(biāo)探針，對(duì)登革病 毒進(jìn)行定量檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種登革毒熒光分子信標(biāo)PCR檢測(cè)方法，其特征在于設(shè)計(jì)合 成了以下引物和分子信標(biāo)探針： 其中引物為： DEN-F :5, -AGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCC - 3， DEN-R :5, -CGTTCTGTGCCTGGAATGAT - 3， 其分子信標(biāo)探針DEN-P為： 5'-FAM-CAGCGACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCACGCTG-Dabcyl-3' 。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種登革毒熒光分子信標(biāo)PCR檢測(cè)方法，其特征在于對(duì)人血 清中登革病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種登革毒熒光分子信標(biāo)PCR檢測(cè)方法，其特征在于RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)： 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：包括5XAMV Buffer 4iiL，10mmol/L dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸） 2 yL, 50 ymol/L Random Primer (隨機(jī)弓 |物）0.5 yL,Rnase Inhibitor 0.5 yL，AMV (逆轉(zhuǎn) 錄酶）1 y L，RNA Sample 10 ii L，補(bǔ)水至 20 ii L，反應(yīng)參數(shù)：25°C lOmin，42°C lh ; 熒光PCR反應(yīng)體系為：2XHotstart Fluo-PCR mix (2X熒光PCR反應(yīng)混合液)25iiL， 25 ii mol/L DEN-F/DEN-R 各 1 ii L，25 ii mol/L DEN-P 0? 5 ii L，cDNA 2 ii L，補(bǔ)水至 50 ii L，反 應(yīng)參數(shù)：94°C 4min ;94°C 30sec，6(TC 30sec，72°C 34sec，40cycles。
5. 權(quán)利要求1-4所述的一種登革毒熒光分子信標(biāo)PCR檢測(cè)方法所用的引物和分子信標(biāo) 探針： 其中引物為： DEN-F :5,-AGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCC - 3， DEN-R :5,-CGTTCTGTGCCTGGAATGAT - 3， 其分子信標(biāo)探針DEN-P為： 5'-FAM-CAGCGACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCACGCTG-Dabcyl-3' 。
6. -種登革毒熒光分子信標(biāo)PCR檢測(cè)的試劑盒，其特征在于：包括如權(quán)利要求5所述 的引物和分子信標(biāo)探針。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104342502SQ201410593828
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】張建明, 高博, 王宇平, 楊美瓊, 黃野能 申請(qǐng)人:福建國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心