專利名稱：用于改善殺蟲控制的修飾合成dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含修飾的截短基因的合成DNA序列，所述截短基因編碼特征為具有氨基酸序列(SEQ ID NO1)或其變體的蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種(Bacillus thuringiensis ssp. galleria)的Cry9Aa內(nèi)毒素的N端結(jié)構(gòu)域，所述變體具有大致相似的結(jié)構(gòu)和特性。在本發(fā)明中公開了所述修飾合成DNA序列的制備方法以及其用途。所述修飾DNA序列可用于改善殺蟲控制，并可用作抗性管理策略的工具。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌的晶體內(nèi)毒素(Cry蛋白)(Bt毒素)用于殺蟲控制的用途已經(jīng)成為深入研究計劃的對象，因為所述內(nèi)毒素對非靶生物包括哺乳動物和人類是無毒的。所述內(nèi)毒素對昆蟲尤其是幼蟲期的昆蟲具有非常特異性和選擇性的作用。除了所述選擇性和特異性之外，據(jù)認(rèn)為Bt毒素也是農(nóng)業(yè)上使用的最有效的生物殺蟲劑。一般來說，靶昆蟲對Bt毒素產(chǎn)生抗性比對化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生抗性曼得多。例如，已知在實驗室條件下小菜蛾(Plutella xylostella)在30-100代內(nèi)產(chǎn)生對CryI類毒素的抗性。
已經(jīng)深入研究了細(xì)菌Bt毒素及其作用模式，已經(jīng)通過給予含所述細(xì)菌的肉湯培養(yǎng)物或通過給予更多或更少的純化的內(nèi)毒素，將這些內(nèi)毒素中的一些用作殺蟲劑。由于它們的殺蟲效果，由cry基因編碼的Bt毒素也已經(jīng)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。首次嘗試用所述基因的長天然序列轉(zhuǎn)化植物失敗了(Vaeck，M.等，(1987)Nature 32833-37)。因此已經(jīng)截短了不同的cry基因，使其只含有編碼活性毒素蛋白的DNA序列，該活性毒素蛋白位于原毒素胰蛋白酶切位點之間。已經(jīng)將截短的cry基因轉(zhuǎn)化入許多植物物種中，包括煙草(Barton，K.A.等，(1987)PlantPhysiol.851103-1109；Vaeck，M.等，(1987)Nature 32833-37；Carozzi，N.B.等，(1992)Plant Mol.Biol.20539-548)，番茄(Fischhoff，D.A.等，(1987)Bio/Technology 5807-813；Delannay，X.等，(1989)Bio/Technology 71265-1269和甘藍(lán)(Bai，Y.Y.等，(1993)Current PlantScience and Biotechnology in Agriculture 15156-159)。
概述這些資料可以知道，在實驗室試驗中所述Bt毒素的表達(dá)已經(jīng)足以控制昆蟲，但野外試驗還沒有足夠成功(Warren，G.W.等，(1992)，J.Econ.Entomol.85(5)1651-1659)地實現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)。野外試驗的問題主要是所表達(dá)的毒素水平的變異性。為了增強所述毒素的表達(dá)，已經(jīng)將諸如35S CaMV啟動子的強啟動子序列和花椰菜花葉病毒CaMV的非翻譯的前導(dǎo)序列和與nptII的翻譯融合用于番茄(Vaeck，M.等，(1987)Nature 32833-37)和馬鈴薯(Sticklen，M.B.等，(1993)，載于Yoy，C.B.等，(編輯)Biotechnology in Agriculture；Kluwer Academic Publishers，Netherlands，233-236)。在所述操作的情況下，已經(jīng)可以增強所述毒素基因的表達(dá)，并在某種程度上穩(wěn)定了蛋白生產(chǎn)，但還不足以穩(wěn)定昆蟲防治。已經(jīng)表明，mRNA不穩(wěn)定性以及細(xì)菌和植物密碼子選擇的差異是轉(zhuǎn)基因植物中Bt毒素表達(dá)缺乏的主要原因。
在八十年代后期，幾個研究小組開始積極研究植物基因表達(dá)。結(jié)果編寫了植物基因的優(yōu)選密碼子(codon preference)表(Murray，E.E.等，(1989)Nucl.Acad.Res.17477-497)?？偟膩碚f，不同植物基因的密碼子選擇分析表明，雙子葉植物強烈回避XCG密碼子，而單子葉植物強烈回避XTA密碼子(Grantham，R.等，(1986)載于Oxford Surveys inEvol.Biol.348-81)，以及回避一些其它的稀有密碼子。也已經(jīng)表明，植物基因的推定剪接位點(Goodball，G.J.，和Filipowics，W.，(1989)Cell58473-483)和聚腺苷酸化位點(Dean，C.等，(1986)Nucl.Acid.Res.14(5)2229-2240；Joshi，C.P.，(1987)Nucl.Acid.Res.14(5)2229-2240)的特征在于AT富集區(qū)。Cry基因序列AT含量豐富，并與植物基因的優(yōu)選AT/GC比率相差甚遠(yuǎn)。此外已經(jīng)表明重復(fù)的AUUUA序列是真核生物中mRNA降解的原因(Ohme-Takagi，M.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9011811-11815)。而且，在植物基因的翻譯起始密碼子AUG鄰近位置已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了保守的鄰近序列或基元。
結(jié)論在1986-1989年闡明了降低某些細(xì)菌基因在植物中的表達(dá)水平的特征。表明額外的AT含量導(dǎo)致自發(fā)形成推定的剪接和聚腺苷酸化位點以及在所述基因的鄰近序列中出現(xiàn)妨礙其表達(dá)的稀有(對于植物優(yōu)選密碼子而言)密碼子。cryIAb基因在推定的異常mRNA加工位點上的部分修飾據(jù)證明引起基因表達(dá)增加10倍(Perlak，F(xiàn).J.等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883324-3328；van der Salm，T.等；(1994)Plant Mol.Biol.2651-59)。在九十年代早期發(fā)表了關(guān)于三個首先合成的cry基因的報告。Perlak，F(xiàn).J.等，1991(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883324-3328)報導(dǎo)了轉(zhuǎn)化入煙草和番茄植株中的完全修飾的cryIA(b)基因和cryIA(c)基因的高度表達(dá)。再合成的基因序列產(chǎn)生的蛋白超出野生型的截短型所述基因100倍。據(jù)報導(dǎo)cryIIIA(Adang，M.J.等，(1993)PlantMol.Biol.211131-1145)和cryIA(b)(Fujimoto，H.等，(1993)Bio/Technology 111151-1153)具有相似結(jié)果。Adang，M.J.等使用13個不同片段的寡核苷酸連接體再合成cryIIIA基因序列(Adang，M.J.等，(1993)Plant Mol.Biol.211131-1145)。然后將所述片段連接至轉(zhuǎn)化入馬鈴薯的全基因序列。Fujimoto，H.等，(1993)使用高保真性PCR再合成了cryIA(b)基因序列。將7個合成的片段連接至一個完整基因序列，然后將其轉(zhuǎn)化入水稻植株(Fujimnoto，H.等，(1993)Bio/Technology 111151-1155)。這三篇論文都描述了再合成不含不需要的加工信號位點的毒素基因和將密碼子鄰近序列由細(xì)菌優(yōu)選密碼子改變?yōu)橹参飪?yōu)選密碼子。在美國專利5,380,831和美國專利5,500,365中公開了包括單子葉植物和雙子葉植物優(yōu)選的Bt毒素的DNA序列的修飾策略。
再合成的cryIAb(Koziel，M.J.等，(1993)Bio/Technology11194-200)、cryIIIA(Perlak，F(xiàn).J.等，(1993)Plant Molecular Biology 22313-321)和cryIAc(Perlak，M.J.等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883324-3328)在實驗室和野外實驗中于不同植物中高度表達(dá)。令人感興趣的是，使用定點轉(zhuǎn)化的煙草葉綠體實現(xiàn)了未修飾的截短cryIA(c)基因的高度表達(dá)(MacBrige，K.E.等，(1995)Bio/Technology 13362-365)。將在細(xì)胞核中表達(dá)的cryIA(c)基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到葉綠體中顯示將所述蛋白的擴增增強10-20倍(Wong，E.Y.等，(1992)Plant Mol.Biol.2081-93)。具有不同結(jié)合受體的兩種cry基因的錐形表達(dá)顯示降低了抗性昆蟲的出現(xiàn)率(van der Salm，T.等，(1994)Plant Mol.Biol.2651-59)。
如以上所公開，已經(jīng)修飾了點突變的cryI基因(鱗翅目活性)，尤其是已經(jīng)制備了合成cryIA(c)、cryIA(b)和cryIIIA(鞘翅目活性)基因并用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。在最近的報道(Conner，A.J.等，第五屆馬鈴薯分子生物學(xué)國際研討會，1998年8月2-6日，Bogensee，德國)中指出，用截短的cryIAc基因轉(zhuǎn)化的馬鈴薯系對幼蟲發(fā)育和存活率的影響要大于通過定點誘變截短的天然cry9Aa2而改變的序列。所述結(jié)果證實了其他研究小組也公開了的發(fā)現(xiàn)即部分修飾不會在植物中產(chǎn)生足夠高的表達(dá)水平。
本發(fā)明的主要目標(biāo)是通過在高等植物中提供由DNA序列編碼的具有相當(dāng)大差異的殺蟲蛋白，提供對靶昆蟲(諸如鱗翅目幼蟲)的毒性增加的植物，所述DNA序列通過提高mRNA加工和穩(wěn)定性以及增強翻譯同時增強表達(dá)，同時使高等植物抗靶昆蟲侵襲的耐受性增加。換句話說，本發(fā)明的目標(biāo)是獲得高度表達(dá)編碼具有特異性殺蟲作用的獨特Bt毒素的合成DNA序列的轉(zhuǎn)基因植物，并因此提供一種延遲昆蟲對所述毒素發(fā)生耐受并且克服交叉抗性相關(guān)問題的方法。后者能夠利用本發(fā)明的合成DNA序列實現(xiàn)抗性管理策略。
發(fā)明概述本發(fā)明的目標(biāo)通過提供新的合成DNA序列來實現(xiàn)，該序列通過修飾編碼天然Cry9Aa蛋白的N-末端的部分基因獲得，其毒性是基于與其它CryI毒素具有相當(dāng)大差異的殺蟲作用和/或結(jié)合受體機制。
因此，本發(fā)明涉及編碼特征為氨基酸序列(SEQ ID NO1)或其變體的蛋白的Cry9Aa基因的截短DNA序列的修飾合成DNA序列，所述變體仍然具有與蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種的Cry9Aa內(nèi)毒素的N端結(jié)構(gòu)域大致相同的結(jié)構(gòu)和殺蟲作用。修飾的合成DNA序列的特征在于輸送改善的特性，諸如在轉(zhuǎn)基因植物中通過加強mRNA加工和穩(wěn)定性以及翻譯能力來增強表達(dá)，而編碼的(表達(dá)的)δ-內(nèi)毒素仍然保持與天然Cry9Aa基因編碼的δ-內(nèi)毒素大致相同的殺蟲作用。所述修飾的合成DNA序列可以插入到合適的DNA構(gòu)建物中，以使它們能夠轉(zhuǎn)移到目的原核或真核生物宿主中。
通過修飾優(yōu)選密碼子以及提供其它在優(yōu)先選擇的高等植物的截短的Cry9Aa基因的合成DNA序列中的修飾，獲得提高的mRNA加工和穩(wěn)定性以及相應(yīng)毒素蛋白的翻譯。例如，密碼子偏倚可以更改為蕓苔屬植物優(yōu)選密碼子，而且一般更常見變更為雙子葉植物優(yōu)選密碼子，改變?yōu)閱巫尤~植物優(yōu)選密碼子是最少優(yōu)選的改變。也可改變起始密碼子鄰近位置，使得對高等植物更理想。在所述試驗中使用煙草、蕪菁?xì)W洲油菜(turnip rape)、花椰菜和馬鈴薯植物，但顯然也可以轉(zhuǎn)化其它植物。
本發(fā)明的合成DNA序列能夠在原核或真核生物中表達(dá)特征為具有氨基酸序列(SEQ ID NO1)或其變體(能夠顯示出大致類似于所選擇的殺蟲蛋白(即Cry9Aa毒素)的選定結(jié)構(gòu)域的特性)的殺蟲蛋白，該殺蟲蛋白沒有在抗已知殺蟲蛋白(諸如其它CryI毒素)的昆蟲中遇到的交叉抗性現(xiàn)象。
修飾合成DNA序列的編碼蛋白與截短的Cry9Aa基因的DNA序列編碼的蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種的殺蟲蛋白的N端結(jié)構(gòu)域大致相同。所述DNA序列的最優(yōu)選的實施方案是這樣的合成DNA序列具有大致相似性(是指與SEQ ID NO2相比包含不多于25％核苷酸改變的相似性)，并能夠編碼大致類似于SEQ ID NO1的蛋白或具有大致相同特性的蛋白。本發(fā)明的修飾DNA序列與SEQ ID NO3相比，優(yōu)選包含少于50％的核苷酸改變，更優(yōu)選包含少于25％的核苷酸改變，最優(yōu)選包含多于5％的核苷酸改變。本發(fā)明的修飾DNA序列與SEQ IDNO2相比，優(yōu)選包含至多20％或更多的改變。所述修飾合成DNA序列應(yīng)當(dāng)編碼明顯不同于已知殺蟲蛋白的蛋白，例如cryIAc和cryIC基因。
本發(fā)明的修飾合成DNA序列可以通過向所選擇的高等植物方向改變密碼子偏倚而產(chǎn)生，優(yōu)選改變?yōu)殡p子葉植物優(yōu)選密碼子，但最優(yōu)選是改變?yōu)槭|苔屬植物優(yōu)選密碼子。最好是，去除推定的聚腺苷酸化、剪接和mRNA不穩(wěn)定信號序列，并改變起始密碼子鄰近位置，以增加與高等植物的相容性。所述修飾合成DNA序列的特征在于表達(dá)水平和穩(wěn)定性。
制備本發(fā)明的修飾合成DNA序列的方法包括由編碼具有與已知殺蟲蛋白的特性明顯不同的殺蟲蛋白的基因中選擇合成DNA序列的步驟，其特征在于輸送抗性，尤其是防止在靶昆蟲中產(chǎn)生交叉抗性。
所述合成DNA序列可以插入到合適的DNA構(gòu)建物、載體和質(zhì)粒中，而它們又可以被引入到目的宿主中。
本發(fā)明還公開了具有不同特異性和表達(dá)水平以及mRNA穩(wěn)定性的修飾合成DNA序列的用途，它使高等植物針對靶昆蟲的毒性增加。本發(fā)明的修飾合成DNA序列提供對靶昆蟲毒性增加的轉(zhuǎn)基因植物，用于改善殺蟲控制。所述轉(zhuǎn)基因植物能夠表達(dá)有效量的目的殺蟲蛋白，并能夠防止出現(xiàn)目前觀察到的與其它CryI或Bt毒素使用相關(guān)的交叉抗性現(xiàn)象。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物用野生昆蟲測試，并使用下文描述的生物測定記錄結(jié)果。在交叉抗性生物測定中使用兩個CryIAc和CryIC抗性系小菜蛾(Plutella xylostella)。獲得的結(jié)果證實了Cry9Aa毒素的獨特性，它殺死了CryIAc和CryIC抗性昆蟲的幼蟲。此外，能夠表達(dá)Cry9Aa毒素的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系殺死了小菜蛾抗性品系的幼蟲。
附圖簡述

圖1描述了蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種的Cry9Aaδ-內(nèi)毒素的殺蟲活性N端結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
圖2描述了用于在高等植物中高表達(dá)的合成DNA序列，它編碼蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種的Cry9Aaδ-內(nèi)毒素的殺蟲活性N端結(jié)構(gòu)域。
圖3描述了天然的(SEQ ID NO4)、截短的(SEQ ID NO3)和合成的(SEQ ID NO2)cry9Aa基因序列的對比。起始和終止密碼子位點以及在截短或合成序列中引入的限制位點用陰影框表示。在合成和截短的序列中改變的核苷酸標(biāo)以下劃線。分別合成在各個限制位點之內(nèi)的片段。此后檢驗它們以避免錯配，并一起融合到合成序列中。
圖4描述了天然的、截短的和合成的Cry9Aa蛋白序列的對比。對截短和合成的基因蛋白序列中改變的氨基酸標(biāo)以下劃線。
圖5描述了包含cry9Aa基因的天然截短序列(A)、合成cry9Aa基因(B)和與uidA基因的翻譯融合(C)的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物。在框中的縮寫如下RB、LB—Ti質(zhì)粒的T-DNA的右邊界和左邊界；pAnos、pAg7、pAocs—不同來源的聚腺苷酸化信號位點；AMV—CaMV(花椰菜花葉病毒)的非翻譯前導(dǎo)序列；35SSp—CaMV的雙35S啟動子；nosp—胭脂堿合酶基因啟動子；nptII—新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶-II基因；hpt—潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因uidA(GUS)-β葡糖醛酸糖苷酶基因。除了pBIN和pHTT植物轉(zhuǎn)化載體之外，所顯示的其它名稱為限制酶。
圖6描述了花椰菜轉(zhuǎn)基因植物抗小菜蛾昆蟲的生物測定。
將花椰菜植株置入裝有培養(yǎng)的小菜蛾的籠中。所述植株在所述籠中培養(yǎng)10天。此后進(jìn)行拍照。上面的兩個植株是未轉(zhuǎn)化的對照。下面的兩個植株是具有低或中(A-10)和/或平均(A-0)Cry9Aa毒素表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因系花椰菜。所述A-10系植株受到了一些由從對照植株轉(zhuǎn)移的所有時期的幼蟲引起的傷害。所述A-0系植株僅具有非常小的昆蟲咬傷痕跡。兩個對照植株完全被所述昆蟲的侵襲所傷害，并在以后的幾天中死亡。
圖7描述了在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)的合成cry9Aa基因的分子分析。
圖7A描述了總RNA的RNA印跡。
將含有3μg煙草植株總RNA的樣品在凝膠中上樣。按照供應(yīng)商Boehringer Mannheim的說明書進(jìn)行RNA印跡。所示樣品如下C為非轉(zhuǎn)化對照植物的RNA；T-GS 1-9是轉(zhuǎn)基因煙草系用T3 RNA聚合酶由所述基因序列合成的對照RNA以含有0.6pg-1.6pg-5.0pg-15pg的系列在所述凝膠中上樣。T-GS 1、2和4系顯示約15pg RNA的信號。意指所述表達(dá)為約5pg/μg總RNA。T-GS 3和7系顯示約3pg的信號，意指所述表達(dá)為約1pg/μg總RNA。T-GS 9系顯示約1pg的信號，意指所述表達(dá)為約0.3pg/μg總RNA。cry9Aa mRNA的平均表達(dá)為2pg/μg總RNA。
圖7B描述了用合成cry9Aa轉(zhuǎn)化的煙草植株的蛋白質(zhì)印跡。
將包含10μg用合成cry9Aa轉(zhuǎn)化的煙草植株的完全可溶蛋白的樣品在8％變性PAGE中上樣，進(jìn)行電泳并在半干印跡條件下印跡在硝化纖維素膜上。所述膜用1％BSA封閉。使用針對蘇云金芽孢桿菌的晶體蛋白并綴合丙酮沉淀的煙草、花椰菜和蕪菁?xì)W洲油菜蛋白粉的兔抗體血清進(jìn)行溫育。所述樣品是煙草TGS-2..9轉(zhuǎn)基因系，C為非轉(zhuǎn)化煙草對照，Cry9Aa 10和25ng為在大腸桿菌中由cry9Aa合成序列表達(dá)的蛋白。此對照蛋白的大小由于額外的LacZ前導(dǎo)蛋白而比在所述植物中表達(dá)的所述蛋白長30個氨基酸。按照此蛋白質(zhì)印跡，T-GS-2系表達(dá)的Cry9Aa蛋白為0.2％可溶性蛋白或600ng/g葉片組織，所述T-GS-4系表達(dá)為0.15％可溶性蛋白或1020ng/g葉片組織，所述T-GS-8系表達(dá)為0.3％可溶性蛋白或1440ng/g葉片組織，而所述T-GS-7系表達(dá)為0.2％可溶性蛋白或1020ng/g葉片組織。在煙草植物中的Cry9Aa平均表達(dá)為1μg/g葉片組織或0.2％可溶性蛋白。
圖8描述了天然截短的和GUS融合的cry9Aa基因構(gòu)建物的表達(dá)的分子分析。
圖8A描述了用截短的天然序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草的總RNA的RNA印跡。
將含有3μg煙草植株總RNA的樣品在凝膠中上樣。按照供應(yīng)商Boehringer Mannheim的說明書進(jìn)行RNA印跡。所述樣品如下T-GS-3...11是用截短的天然cry9Aa基因轉(zhuǎn)化的煙草系；用T3 RNA聚合酶在pBluescript上生產(chǎn)0.2-5pg cry9Aa RNA的陽性對照。在所述煙草泳道上的信號可見為0.1-3pg。意指mRNA表達(dá)為0.03-1pg/μg總RNA，平均表達(dá)約0.2pg/μg總RNA。
圖8B描述了用與uidA(GUS)因翻譯融合的截短的天然序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草的總RNA的RNA印跡。
用與uidA(GUS)基因按照翻譯讀框融合的截短的天然cry9Aa序列轉(zhuǎn)化T-G/G-10...21系煙草。C是非轉(zhuǎn)化煙草植株的RNA。陽性對照為用T3 RNA聚合酶在pBluescript上生產(chǎn)的1-10-20pg的cry9Aa RNA。在所述煙草泳道上的信號為0.6-1.5pg cry9Aa mRNA。意指mRNA表達(dá)為0.2-0.5pg/μg總RNA，平均表達(dá)約0.3pg/μg總RNA。
圖8C描述了用截短的天然(T-GT)以及用GUS融合的(T-G/G)cry9Aa基因序列轉(zhuǎn)化的煙草植株的蛋白質(zhì)印跡。
將包含50μg用截短的和GUS融合的天然cry9Aa基因轉(zhuǎn)化的煙草植株的總可溶性蛋白的樣品在8％變性PAGE中上樣，進(jìn)行電泳并在半干印跡條件下印跡于硝化纖維素膜上。所述膜用1％BSA封閉。使用針對蘇云金芽孢桿菌的晶體蛋白并綴合丙酮沉淀的煙草、花椰菜和蕪菁?xì)W洲油菜蛋白粉的兔抗體血清進(jìn)行溫育。使用的樣品如下用截短的天然序列轉(zhuǎn)化的煙草T-GT-3..11系；T-GS-4(用合成cry9Aa序列轉(zhuǎn)化的煙草系)—50μg包含75ng Cry9Aa肽的總可溶性蛋白，作為陽性對照；和用截短的天然Cry9Aa-GUS翻譯融合構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的T-G/G14a...21煙草系。在用截短的天然cry9Aa基因或GUS融合的cry9Aa基因轉(zhuǎn)化的煙草系中未檢測到Cry9Aa信號。
圖8D描述了以不同比例混合的T-GS-8煙草系和非轉(zhuǎn)化NTS煙草系的蛋白質(zhì)印跡。將煙草可溶性蛋白樣品混合并按圖示順序上樣。以和圖8C樣品相同的蛋白質(zhì)印跡步驟對所述凝膠和膜進(jìn)行操作。最后的泳道可用作圖8C的陰性對照。該蛋白質(zhì)印跡表明，稀釋50倍的T-GS-8樣品仍然可檢測到Cry9Aa信號。意指天然cry9Aa基因構(gòu)建物產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物至少低于所述合成序列50倍。
圖9描述了在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯Pito.栽培品種中表達(dá)的合成cry9Aa基因的分子分析。
圖9A描述了總RNA的RNA印跡。
將含有3μg馬鈴薯植株總RNA的樣品在凝膠上樣。所示樣品如下C為非轉(zhuǎn)化對照馬鈴薯植株的RNA；P-GS 1-8是轉(zhuǎn)基因煙草系。用T7 RNA聚合酶由所述基因序列合成的對照RNA以0.6pg-1.6pg-5.0pg-15pg的系列在所述凝膠中上樣。P-GS 1、2和4系顯示約10pgRNA的信號。意指表達(dá)為約3pg/μg總RNA。P-GS 5、7和8系顯示約3pg的信號，意指所述表達(dá)為約1pg/μg總RNA。cry9Aa mRNA的平均表達(dá)為2pg/μg總RNA。
圖9B描述了用合成cry9Aa轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株P(guān)ito.栽培品種的蛋白質(zhì)印跡。
將包含40μg用合成cry9Aa轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株的總可溶性蛋白的樣品在8％變性PAGE中上樣，進(jìn)行電泳并在半干印跡條件下印跡于硝化纖維素膜上。所述膜用1％BSA封閉。使用針對蘇云金芽孢桿菌的晶體蛋白并綴合丙酮沉淀的煙草、花椰菜和蕪菁?xì)W洲油菜蛋白粉的兔抗體血清進(jìn)行溫育。所使用的樣品是馬鈴薯PGS-1...8轉(zhuǎn)基因系；C為非轉(zhuǎn)基因煙草對照，Cry9Aa 5和15ng為在大腸桿菌中由cry9Aa合成序列表達(dá)的蛋白。此對照蛋白由于其含有額外的LacZ前導(dǎo)肽而比在所述植物中表達(dá)的蛋白長30個氨基酸。按照該蛋白質(zhì)印跡，P-GS-1和P-GS-8系顯示約10ng的Cry9Aa信號，這相當(dāng)于表達(dá)0.03％可溶性蛋白或300ng/g葉片組織。P-GS-2和5系顯示的表達(dá)較低。
圖10描述了在轉(zhuǎn)基因花椰菜Asterix栽培品種中表達(dá)的合成cry9Aa的分子分析。
圖10A描述了總RNA的RNA印跡。
將含有3μg花椰菜植株總RNA的樣品在凝膠中上樣。所示樣品如下非轉(zhuǎn)化對照植物的核酸(NA)；顯示殺蟲特性的轉(zhuǎn)基因花椰菜的A-0和A-10系。用T3 RNA聚合酶由所述基因序列合成的對照RNA以1.25pg-2.5pg-5.0pg的系列在所述凝膠中上樣。所述A-0系顯示約2pg RNA的信號，意指所述表達(dá)為約0.7pg/μg總核酸。A-10系具有約0.6pg的信號，意指所述表達(dá)為約0.2pg/μg總RNA。
圖10B描述了花椰菜Asterix栽培品種的蛋白質(zhì)印跡。
在蛋白質(zhì)印跡中使用包含50μg花椰菜總可溶性蛋白的樣品。樣品如下C是非轉(zhuǎn)化植物對照；A-0是用合成cry9Aa序列轉(zhuǎn)化的花椰菜系。在大腸桿菌中表達(dá)的5和20ng的Cry9Aa蛋白作為陽性對照。A-0泳道顯示濃度約5ng所述毒素蛋白的Cry9Aa陽性信號。意指所述表達(dá)為約100ng Cry9Aa蛋白/g葉片組織或0.01％可溶性蛋白。
圖11描述了在用合成cry9Aa基因序列轉(zhuǎn)化的蕪菁?xì)W洲油菜植株Valtti栽培品種中表達(dá)的cry9Aa mRNA的RNA印跡分析。
將含有3μg蕪菁?xì)W洲油菜植株總RNA的樣品在凝膠中上樣。所示樣品如下C為非轉(zhuǎn)化對照植物的RNA；V-GS-12.1和V-GS-14.3系為顯示殺蟲特性的轉(zhuǎn)基因蕪菁?xì)W洲油菜。用T3 RNA聚合酶由所述基因序列合成的對照RNA以1.25pg-2.5pg-5.0pg的系列在所述凝膠中上樣。兩個系都顯示約0.6pg RNA的信號，意指所述表達(dá)為約0.2pg/μg總RNA。用于本發(fā)明的供體生物、啟動子、前導(dǎo)序列、載體、細(xì)菌和昆蟲以下是用于本發(fā)明的材料的不完全清單。但是，本發(fā)明不限于使用所列出的材料。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易地想到其它合適的容易獲得的材料和生物來源，并也可以將它們應(yīng)用于本發(fā)明，以便達(dá)到相同的結(jié)果。Cry-基因供體生物蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種俄羅斯工業(yè)微生物遺傳研究所，莫斯科，Doroznyi proezd 1。植物啟動子CaMV 35S啟動子(Odell，J.T.等，Nature，第313卷，第810-812頁，1985年二月28日；Qun Zhu等，Bio/technology，第12卷，第807-812頁，1994)。前導(dǎo)序列AMV前導(dǎo)序列(Datla，R.S.S.，1993 Plant Sci.94139-149)。植物轉(zhuǎn)化雙元Ti載體PGPTV載體(Becker等，Plant Mol.Biol.201195-1197，1992)。
pBIN載體(Firsch，D.A.等，Plant Mol.Biol.27405-409，1995)。植物轉(zhuǎn)化共整合Ti載體pHTT(Elomaa，P.等，Bio/Technol，11508-511(1993))。細(xì)菌菌株具有pGV3850的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1(Zambryski等，EMBO J22143-2150，1983)、具有pGV2260的根癌農(nóng)桿菌菌株C58C1(Deblaere等，Nucl.Acids.Res.134777-4788，1985)、根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105(Hood等，Transgenic research 2208-218，1993)和具有pAL4404輔助質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404(Hoekema等，Nature(倫敦)303179-180，1983)。昆蟲品系由Viikki實驗農(nóng)場搜集的野生型小菜蛾。雖然從Cornell大學(xué)的T.Shelton教授處接受了兩個CryIAc和CryIC抗性小菜蛾品系，但這樣的品系也可由其它來源購買和獲得。發(fā)明詳述在本發(fā)明中使用的大多數(shù)術(shù)語的含義與它們在重組DNA技術(shù)領(lǐng)域、分子生物學(xué)以及在植物生產(chǎn)和昆蟲學(xué)相關(guān)科學(xué)中通常具有的含義相同。但是，某些術(shù)語以稍微不同的方式使用，以下對其進(jìn)行更詳細(xì)的解釋。
術(shù)語“修飾合成DNA序列”是指通過合成方法(諸如核苷酸測序)和/或通過替換截短的DNA序列(SEQ ID NO3)中的核苷酸制備的DNA序列，其中所述截短的DNA序列是通過將密碼子偏倚改變?yōu)樗x擇的高等植物(優(yōu)選雙子葉植物，諸如蕓苔屬植物)的優(yōu)選密碼子由cry9Aa基因獲得，或是通過使用所編寫的表中列出的雙子葉、單子葉和/或選擇的高等植物(例如蕓苔屬植物)的優(yōu)選密碼子由其組合獲得。本發(fā)明的修飾DNA序列編碼特征為所述氨基酸序列(也示于圖1的SEQ ID NO1)或其變體的殺蟲蛋白。最優(yōu)選的合成DNA序列是也示于圖2的SEQ ID NO2或其修飾序列。
術(shù)語“其修飾序列”是指SEQ ID NO3的至少5％優(yōu)選更多的核苷酸已經(jīng)改變，使得它們與所選擇的高等植物例如蕓苔屬植物更相容。換句話說，所述修飾序列包含所有的合成DNA序列，在所述合成DNA序列中至少10-20個密碼子、優(yōu)選15個密碼子、但不是所有的密碼子，已經(jīng)改變。而且，術(shù)語“其修飾序列”是指已經(jīng)由所述DNA序列(SEQ ID NO3)中去除了推定的聚腺苷酸化、剪接和mRNA不穩(wěn)定信號序列，以提供示于圖2的修飾合成DNA序列(SEQ ID NO2)。它也指已經(jīng)使起始密碼子鄰近位置與所選擇的高等植物更相容。本發(fā)明的修飾合成DNA序列的唯一先決條件是，它們應(yīng)當(dāng)仍然編碼其特性和/或活性與蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種(Btg)的cry9Aa基因編碼的截短的殺蟲蛋白“大致相似”或“基本相同”的內(nèi)毒素。要強調(diào)其重要性的是，天然基因及其定點突變不足以提供本發(fā)明的高表達(dá)的、修飾的、合成的DNA序列。為了得到具有本發(fā)明需要特性的合成DNA序列，必須具有合成DNA序列以及必須以基于以下描述的知識和經(jīng)驗的技術(shù)方式對其改變。
術(shù)語“cry9Aa”(在Hfte和Whiteley分類中為cryIG(1989)Microbiology Review 52242-255)，包括cry9Aa1基因和cry9Aa2基因，因為二者都編碼相同的毒素區(qū)并都具有相同的DNA序列和氨基酸序列。所述“cry9Aa”以前稱為crylG基因。
術(shù)語“大致相似”是指“基本相同”或由本發(fā)明的DNA序列編碼的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)與天然cry9Aa(cryIG)基因編碼的蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種鱗翅目活性δ內(nèi)毒素N端、胰蛋白酶穩(wěn)定的部分結(jié)構(gòu)大致相同，但所述氨基酸序列可與所述δ內(nèi)毒素稍微不同，先決條件是改變的或不同的序列仍然具有與天然cry9Aa基因編碼的氨基酸序列基本相同的殺蟲作用和特性。
可以使用在N末端和/或C末端的微量截短或在中間區(qū)的微量替換，改變所選擇的具有胰蛋白酶切割位點的氨基酸序列(SEQ IDNO1，也示于圖1)。所述C端或N端截短的大小以及替換的數(shù)目可根據(jù)其中出現(xiàn)所述截短或替換的結(jié)構(gòu)域而不同。在所述蛋白的活性結(jié)構(gòu)域中，所述替換應(yīng)當(dāng)不超過10個氨基酸殘基，優(yōu)選不超過5個，最優(yōu)選少于2個，而與殺蟲作用較少相關(guān)的結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基可以包含更多的替換。這些截短或替換可以用本身已知的方法進(jìn)行。然而，重要的是所述截短或替換應(yīng)當(dāng)不改變所述特性，尤其是不改變?nèi)缤ㄟ^本發(fā)明公開的生物測定確定的所述內(nèi)毒素的殺蟲作用。特別是，所述微量截短和/或替換不應(yīng)使所述內(nèi)毒素的有效性低于特征為具有SEQID NO1或圖1的天然Cry9Aa內(nèi)毒素。
術(shù)語“實現(xiàn)抗性管理策略”包括例如以下的用于展開(deploy)昆蟲抗性的策略使用強表達(dá)單個基因、多個基因的基因策略，例如錐形基因(pyramiding gene)和/或嵌合基因；使用組成型、組織特異性和/或誘導(dǎo)型啟動子的基因啟動子策略，例如創(chuàng)傷；使用高劑量、低劑量和/或混合物的基因表達(dá)策略；上述以外的所有策略使用相同的單個基因策略、基因混合物、基因旋轉(zhuǎn)(gene rotation)、鑲嵌種植和/或空間或時間庇護(hù)(refuge)的野外策略。
為了應(yīng)用所述策略，需要新的DNA序列和/或具有獨特特性的基因。
術(shù)語“提高的mRNA加工”是指所述修飾合成DNA序列在轉(zhuǎn)基因植物中輸送成功加工的外源基因mRNA。
術(shù)語“改善的特性”最主要是指所述毒素蛋白足夠獨特，并以能有效而穩(wěn)定控制昆蟲的足夠量表達(dá)，以及增進(jìn)抗性管理的發(fā)展，但該術(shù)語還包括其它改善的定制特性，諸如在野外實驗中提高植物組織生產(chǎn)以及由此引起所述蛋白的殺蟲作用提高。通過選擇由獨特cry9Aa基因編碼的氨基酸序列，并在制備修飾合成DNA序列時使用截短的合成DNA序列作為主要成分，以及提供具有用實踐知識制備的定制修飾的所述序列，可以獲得所述改善特性。所述修飾合成DNA序列包括用本身已知的方法去除推定的聚腺苷酸化、剪接和mRNA信號不穩(wěn)定序列以及去除發(fā)夾環(huán)。
所述“改善的特性”還可以通過向選擇的高等植物方向改變優(yōu)選密碼子獲得，優(yōu)選向雙子葉植物優(yōu)選密碼子改變，最優(yōu)選向蕓苔屬植物優(yōu)選密碼子或其組合改變。較少優(yōu)選單子葉植物優(yōu)選密碼子。此外，“改善的特性”可通過使合成DNA序列的起始密碼子鄰近位置與高等植物更相容或?qū)ζ涓硐攵@得。
術(shù)語“提高的表達(dá)”是指所選擇的植物能夠表達(dá)提高量的內(nèi)毒素，所述量足以有效控制靶昆蟲。這意味著與先前使用的構(gòu)建物相比，所述毒素以能夠殺死幼蟲的量表達(dá)。
術(shù)語“能夠表達(dá)有效量的所述蛋白”是指轉(zhuǎn)化的植物應(yīng)當(dāng)以至少這樣的量表達(dá)所述殺蟲蛋白即使得所述植物材料包含足以殺死靶昆蟲實質(zhì)部分的內(nèi)毒素。在實驗室條件下表達(dá)的有效量對小菜蛾和歐洲粉蝶(Pieris brassica)以及馬鈴薯塊莖蛾的理想殺蟲膳食作用應(yīng)當(dāng)至少為LC50＝60ng/ml膳食，優(yōu)選為80ng/ml最優(yōu)選為100ng/ml。這些量兩天使用1次。一般可以認(rèn)為，有效時間越長，需要的量越少。由于野生昆蟲基因組的多樣性以及所述植物中基因表達(dá)的天然變異性，在野外實驗中需要的平均膳食作用最好應(yīng)當(dāng)稍高。因此，理想的是在野外實驗中表達(dá)的毒素量也應(yīng)當(dāng)比實驗室實驗所需的量稍高。
術(shù)語“密碼子優(yōu)選”或“密碼子偏倚”是指基于最高使用頻率選擇在所選擇物種活性基因編碼序列中的特定氨基酸的核苷酸密碼子。
術(shù)語“去除推定的聚腺苷酸化”是指去除連接于真核基因末端、在所述序列內(nèi)的cry基因中存在的聚腺苷酸樣信號序列，這導(dǎo)致在mRNA加工過程中所述編碼序列截短。在構(gòu)建合成cry基因序列時去除這些序列。
術(shù)語“去除剪接和mRNA不穩(wěn)定信號序列”是指通常存在于真核基因內(nèi)含子序列中的、涉及所述基因剪接和具有重復(fù)的ATTTA基元的不穩(wěn)定序列的分支序列(branch-sequence)，通過所述合成cry序列的核苷酸置換去除。
術(shù)語“改變的起始密碼子的鄰近位置”是指起始密碼子鄰近位置(即在起始密碼子周圍的序列)已被改變得與高等植物更相容。
術(shù)語“去除”是指改變或替換所述DNA序列中的核苷酸，使得信號基元消失，但所述DNA序列編碼蛋白具有與天然Cry9Aa毒素大致相似的氨基酸。
術(shù)語“與已知殺蟲蛋白明顯不同的殺蟲蛋白”是指在所述Cry9Aa毒素的N端殺蟲部分中的氨基酸序列應(yīng)當(dāng)與那些由其它市售cryI基因編碼的殺蟲蛋白明顯不同，優(yōu)選超過50％不同。它還指所選擇的cry基因應(yīng)當(dāng)對已知更常用殺蟲蛋白的抗性昆蟲基本沒有交叉抗性。換句話說，它應(yīng)當(dāng)能夠克服與交叉抗性有關(guān)的問題。
術(shù)語“能夠顯示出明顯不同的特性”是指選擇的殺蟲蛋白的選擇的結(jié)構(gòu)域的特性應(yīng)當(dāng)與天然Cry9Aa毒素具有大致相似的效果，但同時它應(yīng)當(dāng)結(jié)合與其它已知毒素的受體明顯不同的受體。例如本發(fā)明選擇的毒素基本沒有交叉抗性，而交叉抗性是其它殺蟲CryI蛋白的一個典型特性。假定此特性為不同受體結(jié)合模式或作用方式的象征。
術(shù)語“能夠顯示出與選擇的殺蟲蛋白的選擇的結(jié)構(gòu)域的特性大致相似的特性”是指由本發(fā)明的修飾合成DNA序列編碼的殺蟲蛋白應(yīng)當(dāng)具有殺蟲活性或作用，所述殺蟲活性或作用與由天然Cry9Aa基因編碼的內(nèi)毒素的殺蟲活性或作用相比同樣好或更好。
術(shù)語“高等植物”特別指開花植物，根據(jù)分類編目系統(tǒng)被子植物和裸子植物都包括在內(nèi)。
術(shù)語“DNA構(gòu)建物”是指包含與其它DNA序列或片段結(jié)合的本發(fā)明的修飾合成DNA序列的任何DNA構(gòu)建物、載體和質(zhì)粒，用于克隆、轉(zhuǎn)化、表達(dá)、分泌等，包括例如啟動子、增強子、信號序列、終止子等，選自本身已知的分別用于克隆、轉(zhuǎn)化原核生物或真核生物的載體、質(zhì)?；蚱淦巍Ｋ鏊拗骺梢赃x自細(xì)菌、酵母、真菌、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞(著重強調(diào)植物細(xì)胞)，并可以增強所述殺蟲蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。發(fā)明綜述本發(fā)明涉及由已知對宿主昆蟲具有很高毒性水平的蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的δ-內(nèi)毒素或Bt毒素。所謂的Cry或Bt毒素負(fù)責(zé)細(xì)菌的殺蟲作用。只要細(xì)菌形成孢子，這些蛋白就在孢子中形成晶體。也已知毒性根據(jù)靶昆蟲而變化。如上所述，存在幾種類型的內(nèi)毒素，還已知這些內(nèi)毒素具有不同的特性和作用方式。本發(fā)明人選擇了一種已知獨特的、其特性與其它更常用的內(nèi)毒素的特性明顯不同的內(nèi)毒素，以研究編碼明顯不同類型的內(nèi)毒素的修飾DNA序列是否可以用于殺蟲控制，并提供了一種抗性管理系統(tǒng)工具。本發(fā)明人從以下假設(shè)著手即如果獲得修飾合成DNA序列，則將它們導(dǎo)入高等植物中，提高對靶昆蟲侵襲的耐受性，包括增加特異性、效力、毒性和毒性特性的穩(wěn)定性。
通過有效的抗性管理系統(tǒng)，可以展開在昆蟲中產(chǎn)生的抗性，所述管理系統(tǒng)包括基因策略、基因啟動子策略和野外策略，諸如使用具有不同Bt基因的植物的一年生作物輪作、混合種子中的Bt基因混合物、鑲嵌種植和/或空間或時間庇護(hù)。這些策略使得易于產(chǎn)生抗性的昆蟲與非抗性或野生型交配，增加了易感昆蟲的出現(xiàn)率，并延遲了在昆蟲群中出現(xiàn)耐受性和抗性。本發(fā)明人認(rèn)識到，為了提供穩(wěn)定抗性管理策略，以對抗交叉抗性現(xiàn)象，需要新的具有獨特特性的DNA序列和/或基因，它們有利于開發(fā)產(chǎn)生作用模式明顯不同和/或獨特的毒素的新轉(zhuǎn)基因植物。
復(fù)雜的作用機制和高受體結(jié)合特異性使得所述毒素對所有其它生物都無害，除了在中腸中具有正確受體分子的昆蟲。通常假定針對蘇云金芽孢桿菌的δ-內(nèi)毒素的昆蟲抗性起因于所述受體分子的缺失、去除和改變。例如Cry9Aa，與CryIAc和CryIC(截短的或天然的)不同，它對小菜蛾和歐洲粉蝶以及馬鈴薯塊莖蛾具有殺蟲作用，但對歐洲玉米螟(Ostrinia nublialis)不是非常有效。
為了獲得增加的殺蟲抗性和解決在靶昆蟲中的Bt毒素耐受性產(chǎn)生或抗性問題，本發(fā)明人構(gòu)建了編碼蛋白的新的完全修飾的合成DNA序列，所述蛋白已知盡量不同于市售使用的并且靶昆蟲已對其產(chǎn)生耐受性的那些蛋白。由于其獨特的序列和在植物中使Bt毒素基因形成錐形的高潛力，本發(fā)明人選擇了蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種(Btg)的殺蟲性Cry9Aa蛋白進(jìn)行調(diào)查和研究，通過使用計算機程序的相似性實驗測定，所述Cry9Aa蛋白與其它的常規(guī)CryI蛋白相比，氨基酸同一性百分率小于34％。
在抗性管理的范圍內(nèi)，Cry9Aa1基因似乎是一個好的選擇，選擇它的原因是已知它是強力毒素，其特性明顯不同于靶昆蟲已顯示對其耐受性增加的更常用和市售可得的內(nèi)毒素。作為一種新的昆蟲毒素，Cry9Aa可以用于緩慢降低作物中產(chǎn)生的毒素耐受性。
本發(fā)明人想研究對昆蟲腸具有特異性作用機制的Cry毒素，例如在靶昆蟲消化道中的特異性和/或選擇性受體靶。因為CryIG(現(xiàn)在為Cry9Aa)在毒性域中具有與其它已知蘇云金芽孢桿菌Cry蛋白完全不同的氨基酸序列，所以認(rèn)為該序列是所述基因有其獨特的受體識別系統(tǒng)的象征。由未公開的資料也可得出相同的結(jié)論，按照該資料，所述基因?qū)W洲玉米螟的活性明顯低于CryAb。這也證實了由該基因編碼的蛋白有其獨特的結(jié)合受體和/或作用模式的觀點。
蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種(Btg)具有幾種δ-內(nèi)毒素基因(Shevelev等，Mol.Biol.(Rus).283(1)，388-393)。其中兩個鑒定為CryIG(在本文中命名為Cry9Aa(Smulevich等，(1991)FEBS Lett.2931-2，25-28)和CryIx(Shevelev等，F(xiàn)EBS Lett.(1993)33679-82)，并已經(jīng)在俄羅斯莫斯科的微生物遺傳研究所克隆。按照Hfte和Whiteley(1989)，Microbiological Review 5224-55的分類，CryIG蛋白屬于在細(xì)菌孢子中形成雙錐形晶體的鱗翅目活性CryI類Btδ-內(nèi)毒素。CryIGδ-內(nèi)毒素蛋白的氨基酸序列明顯不同于其它Bt毒素。它只涉及以上提及的蛋白CryIX。CryIG的抗胰蛋白酶的、殺蟲活性的N端部分由含有632個氨基酸的肽組成。
在所述昆蟲的腸中，已證實Bt毒素被胰蛋白酶加工，產(chǎn)生一個N端的630-675個氨基酸長的殺蟲活性肽，其毒性通過其與昆蟲腸中的特異性受體分子結(jié)合而顯現(xiàn)，結(jié)果在上皮中形成離子通道。該行為導(dǎo)致離子外流和引起昆蟲死亡的腸功能麻痹。一般認(rèn)為，結(jié)合受體部位和靶昆蟲特異性相關(guān)，還決定著哪類昆蟲易感，哪類昆蟲不易感。人們進(jìn)一步認(rèn)為，在昆蟲腸中缺失或改變特異性受體分子導(dǎo)致出現(xiàn)對所述毒素的耐受性和抗性。
Gleave，A.P.等(1998)，(Mol.Breed.4459-472)報導(dǎo)，用cryIAc基因轉(zhuǎn)化的馬鈴薯系對幼蟲生長和存活率的影響力比cry9A2基因更顯著，但他們似乎忽略了cry9Aa基因在抗性管理策略中的潛能。實際上，在cry9Aa2基因中，天然核苷酸序列中的僅4.2％的核苷酸通過定點誘變替換。攜帶所述定點突變基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株顯示出殺蟲特性，但死亡率不高。在9天內(nèi)僅在1個轉(zhuǎn)基因系中100％的幼蟲死亡，而在其它煙草系中有20-50％的所述幼蟲存活。令人遺憾的是，該報導(dǎo)沒有包括有關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)的內(nèi)容，這使得難以比較結(jié)果。Gleave，A.P.等(1998)展示的資料與Perlak，F(xiàn).J.等(1991)(Proc.Ntal.Acad.Sci.USA 883324-3328)的內(nèi)容相關(guān)聯(lián)，在該文獻(xiàn)中得出的結(jié)論是，部分修飾的cry基因使轉(zhuǎn)基因植物具有殺蟲性，但部分修飾沒有提供足夠高的Bt毒素表達(dá)，從而不能在野外試驗中獲得穩(wěn)定的結(jié)果。
然而，在本發(fā)明中表明，當(dāng)用表達(dá)具有23％的改變序列的合成cry9Aa DNA序列的轉(zhuǎn)基因花椰菜喂食小菜蛾幼蟲(與發(fā)育時期無關(guān))時，小菜蛾幼蟲在2天內(nèi)死亡。生物測定的數(shù)據(jù)提示，帶有本發(fā)明的修飾合成DNA序列的植株表達(dá)多得多的殺蟲蛋白，因為馬鈴薯塊莖蛾在喂食的5天中其LC50為80ng/ml膳食，而菱背蛾在喂食的6天中其LC50為120ng/ml膳食。
因此，本發(fā)明人成功地證實，用cry9Aa基因的修飾合成DNA序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的毒素產(chǎn)物比用部分修飾基因轉(zhuǎn)化的植物多。提高的表達(dá)足以能夠使野外試驗穩(wěn)定。
由未公開的資料也可得出相同的結(jié)論，按照該資料，所述cry9Aa基因具有與其它cryI基因不同的靶物種分布，并且抗歐洲玉米螟的活性低于CryAb。該結(jié)果也證實了由cry9Aa編碼的蛋白有其獨特結(jié)合受體部位和/或作用模式的觀點。
本發(fā)明的修飾合成DNA序列具有改善的特性，尤其是當(dāng)其在高等植物中表達(dá)時。所述改善的特性包括通過提高mRNA加工、穩(wěn)定性以及翻譯來增強表達(dá)，而所述編碼的內(nèi)毒素具有的功效與天然Cry9Aa內(nèi)毒素大致相同。本發(fā)明的合成DNA序列可用于改善殺蟲控制，并用作昆蟲抗性管理計劃的工具。當(dāng)將所述修飾合成DNA序列導(dǎo)入高等植物中時，其提高了對靶昆蟲侵襲的耐受性，包括增加特異性、功效、毒性和穩(wěn)定性。
使用cry9Aa基因的截短的DNA序列(SEQ ID NO3)，因為用該基因的長天然序列轉(zhuǎn)化植物的嘗試先前已經(jīng)失敗了(Vaeck，M.等，(1987)Nature 32833-37)。本發(fā)明人在不同的部位對cry9Aa毒素基因進(jìn)行截短，本發(fā)明人也因此從截短形式的Cry9Aa基因編碼內(nèi)毒素著手。
通過提供編碼蛋白或其變體的cry9Aa基因(SEQ ID NO4)的截短的DNA序列(SEQ ID NO3)的合成DNA序列，達(dá)到所述提高，所述蛋白特征為具有氨基酸序列(SEQ ID NO1)和圖1，所述變體仍然具有和殺蟲蛋白Cry9Aa大致相似的殺蟲作用。
已經(jīng)在幾個出版物中描述了轉(zhuǎn)化截短的cry基因的方法，所述方法也用于提供本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體和轉(zhuǎn)基因植物。煙草的轉(zhuǎn)化描述于Barton，K.A.等，(1987)Plant Physiol.851103-1109；Vaeck，M.等(1987)Nature 32833-37；Carozzi，N.B.等，(1992)Plant Mol.Biol.20539-548)，番茄的轉(zhuǎn)化描述于Fischhoff，D.A.等，(1987)Bio/Technology 5807-813；Delannay，X.等，(1989)Bio/Technology 71265-1269，而甘藍(lán)的轉(zhuǎn)化描述于Bai，Y.Y.等，(1993)Biotechnology in Agriculture，第一屆亞太地區(qū)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研討會繪刊，中國北京，1992年8月20-24日，載于Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture，15，156-159。
本發(fā)明人對編碼cry9Aa基因的殺蟲活性N端域的DNA序列進(jìn)行了修飾。原則上所述編碼蛋白或氨基酸序列應(yīng)當(dāng)沒有改變或與天然基因的編碼蛋白或氨基酸序列相同，主要進(jìn)行核苷酸的改變，以便將密碼子改變?yōu)榫幋a相同氨基酸的另一個密碼子。
所述基因的表達(dá)在翻譯水平上(由mRNA分子合成蛋白)提高。將優(yōu)選密碼子改變?yōu)榕c高等植物相容，所述植物優(yōu)選雙子葉植物，最優(yōu)選蕓苔屬植物。對優(yōu)選密碼子的修飾在20-5倍的范圍內(nèi)提高所述基因表達(dá)，大約提高10倍。
主要在mRNA加工水平上，根據(jù)天然基因的編碼序列去除推定的聚腺苷酸化和剪接信號位點(序列/基元/周圍序列)，從而進(jìn)行進(jìn)一步的提高。將起始密碼子鄰近位置改變?yōu)楦叩戎参飪?yōu)選密碼子(這不可以是物種優(yōu)選密碼子)，并去除所有的ATTTA mRNA不穩(wěn)定基元。去除所述部位是指改變所述序列中的某些核苷酸，使得信號基元消失。
通過提高mRNA加工和mRNA穩(wěn)定性和翻譯(優(yōu)選密碼子和起始密碼子鄰近位置)獲得的cry9Aa基因表達(dá)增加產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)基因植物毒性，并隨后由于較高水平的所述毒素而提高了對昆蟲侵襲的耐受性。所述毒素的特異性未改變，因為所述特異性是所選擇的基因產(chǎn)物的天然特性。所述蛋白的穩(wěn)定性未改變，因為所述氨基酸序列僅通過截短改變，以產(chǎn)生活性毒素蛋白。然而，對蛋白工程領(lǐng)域技術(shù)人員不言而喻的是，可以將所述氨基酸替換或去除至一定程度，而不失去活性。因此，通過重組DNA技術(shù)或蛋白質(zhì)工程產(chǎn)生的、和天然Cry9Aa毒素具有大致相同的結(jié)構(gòu)和大致相同的殺蟲作用的氨基酸序列，包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的所有實施方案中不需要提高轉(zhuǎn)錄或mRNA合成。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案包含去除推定的轉(zhuǎn)錄終止信號，但這對于啟動本發(fā)明不是必須的。用所述啟動子和其它非翻譯的序列調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平。在本發(fā)明的一個實施方案中，僅修飾所述基因的編碼區(qū)的氨基酸序列。
可以將合適的限制位點引入所述DNA序列的編碼區(qū)中，以便能使所述序列分裂成一個或多個常規(guī)大小的DNA片段。相應(yīng)的片段可以用例如使用兩個或多個反向引物的高保真性PCR合成。可以連接合成的片段，并將融合構(gòu)建物克隆入在目前可得到的眾多植物表達(dá)啟動子其中一種下有效的植物轉(zhuǎn)化載體。所述構(gòu)建物在組合型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子下都可以表達(dá)，例如根癌農(nóng)桿菌的Nos啟動子、花椰菜花葉病毒的35S啟動子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)啟動子的小亞基，在此且舉幾個實例。誘導(dǎo)型啟動子可以選自光依賴啟動子，諸如用于在綠葉或其它選擇的組織中表達(dá)的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶啟動子的小亞基，或在某些組織中起作用的啟動子的小亞基，例如用于在馬鈴薯塊莖中表達(dá)的patatin啟動子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員有大量其它可利用的選擇。
所述構(gòu)建物包含合成的cry9Aa基因序列，并轉(zhuǎn)化到煙草、蕪菁?xì)W洲油菜、花椰菜和馬鈴薯植物中。通過蛋白質(zhì)或RNA印跡分析檢驗所述基因表達(dá)的水平。進(jìn)行昆蟲生物測定，結(jié)果與天然截短的cry9Aa1基因的毒性以及所述天然截短基因和uidA(GUS)基因的翻譯融合對比。針對歐洲粉蝶的RNA印跡分析和生物測定表明，所述合成序列可以產(chǎn)生比所述天然序列至少高50倍的蛋白。
因此，獲得的結(jié)果證明了本發(fā)明人指導(dǎo)性假定的正確性，即所述cry9Aa基因?qū)⑻峁└纳频臍⑾x控制，并提供了一個有用的靶昆蟲抗性管理策略工具。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容顯然明白如何在其它高等植物中獲得用于其它靶昆蟲的其它殺蟲蛋白，以便解決在靶昆蟲中的耐受性和抗性問題。
以下更詳細(xì)地描述本發(fā)明。公開的實施例和實驗是為了給本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供更詳細(xì)的指引。即使用顯示最接近蕓苔屬植物優(yōu)選密碼子的修飾合成DNA序列實施所述實施例和實驗，也不應(yīng)將所述實施例解釋為限制了高等植物的保護(hù)范圍。所述實施例表明了在對抗靶昆蟲出現(xiàn)的耐受性和抗性時，應(yīng)如何開始以獲得所需要的結(jié)果。實施例1天然cry9Aa基因的來源、結(jié)構(gòu)和功能在俄羅斯工業(yè)微生物選擇和遺傳研究所的微生物蛋白質(zhì)化學(xué)報道中已經(jīng)描述了蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種(Btg)δ-內(nèi)毒素(Shevelev等，(1994)Mol.Biol.(Rus).283(1)，388-393)。已經(jīng)在Btg細(xì)菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了7種Bt毒素樣基元。Btg在產(chǎn)生孢子過程中形成雙錐形蛋白晶體。所述晶體的主要蛋白成分由Cry9Aa(CryIG)毒素組成。
Cry9Aa毒素屬于形成雙錐形蛋白晶體的CryI鱗翅目活性類的內(nèi)毒素。所述毒素為由3.4kb DNA序列編碼的120kDa蛋白。Cry9Aa原毒素具有產(chǎn)生65kDa的N端殺蟲活性毒素肽的胰蛋白酶切割部位。胰蛋白酶敏感的C端部分包含負(fù)責(zé)晶體形成的保守氨基酸序列。
所述Cry9Aa毒素在其蛋白結(jié)構(gòu)方面與其它cryI毒素相比是非常獨特的。很可能它與昆蟲腸中的獨特的受體分子結(jié)合。在生物測定中，Cry9Aa毒素顯示出對小菜蛾、歐洲粉蝶和馬鈴薯塊莖蛾(Phthorimaeaoperculella)良好的殺蟲性。Cry9Aa對歐洲玉米螟(Ostrinia nubialis)不是很有效。實施例2在生物測定中的交叉抗性研究胰蛋白酶處理的活性毒素結(jié)合位于所述昆蟲腸細(xì)胞膜的受體蛋白分子。結(jié)合至昆蟲腸表面的所述毒素分子在所述腸細(xì)胞膜中形成離子通道。所述離子通道的形成導(dǎo)致離子外流、腸功能麻痹和宿主昆蟲的死亡。
為了闡明所述基因的獨特性，本發(fā)明人對眾所周知的Bt毒素CryIAc和CryIC(按照舊的分類)抗性小菜蛾系進(jìn)行生物測定。所述昆蟲抗性機制是未知的，但猜想可能在所述結(jié)合受體突變。在表1中顯示了使用蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種的晶體Cry9Aa原毒素蛋白進(jìn)行生物測定的結(jié)果。
將純化晶體的懸浮液溶解在裂解荷載緩沖液中，并在PAGE中電泳以定量所述Cry9Aa蛋白。使用具有定量Cry9Aa原毒素的蛋白晶體原液進(jìn)行昆蟲試驗。所述晶體懸浮液混合在6mg/ml酪蛋白溶液中，以便更好的黏附。將約100μl的所述混合物和已知量的所述原毒素在500mg的花椰菜葉片的表面上涂布并干燥。我們計劃將所述毒素在膳食中稀釋5倍。每喂食2天用新鮮的葉子替換用所述Cry9Aa原毒素懸浮液包被的葉子。在所述試驗的每個點評價5個小菜蛾二齡期幼蟲。該試驗的結(jié)果示于表1。
在所述生物測定的結(jié)果中證實了所述Cry9Aa毒素的獨特性?？笴ryIAc以及CryIC毒素的幼蟲對Cry9Aa易感。CryIC抗性幼蟲對Cry9Aa毒素具有部分抗性。但是如果用其濃度相當(dāng)于在具有合成Bt毒素基因的轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的濃度(1-2μg/g葉片組織)的毒素喂食CryIC抗性幼蟲，則它們也死亡。實施例3改善基因結(jié)構(gòu)。密碼子優(yōu)選表。
由天然cry基因序列轉(zhuǎn)化植物在植物細(xì)胞中不產(chǎn)生足量的蛋白擴增。制備兩種不同類型的Cry9Aa基因修飾。截短接近所述胰蛋白酶處理部位的序列(圖3)，以便在所述植物中僅表達(dá)所述毒素的殺蟲活性N端部分(圖1)。
在所述N端胰蛋白酶處理部位之前的12個氨基酸的位置和在所述C端處理部位之后的9個氨基酸的位置切割所述蛋白序列。
使用高保真性PCR進(jìn)行截短。在起始密碼子之前引入限制酶位點BamHI，在ATG密碼子周圍引入限制酶位點SphI。引物5末端含有在終止密碼子之前引入的BglII限制位點；TAA終止密碼子和終止密碼子之后的XmaI位點?？寺〉腜CR產(chǎn)物的中間部分(由BbvI和NcoI限制位點限定)替換回天然序列，以排除PCR過程中可能發(fā)生的錯配。對截短的序列的終端部分進(jìn)行測序，以檢查基因中的情況。
在活性毒素鄰近序列的基礎(chǔ)上，編譯Cry9Aa基因的合成DNA序列(圖2)，使得合成基因蛋白序列與天然序列(圖3)一致。所述基因序列的完全修飾含有以下變化。
起始密碼子ATG的周圍序列的形式為ACCATGG，它在起始密碼子之前含有ACC保守序列，其后含有G堿基(Kozak，M.，(1987)，J.Mol.Biol.196947-950)。同時，引入NcoI限制位點。
修飾所述基因的編碼序列，使密碼子選擇由細(xì)菌改變?yōu)楦叩戎参?，?yōu)選雙子葉植物優(yōu)選密碼子，最優(yōu)選蕓苔屬植物優(yōu)選密碼子。按照編譯的密碼子選擇表(表2)手工進(jìn)行密碼子交換。該表由以下高等植物的優(yōu)選密碼子列組成雙子葉植物、單子葉植物和蕓苔屬植物。本發(fā)明人編譯了甘藍(lán)(Brassica oleracea)、油菜(Brassica campestris)和歐洲油菜(Brassica napus)的基因編碼序列的密碼子選擇表。簡明密碼子常用表是為蕓苔屬植物制訂。根據(jù)可用于不同植物的表制作雙子葉和單子葉優(yōu)選密碼子列。
檢查所述序列中存在的列于下文的不需要序列推定的負(fù)責(zé)剪接的信號位點(Goodball，G.J.和Filipowicz，W.，(1989)Cell 58473-483)、聚腺苷酸化序列(Dean，C.等，(1986)Nuc.Acid Res.14(5)2229-2240；Joshi，C.P.，(1987)Nuc.Acid Res.15(23)9627-9640)和mRNA不穩(wěn)定序列(Shaw，G.并Kamen，R.(1986)Cell，46659-667；Ohme-Takagi，M.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9011811-11815)。發(fā)現(xiàn)2個剪接信號位點、6個聚腺苷酸化序列和14個mRNA不穩(wěn)定序列，由所述序列中去除它們。最后檢查所述基因序列可能存在的折疊。由所述序列中去除13個推定的成環(huán)位點。剪接序列CAN7-9AGTNNA聚腺苷酸化序列AATAAA、AATAAT及其變異體AACCAA、ATATAA、AATCAA、ATACTA、ATAAAA、ATGAAA、AAGCAT、ATTAAT、ATACAT和AAAATA(更保守的A核苷酸用黑體標(biāo)記)mRNA不穩(wěn)定序列ATTTA為比較天然和合成cry基因在作物中的表達(dá)，我們制作了兩種不同類型的cry9Aa基因。首先，我們截短接近胰蛋白酶處理位點的基因(圖3-4)，以在所述植株中僅表達(dá)所述毒素的殺蟲活性N端部分(圖1)。我們切下相當(dāng)于在N端胰蛋白酶處理位點之前的12個氨基酸的位置和C端處理位點之后9個氨基酸的位置的蛋白序列位點的DNA序列(圖4)。
將在圖2和圖3中顯示的cry9Aa基因的合成DNA序列在活性毒素的基礎(chǔ)上編譯，使得所述合成基因的蛋白產(chǎn)物與天然蛋白(圖4)一致。完全修飾的所述基因序列含有示于表2的變化。實施例4合成cry9Aa基因序列篩選修飾的基因序列中存在的需要的限制位點以及在該位點的一個錯配。所述基因序列分為由引入的限制位點(圖3)限定的5個部分(350-430個堿基長)。所述位點的設(shè)計沒有改變所述氨基酸序列。最后，以一個序列對比程序比較天然和合成基因的氨基酸序列，以檢查所述合成基因和所述天然基因編碼相同的氨基酸序列。通過3-4個高保真性PCR循環(huán)，使用6-8個在PAGE中純化的50-80bp長的寡核苷酸合成所述5個部分中的每一個。所述寡核苷酸由DNAgensy and OperoneTechnologies USA訂購。用合適的限制酶切割每個PCR產(chǎn)物，并克隆到載體中。將測序的片段連接成完整的基因序列，該基因序列也進(jìn)行測序，以避免在DNA序列中的錯配。合成的序列位于pUC19的LacZ啟動子之下、BamHI位點之中。在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)位于翻譯讀框中的cry9Aa基因的合成序列。在針對蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種蛋白晶體特異性抗體血清的蛋白質(zhì)印跡中鑒定所表達(dá)基因的蛋白產(chǎn)物。實施例5克隆cry9Aa基因和轉(zhuǎn)化植物在連接AMV UTR的CaMV雙35S啟動子下克隆cry9Aa基因的合成序列(Datla，R.S.S.等，(1993)Plant Sci.94139-149)。將該構(gòu)建物轉(zhuǎn)移至pGPTV-HPT和pGPTV-KAN pBIN19基載體(Becker等，1992，Plant Mol.Biol.201195-1197)中。在根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404、EHA105和C1C58(輔助載體pGV3850)中轉(zhuǎn)化所述載體。將截短型置于相同的雙35S啟動子之下，并在相同的根癌農(nóng)桿菌菌株中轉(zhuǎn)化。
在相同的啟動子共整合pHTT(Elomaa，P.等，(1993)Bio/Technol11508511)載體下克隆截短的GUS翻譯融合基因，并在C1C58(pAVS850)根癌農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)化。所提及的載體和菌株一般可以得到，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以由其它具有適于轉(zhuǎn)化選擇宿主特性的質(zhì)粒、載體菌株代替。
用天然截短基因或截短的GUS翻譯融合基因以及cry9Aa基因的合成序列同時轉(zhuǎn)化煙草植株。只用所述合成序列轉(zhuǎn)化馬鈴薯、花椰菜和蕪菁?xì)W洲油菜植株。實施例6基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)分析使用的構(gòu)建物是在pHTT共整合載體和在雙元pGPTV(pBIN19基)載體中的35SS啟動子下的截短的天然cry9Aa1基因以及uidA基因融合。用于轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌菌株是C1C58pGV3850(作為共整合載體)和LBA4404pLA4404(作為雙元輔助載體)。在pGPTV-HPT中克隆合成的cry9Aa1。以上提及的構(gòu)建物用于轉(zhuǎn)化煙草、蕪菁?xì)W洲油菜、馬鈴薯和花椰菜植株。通過DNA分析核實所述轉(zhuǎn)基因的存在，通過蛋白質(zhì)和RNA分析可以顯示修飾的毒素基因的表達(dá)水平。實施例7合成Cry9Aa1蛋白產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡將cry9Aa1編碼序列置于pBluescript SK(+)的LacZ啟動子下的翻譯讀框中，并在XL1大腸桿菌中表達(dá)。使用針對蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種晶體蛋白的兔抗血清進(jìn)行分析，并通過堿性磷酸酶反應(yīng)顯色。此外，在轉(zhuǎn)基因植物的蛋白質(zhì)分析中所表達(dá)的蛋白用作陽性對照(圖7-10)。實施例8煙草轉(zhuǎn)化在基因轉(zhuǎn)化中使用煙草(Nicotiana tabaccum)三生(Samsung)栽培品種。培養(yǎng)煙草葉盤1天，并在第二天用農(nóng)桿菌接種。共培養(yǎng)期是二天。此后洗出葉盤的農(nóng)桿菌，并在選擇培養(yǎng)基上生長。使用天然截短的、GUS融合的和合成的cry9Aa序列(圖7)進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化。收集大約20個抗生物素抗性再生體進(jìn)行表達(dá)分析。用RNA印跡雜交研究轉(zhuǎn)化植株中的mRNA表達(dá)。此后用DNA和蛋白質(zhì)分析研究RNA陽性植株。由每種轉(zhuǎn)基因類型中收集6種典型的轉(zhuǎn)基因系，用于證明表達(dá)。
測試再生體表達(dá)的mRNA產(chǎn)物。在瓊脂糖凝膠上對總RNA(3μg)進(jìn)行電泳，在真空印跡裝置的正電荷尼龍膜上進(jìn)行印跡。用洋地黃毒苷UTP標(biāo)記的RNA探針，按照Boehringer Mannheim的方法進(jìn)行雜交和發(fā)光檢測。用T7 RNA聚合酶，基于在pBluescript SKII＋中克隆的完全合成或截短的天然cry9Aa序列，合成所述探針。用發(fā)光反應(yīng)(Boehringer Mannheim)進(jìn)行的RNA印跡表明，用所述合成基因轉(zhuǎn)化的大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的cry9Aa基因的mRNA由0.3-5pg/μg總RNA，平均值為2pg/μg總RNA(圖7A)。用截短的天然基因序列以及所述GUS融合轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)的cry9Aa基因的mRNA由0.03-2pg/μg總RNA，平均值為0.2-0.3pg/μg總RNA(圖8A)。對cry9Aa mRNA表達(dá)的分析表明，所述合成序列表達(dá)的mRNA平均超過所述天然基因7-10倍。
研究具有mRNA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因插入片段的數(shù)目。將分離自溫室培養(yǎng)植株的總植物DNA(5μg)的樣品在瓊脂糖凝膠上電泳，并在正電荷尼龍膜上進(jìn)行印跡。所述膜與洋地黃毒苷dUTP標(biāo)記的探針雜交。在PCR中根據(jù)包含所述cry9Aa(合成或天然)序列的載體模板擴增所述探針。用限制酶消化DNA樣品，所述限制酶從所述轉(zhuǎn)基因插入片段的基因組或僅在其一側(cè)(左側(cè)或右側(cè))切除cry9Aa基因。DNA印跡分析獲得的結(jié)果是約一半的所述轉(zhuǎn)基因植株含有一個插入片段。本發(fā)明人未能發(fā)現(xiàn)插入片段的數(shù)目和mRNA或蛋白表達(dá)之間有任何聯(lián)系。
用蛋白質(zhì)印跡分析所述Cry9Aa蛋白產(chǎn)物的表達(dá)。在緩沖液中提取蛋白，所述緩沖液含有50mM Tris(堿性)、NaOH(最高pH為12)、0.4M尿素、0.1M硫脲、2mM二硫蘇糖醇、0.5％Tween 20、0.5％TritonX100和4％巰基乙醇(MerEtOH)。在液氮中研磨葉片材料(1g)，并與2ml所述緩沖液混合，然后加熱至60℃，并再在液氮中冷凍。重復(fù)此步驟兩次。通過離心去除碎片。沉淀上清液，并用4體積丙酮于-20℃洗滌2次。重懸浮干燥的沉淀，并以1μg沉淀/40μl緩沖液溶解在荷載緩沖液中，在水浴中煮沸10分鐘。離心碎片，上清液用于所述分析。用Bradford測定法檢測總蛋白的濃度。將所述樣品在聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)中上樣。樣品在0.75-1.5mm厚的8％PAGE中電泳，并在半干的印跡裝置的硝化纖維素膜上印跡。該膜與針對蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種蛋白晶體的多克隆抗血清雜交，并通過與1％丙酮沉淀的煙草植株蛋白粉和大腸桿菌(菌株XL1)蛋白粉于室溫結(jié)合15分鐘而純化。
如圖7B所示，使用合成轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物表達(dá)的Cry9Aa1蛋白的表達(dá)為0.6-1.44μg/g葉片組織，或為0.15-0.3％可溶性蛋白，平均值為1μg/g葉片組織和0.2％可溶性蛋白。
為了比較蛋白產(chǎn)物表達(dá)，將樣品T-GS-8(充分表達(dá)Cry9Aa)和陰性對照的煙草蛋白樣品NTS(煙草三生栽培品種)以包含以下比例(T-GS-8/NTS μg/μg總蛋白)的系列混合50/0、5/50、3/50、1.5/50、1/50和0/50。這些樣品上樣并在PAGE中電泳。所述凝膠的蛋白質(zhì)印跡表明，與所述NTS對照相比，Cry9Aa1蛋白信號在所有的稀釋度(甚至在1/50時)都完全可檢測到(圖8C)。
表達(dá)天然截短的和GUS融合的mRNA的煙草轉(zhuǎn)基因系樣品以50μg總蛋白在相同的蛋白質(zhì)分析中上樣，所述樣品沒有一個顯示出可清楚檢測到的Cry9Aa蛋白信號(圖8C)。該結(jié)果表明，所述cry9Aa基因的合成序列在轉(zhuǎn)基因煙草中產(chǎn)生的蛋白至少比所述天然序列高50倍。實施例9馬鈴薯轉(zhuǎn)化用帶有含合成cry9Aa基因序列的pGPTV-HPT質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物pito栽培品種。按照較早公開的方法(Koivu，K.等，1995 Acta Agric.Scand.Sect.B，Soil and Plant Sci.4578-87)進(jìn)行所述轉(zhuǎn)化。分析8個潮霉素抗性系的基因表達(dá)。分析所述植物以和煙草植物相同的方式表達(dá)的mRNA產(chǎn)物的表達(dá)。用發(fā)光反應(yīng)(BoehringerMannheim)進(jìn)行的RNA印跡顯示，用所述合成基因轉(zhuǎn)化的大多數(shù)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物表達(dá)的cry9Aa基因mRNA為1-3pg/μg總RNA，平均值為2pg/μg(圖9A)。
用DNA分析檢驗在所述基因組中的轉(zhuǎn)基因插入片段(資料未公開)。按照所描述的用于煙草植物的方法進(jìn)行DNA印跡。在馬鈴薯中表達(dá)的Cry9Aa蛋白產(chǎn)物平均為0.3μg/g葉片材料或0.03％可溶性蛋白(圖9B)。實施例10花椰菜轉(zhuǎn)化用帶有含合成cry9Aa基因序列(SEQ IN NO2)的pGPTV-HPT質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化花椰菜植物Asterix栽培品種。在激素培養(yǎng)基中培養(yǎng)下胚軸切片1天，并與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2天。此后將外植體放置在選擇培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)化后再生所述植株中的5株，2個在如對煙草所述進(jìn)行的RNA印跡中顯示陽性信號。表達(dá)的cry9Aa mRNA產(chǎn)物為2pg(A-0系)和0.5pg(A-10系)/μg總RNA(圖10A)。
蛋白質(zhì)印跡顯示，在A-0中所述Cry9Aa蛋白的表達(dá)水平為100ng蛋白/g葉片組織或0.01％可溶性蛋白(圖10B)。一般來說，轉(zhuǎn)基因植物的蛋白檢測可以實現(xiàn)對低水平所述毒素的檢測，因為當(dāng)pH低于9.0時收集的所述Cry9Aa毒素是不溶性的。
轉(zhuǎn)基因花椰菜植株，尤其是A-0系，在過量表達(dá)的靶昆蟲侵襲的生物測定中具有很高的毒性穩(wěn)定性，所述侵襲為將植株和高密度的培養(yǎng)的小菜蛾放置在一個籠子中達(dá)10天。結(jié)果示于圖6。
更具體地說，使用小菜蛾的生物測定顯示了所述A-0系的高殺蟲能力，該系在喂食的1-2天內(nèi)殺死野生幼蟲。該轉(zhuǎn)基因系也殺死小菜蛾的CryIAc和CryIC抗性幼蟲。A-10系也具有殺蟲作用。但野生幼蟲在喂食6-8天后死亡，而CryIAc抗性幼蟲在喂食8-10天后死亡。轉(zhuǎn)基因系A(chǔ)-10不能殺死所有的CryIC毒素抗性幼蟲，但這些幼蟲與用對照植物喂食的幼蟲相比，發(fā)育期更長，外形更小(表3)。這種交叉抗性生物測定可以用于證實Cry9Aa毒素的獨特特性和可能將其用于不同的抗性管理策略。實施例11蕪菁?xì)W洲油菜轉(zhuǎn)化用帶有含合成cry9Aa基因序列的pGPTV-HPT質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌LBA4404，按照Kuvshinov，V.等的方法(Plant Cell Reports 1999，18773-777)轉(zhuǎn)化蕪菁?xì)W洲油菜(Brassica rapa)oleifera變種。兩種蕪菁?xì)W洲油菜轉(zhuǎn)基因系以0.5pg/μg總RNA的低水平表達(dá)mRNA產(chǎn)物(圖11)。
盡管DNA分析證實了轉(zhuǎn)化，但蛋白質(zhì)印跡未檢測到所述蛋白產(chǎn)物，這部分是由于所述膜的高本底。盡管如此，兩種轉(zhuǎn)基因系對小菜蛾具有殺蟲作用。V-12.1和V-14.3系在喂食的3-6天后殺死幼蟲(表4)。
cry9Aa基因在蕓苔屬植物中的表達(dá)比在煙草或馬鈴薯植物中的表達(dá)小10-100倍，并且所述表達(dá)不穩(wěn)定。許多蕓苔屬轉(zhuǎn)基因系在植株成熟時不能表達(dá)。該結(jié)果可能是由于使用已知不穩(wěn)定表達(dá)的花椰菜花葉病毒的35S啟動子或AMV前導(dǎo)序列造成的。特別是，該病毒在為其天然宿主蕓苔屬植物中具有畸變。在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生對所述表達(dá)的抑制，這一事實證實盡管所述啟動子起作用，但僅促進(jìn)低水平的mRNA生產(chǎn)。結(jié)論去除了轉(zhuǎn)錄畸變的cry9Aa的合成序列表達(dá)的需要的蛋白產(chǎn)物比天然截短的或GUS融合的構(gòu)建物高50倍。在花椰菜中，100ng Cry9Aa蛋白/g葉片組織的表達(dá)產(chǎn)生對小菜蛾的高殺蟲能力，而根據(jù)蛋白質(zhì)分析，煙草植物表達(dá)的所述蛋白更高出10倍。表達(dá)足量的cry9Aa基因的轉(zhuǎn)基因植物對小菜蛾CryIAc和CryIC抗性品系是致命的。該事實證實Cry9Aa毒素有其獨特結(jié)合受體機制的結(jié)論。在生物測定中使用的所述CryIAc和CryIC抗性昆蟲沒有表現(xiàn)出對Cry9Aa毒素的交叉抗性。表格表1.用晶體Cry9Aa蛋白喂食小菜蛾易感野生型品系和CryIAc和CryIC毒素抗性品系的二齡期幼蟲的生物測定的結(jié)果。顯示了所述喂食的每一天存活的(a)或死亡的(d)幼蟲的數(shù)目以及蛹(p)的數(shù)目。表1


表2在單子葉、雙子葉和蕓苔屬植物的編碼序列中使用的密碼子的比例。氨基酸密碼子 單子葉 雙了葉 蕓苔屬Gly GGG0.250.13 0.20Gly GGA0.190.38 0.32Gly GGT0.140.35 0.32Gly GGC0.420.14 0.16Glu GAG0.760.51 0.58Glu GAA0.240.49 0.42Asp GAT0.240.64 0.62Asp GAC0.760.36 0.38Val GTG0.400.27 0.26Val GTA0.080.13 0.12Val GTT0.160.40 0.35Val GTC0.360.20 0.26Ala GCG0.280.12 0.17Ala GCA0.160.25 0.26Ala GCT0.190.45 0.36Ala GCC0.370.19 0.22Arg AGG0.240.24 0.27Arg AGA0.110.33 0.33Ser AGT0.070.16 0.17Ser AGC0.230.15 0.14Lys AAG0.830.56 0.55Lys AAA0.170.44 0.45Asn AAT0.230.46 0.43Asn AAC0.770.54 0.57Met ATG1.001.00 1.00Ile ATA0.120.20 0.23Ile ATT0.240.43 0.38Ile ATC0.630.38 0.39Thr ACG0.240.13 0.19Thr ACA0.170.28 0.29Thr ACT0.180.35 0.26氨基酸 密碼子 單子葉 雙了葉 蕓苔屬Thr ACC0.410.240.26Trp TGG1.001.001.00End TGA0.620.480.35Cys TGT0.240.540.59Cys TGC0.760.460.41End TAG0.210.190.29End TAA0.170.330.35Tyr TAT0.220.450.43Tyr TAC0.780.550.57Leu TTG0.140.230.22Leu TTA0.040.120.07Phe TTT0.260.470.37Phe TTC0.740.530.63Ser TCG0.180.090.13Ser TCA0.140.190.21Ser TCT0.140.270.21Ser TCC0.240.140.14Arg CGC0.170.080.10Arg CGA0.080.100.12Arg CGT0.100.180.14Arg CGC0.300.070.05Gln CAG0.440.460.51Gln CAA0.560.540.49His CAT0.340.570.52His CAC0.660.430.48Leu CTG0.310.110.11Leu CTA0.080.100.11Leu CTT0.120.260.30Leu CTC0.310.180.19Pro CCG0.290.150.15Pro CCA0.370.360.38Pro CCT0.140.360.33Pro CCC0.210.130.14
所使用的DNA序列在GenBank中的收錄號甘藍(lán)(Brassica oleracea)U16751、U18995、M87514、L36926、L36927、M76647、Y00286。
油菜(Brassica campestris)L41355、M64631、D38563、U17098、L21896、L21897、L23554。
歐洲油菜(Brassica napus)U04945、U15604、U17987、U20179、U21849、U00443、M99415、L25406、L15303、L12395、L29214、L19879、L08608、L08607、L12393、M97667。
在雙子葉優(yōu)選密碼子列中使用的物種和基因數(shù)目。
鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)-854個編碼序列(John Morrisjohn.morris@frodo.mgh.harvard.edu)，Pisum sativa-37個序列，碧冬茄屬(Petunia)物種-18個基因，菜豆(Phasealus vulgaris)-26個基因，馬鈴薯(Solanum tuberosum)21個基因，大豆(Glycine max)-59個基因，煙草(Nicotiana tabacum)-21個基因，番茄(Lycopersicon esculentum)-41個基因(J.Michael Cherry cherry@frodo.mgh.harvard.edu)在單子葉優(yōu)選密碼子列中使用的物種和基因數(shù)目。
大麥(Hordeum vulgare)-36個基因，玉蜀黍(Zea mays)-71個基因，稻(Oryza sativa)-16個基因，普通小麥(Triticum aestivum)-45個基因(J.Michael Cherry cherry@frodo.mgh.harvard.edu)表3.喂食小菜蛾品系(易感野生型品系；以及CryIAC和CryIC毒素抗性品系)第一齡幼蟲(first mstar larvae)轉(zhuǎn)基因花椰菜葉片的生物測定。顯示了在連續(xù)喂食的天數(shù)存活(a)或死亡(d)幼蟲的數(shù)目以及蛹(p)的數(shù)目。

表4.喂食野生型小菜蛾第2-3齡期幼蟲轉(zhuǎn)基因蕪菁?xì)W洲油菜葉片的生物測定。顯示了在連續(xù)喂食的天數(shù)存活的或死亡的幼蟲的數(shù)目以及蛹的數(shù)目。

序列表(1)一般資料(i)申請人Board of Trustees of the university of Kentucky(A)名稱UniCrop Ltd(B)街道Helsinki Science Park，Viikinkaari 6(C)城市赫爾辛基(E)國家芬蘭(F)郵政編碼(ZIP)FIN-00710(ii)發(fā)明名稱用于改善殺蟲控制的修飾合成DNA序列(iii)序列數(shù)4(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本1.30(EPO)(vi)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朏I981809(B)提交日期1998年8月24日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度624個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(v)片段類型N-端(vi)來源
(A)生物蘇云金芽孢桿菌(B)菌株蠟螟亞種(C)個體分離株11-67(xi)序列描述SEQ ID NO1Pro Leu Ala Asn Asn Pro Tyr Ser Ser Ala Leu Asn Leu Asn Ser Cys1 5 10 15Gln Asn Ser Ser Ile Leu Asn Trp Ile Asn Ile Ile Gly Asp Ala Ala20 25 30Lys Glu Ala Val Ser Ile Gly Thr Thr Ile Val Ser Leu Ile Thr Ala35 40 45Pro Ser Leu Thr Gly Leu Ile Ser Ile Val Tyr Asp Leu Ile Gly Lys50 55 60Val Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gln Ser Ile Ser Asp Leu Ser Ile Cys65 70 75 80Asp Leu Leu Ser Ile lle Asp Leu Arg Val Ser Gln Ser Val Leu Asn85 90 95Asp Gly Ile Ala Asp Phe Asn Gly Ser Val Leu Leu Tyr Arg Asn Tyr100 105 110Leu Glu Ala Leu Asp Ser Trp Asn Lys Asn Pro Asn Ser Ala Ser Ala115 120 125Glu Glu Leu Arg Thr Arg Phe Arg Ile Ala Asp Ser Glu Phe Asp Arg130 135 140Ile Leu Thr Arg Gly Ser Leu Thr Asn Gly Gly Ser Leu Ala Arg Gln145 150 155 160Asn Ala Gln Ile Leu Leu Leu Pro Ser Phe Ala Ser Ala Ala Phe Phe165 170 175His Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Thr Arg Tyr Gly Thr Asn Trp Gly180 185 190Leu Tyr Asn Ala Thr Pro Phe Ile Asn Tyr Gln Ser Lys Leu Val Glu195 200 205Leu Ile Glu Leu Tyr Thr Asp Tyr Cys Val His Trp Tyr Asn Arg Gly
210 215 220Phe Asn Glu Leu Arg Gln Arg Gly Thr Ser Ala Thr Ala Trp Leu Glu225 230 235 240Phe His Arg Tyr Arg Arg Glu Met Thr Leu Met Val Leu Asp Ile Val245 250 255Ala Ser Phe Ser Ser Leu Asp Ile Thr Asn Tyr Pro Ile Glu Thr Asp260 265 270Phe Gln Leu Ser Arg Val Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Gly Phe Val His275 280 285Arg Ser Ser Leu Arg Gly Glu Ser Trp Phe Ser Phe Val Asn Arg Ala290 295 300Asn Phe Ser Asp Leu Glu Asn Ala Ile Pro Asn Pro Arg Pro Ser Trp305 310 315 320Phe Leu Asn Asn Met Ile Ile Ser Thr Gly Ser Leu Thr Leu Pro Val325 330 335Ser Pro Ser Thr Asp Arg Ala Arg Val Trp Tyr Gly Ser Arg Asp Arg340 345 350Ile Ser Pro Ala Asn Ser Gln Phe Ile Thr Glu Leu Ile Ser Gly Gln355 360 365His Thr Thr Ala Thr Gln Thr Ile Leu Gly Arg Asn Ile Phe Arg Val370 375 380Asp Ser Gln Ala Cys Asn Leu Asn Asp Thr Thr Tyr Gly Val Asn Arg385 390 395 400Ala Val Phe Tyr His Asp Ala Ser Glu Gly Ser Gln Arg Ser Val Tyr405 410 415Glu Gly Tyr Ile Arg Thr Thr Gly Ile Asp Asn Pro Arg Val Gln Asn420 425 430Ile Asn Thr Tyr Leu Pro Gly Glu Asn Ser Asp Ile Pro Thr Pro Glu435 440 445Asp Tyr Thr His Ile Leu Ser Thr Thr Ile Asn Leu Thr Gly Gly Leu450 455 460Arg Gln Val Ala Ser Asn Arg Arg Ser Ser Leu Val Met Tyr Gly Trp465 470 475 480Thr His Lys Ser Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Asn Pro Asp Arg Ile485 490 495Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Val Asp Thr Arg Gly Thr Gly Val Ser500 505 510Tyr Val Asn Asp Pro Gly Phe Ile Gly Gly Ala Leu Leu Gln Arg Thr515 520 525Asp His Gly Ser Leu Gly Val Leu Arg Val Gln Phe Pro Leu His Leu530 535 540Arg Gln Gln Tyr Arg Ile Arg Val Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Ile545 550 555 560Arg Leu Ser Val Asn Gly Ser Phe Gly Thr Ile Ser Gln Asn Leu Pro565 570 575Ser Thr Met Arg Leu Gly Glu Asp Leu Arg Tyr Gly Ser Phe Ala Ile580 585 590Arg Glu Phe Ash Thr Ser Ile Arg Pro Thr Ala Ser Pro Asp Gln Ile595 600 605Arg Leu Thr Ile Glu Pro Ser Phe Ile Arg Gln Glu Val Tyr Val Asp610 615 620(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度1953個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成”(xi)序列描述SEQ ID NO2ACCATGGGAA ACTGTGGATG TGCTTCTGAT GATGTTGCTA AGTACCCATT GGCTAACAAC60CCATACTCAT CTGCTCTTAA CCTTAACTCT TGCCAGAACT CTTCTATCCT TAACTGGATC 120AACATCATTG GAGATGCTGC TAAGGAGGCT GTGTCTATTG GAACTACCAT TGTCTCTCTT 180ATCACTGCTC CATCTCTTAC TGGATTGATC TCAATTGTGT ACGATCTTAT TGGAAAGGTT 240CTTGGAGGTT CTTCTGGACA GTCTATCTCT GATCTTTCTA TCTGTGATCT TCTTTCTATC 300ATTCATCTTA GGGTTTCTCA GTCTGTTTTG AACGATGGAA TTGCTGATTT CAACGGTTCT 360GTTCTTTTGT ACAGGAACTA CTTGGAGGCT CTTGATTCTT GGAACAAGAA CCCAAACTCT 420GCTTCTGCTG AGGAGCTTAG GACTAGGTTC AGGATCGCTG ATTCTGAGTT CGATAGGATC 480TTGACCAGGG GATCTCTTAC CAACGGAGGA TCTTTGGCTA GGCAGAACGC TCAGATCCTT 540TTGCTTCCAT CTTTTGCATC TGCTGCTTTC TTCCACTTGT TGCTCCTTAG GGATGCTACC 600AGGTACGGTA CTAACTGGGG ACTTTACAAC GCTACCCCAT TTATCAACTA CCAAAGCAAG 660CTGGTTGAGC TTATTGAGCT TTACACTGAT TACTGTGTTC ACTGGTACAA CAGGGGATTC 720AACGAGCTTA GACAGAGGGG AACCTCTGCT ACGGCTTGGC TTGAATTCCA CAGATACCGC 780AGAGAGATGA CCTTGATGGT TCTTGATATT GTTGCTTCTT TCTCTTCTCT TGATATCACC 840AACTACCCTA TTGAGACTGA TTTCCAGTTG TCTAGGGTTA TCTACACTGA TCCTATTGGA 900TTCGTTCACA GGTCCTCTCT TAGGGGAGAG TCTTGGTTCT CTTTCGTTAA CAGGGCTAAC 960TTCTCTGATT TGGAGAACGC TATCCCAAAC CCAAGACCAT CTTGGTTCCT TAACAACATG1020ATCATCTCTA CTGGATCTCT TACCTTGCCA GTTTCTCCAT CTACTGATAG AGCTAGGGTT1080TGGTATGGAT CTAGGGATAG GATCTCTCCA GCTAACTCTC AGTTCATCAC TGAGCTTATC1140TCTGGACAGC ACACCACTGC TACCCAGACC ATCTTGGGAA GGAATATCTT CAGGGTTGAT1200TCTCAAGCTT GCAACTTGAA CGATACTACT TATGGTGTGA ACAGGGCTGT TTTCTACCAT1260GATGCTTCTG AGGGTAGCCA AAGGTCTGTT TACGAGGGTT ACATCAGGAC CACTGGAATT1320GATAACCCAA GGGTTCAGAA CATCAACACC TACTTGCCAG GAGAGAACTC CGATATTCCA1380ACTCCTGAGG ATTACACCCA CATCTTGTCT ACCACCATCA ACTTGACTGG AGGACTTAGA1440CAGGTTGCTT CTAACAGGAG GTCATCTTTG GTTATGTACG GATGGACTCA CAAGTCTCTT1500GCTAGGAACA ACACCATCAA CCCAGATAGA ATCACCCAGA TCCCATTGAC CAAGGTTGAT 1560ACCAGAGGAA CTGGAGTTTC TTACGTGAAC GATCCAGGAT TCATTGGAGG AGCTCTTCTT 1620CAGAGGACTG ACCACGGATC TCTTGGAGTT TTGAGGGTTC AGTTCCCACT TCACTTGAGA 1680CAGCAGTACA GGATCAGGGT TAGGTACGCT TCTACCACTA ACATCAGGTT GTCTGTGAAC 1740GGATCTTTCG GAACTATCTC TCAGAACCTT CCATCTACCA TGAGATTGGG AGAGGATTTG 1800AGATACGGAT CTTTTGCTAT CAGAGAATTC AACACCTCTA TCAGACCAAC TGCTTCTCCA 1860GATCAGATCA GGTTGACTAT TGAGCCATCT TTCATCAGAC AGGAGGTTTA CGTTGATAGA 1920ATTGAGTTCA TCCCAGTTAA CCCAGATCTT TAA 1953(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度1989個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“截短的質(zhì)粒節(jié)段”(vi)來源(A)生物蘇云金芽孢桿菌(B)菌株蠟螟亞種(C)個體分離株1167(viii)在基因組中的位置(A)染色體/節(jié)段截短的質(zhì)粒節(jié)段(B)MAP位置編碼cry9的N端部分的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO3CGCGGATCCA ACAATGGGCA TGCCCAATTG TGGTTGTGCA TCTGATGATG TTGCGAAATA 60TCCTTTAGCC AACAATCCAT ATTCATCTGC TTTAAATTTA AATTCTTGTC AAAATAGTAG120TATTCTCAAC TGGATTAACA TAATAGGCGA TGCAGCAAAA GAAGCAGTAT CTATTGGGAC 180AACCATAGTC TCTCTTATCA CAGCACCTTC TCTTACTGGA TTAATTTCAA TAGTATATGA 240CCTTATAGGT AAAGTACTAG GAGGTAGTAG TGGACAATCC ATATCAGATT TGTCTATATG 300TGACTTATTA TCTATTATTG ATTTACGGGT AAGTCAGAGT GTTTTAAATG ATGGGATTGC 360AGATTTTAAT GGTTCTGTAC TCTTATACAG GAACTATTTA GAGGCTCTGG ATAGCTGGAA 420TAAGAATCCT AATTCTGCTT CTGCTGAAGA ACTCCGTACT CGTTTTAGAA TCGCCGACTC 480AGAATTTGAT AGAATTTTAA CCCGAGGGTC TTTAACGAAT GGTGGCTCGT TAGCTAGACA 540AAATGCCCAA ATATTATTAT TACCTTCTTT TGCGAGCGCT GCATTTTTCC ATTTATTACT 600ACTAAGGGAT GCTACTAGAT ATGGCACTAA TTGGGGGCTA TACAATGCTA CACCTTTTAT 660AAATTATCAA TCAAAACTAG TAGAGCTTAT TGAACTATAT ACTGATTATT GCGTACATTG 720GTATAATCGA GGTTTCAACG AACTAAGACA ACGAGGCACT AGTGCTACAG CTTGGTTAGA 780ATTTCATAGA TATCGTAGAG AGATGACATT GATGGTATTA GATATAGTAG CATCATTTTC 840AAGTCTTGAT ATTACTAATT ACCCAATAGA AACAGATTTT CAGTTGAGTA GGGTCATTTA 900TACAGATCCA ATTGGTTTTG TACATCGTAG TAGTCTTAGG GGAGAAAGTT GGTTTAGCTT 960TGTTAATAGA GCTAATTTCT CAGATTTAGA AAATGCAATA CCTAATCCTA GACCGTCTTG 1020GTTTTTAAAT AATATGATTA TATCTACTGG TTCACTTACA TTGCCGGTTA GCCCAAGTAC 1080TGATAGAGCG AGGGTATGGT ATGGAAGTCG AGATCGAATT TCCCCTGCTA ATTCACAATT 1140TATTACTGAA CTAATCTCTG GACAACATAC GACTGCTACA CAAACTATTT TAGGGCGAAA 1200TATATTTAGA GTAGATTCTC AAGCTTGTAA TTTAAATGAT ACCACATATG GAGTGAATAG 1260GGCGGTATTT TATCATGATG CGAGTGAAGG TTCTCAAAGA TCCGTGTACG AGGGGTATAT 1320TCGAACAACT GGGATAGATA ACCCTAGAGT TCAAAATATT AACACTTATT TACCTGGAGA 1380AAATTCAGAT ATCCCAACTC CAGAAGACTA TACTCATATA TTAAGCACAA CAATAAATTT 1440AACAGGAGGA CTTAGACAAG TAGCATCTAA TCGCCGTTCA TCTTTAGTAA TGTATGGTTG 1500GACACATAAA AGTCTGGCTC GTAACAATAC CATTAATCCA GATAGAATTA CACAGATACC 1560ATTGACGAAG GTTGATACCC GAGGCACAGG TGTTTCTTAT GTGAATGATC CAGGATTTAT1620AGGAGGAGCT CTACTTCAAA GGACTGACCA TGGTTCGCTT GGAGTATTGA GGGTCCAATT1680TCCACTTCAC TTAAGACAAC AATATCGTAT TAGAGTCCGT TATGCTTCTA CAACAAATAT1740TCGATTGAGT GTGAATGGCA GTTTCGGTAC TATTTCTCAA AATCTCCCTA GTACAATGAG1800ATTAGGAGAG GATTTAAGAT ACGGATCTTT TGCTATAAGA GAGTTTAATA CTTCTATTAG1860ACCCACTGCA AGTCCGGACC AAATTCGATT GACAATAGAA CCATCTTTTA TTAGACAAGA1920GGTCTATGTA GATAGAATTG AGTTCATTCC AGTTAATCCA GATCTATAAC CCGGGCTCGA1980GGTACCGCG1989(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度3837個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“質(zhì)粒DNA”(vi)來源(A)生物蘇云金芽孢桿菌(B)菌株蠟螟亞種(C)個體分離株1167(viii)在基因組中的位置(A)染色體/節(jié)段質(zhì)粒DNA(B)MAP位置編碼Cry9Aa毒素的全長DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4CAGAAATCAA CTTACAAGTA TTAGGGATTT CCCCGTTCGA CCCGTTTTAT ACAAAACTAG 60TATACTGCGA TGGGTAGATA TTCGTCTATT TCCTTAAGTT TTTAAGATGC AGTATATGTA 120GATCATATTT TAAAATATAG CGTTCATCAA CTACTATATT ATGTAATTGA CGGTAATCAT 180ATTCAAGTGC GTGATTTACA AATCAAATTA ATGAAAGAAC ATGCTCAATC TGCTCAAATA 240TCTGTTTTTT ATTTATGAGT AAAAACCGAA GTTTGTGGAA CGTAAACTGT AATAAACGTA 300ATGGCGAAGA TATATAGATG TCAATATAAA AAGTTAACCC AAATAATGTT TTAAAATTTT 360AAAAATAATG TAGGAGGAAA AATTATGAAT CAAAATAAAC ACGGAATTAT TGGCGCTTCC 420AATTGTGGTT GTGCATCTGA TGATGTTGCG AAATATCCTT TAGCCAACAA TCCATATTCA 480TCTGCTTTAA ATTTAAATTC TTGTCAAAAT AGTAGTATTC TCAACTGGAT TAACATAATA 540GGCGATCCAG CAAAAGAAGC AGTATCTATT GGGACAACCA TAGTCTCTCT TATCACAGCA 600CCTTCTCTTA CTGGATTAAT TTCAATAGTA TATGACCTTA TAGGTAAAGT ACTAGGAGGT 660AGTAGTGGAC AATCCATATC AGATTTGTCT ATATGTGACT TATTATCTAT TATTGATTTA 720CGGGTAAGTC AGAGTGTTTT AAATGATGGG ATTGCAGATT TTAATGGTTC TGTACTCTTA 780TACAGGAACT ATTTAGAGGC TCTGGATAGC TGGAATAAGA ATCCTAATTC TGCTTCTGCT 840GAAGAACTCC GTACTCGTTT TAGAATCGCC GACTCAGAAT TTGATAGAAT TTTAACCCGA 900CGGTCTTTAA CGAATGGTGG CTCGTTAGCT AGACAAAATG CCCAAATATT ATTATTACCT 960TCTTTTGCGA GCGCTGCATT TTTCCATTTA TTACTACTAA GGGATGCTAC TAGATATGGC1020ACTAATTGGG GGCTATACAA TGCTACACCT TTTATAAATT ATCAATCAAA ACTAGTAGAG1080CTTATTGAAC TATATACTGA TTATTGCGTA CATTGGTATA ATCGAGGTTT CAACGAACTA1140AGACAACGAG GCACTAGTGC TACAGCTTGG TTAGAATTTC ATAGATATCG TAGAGAGATG1200ACATTGATGG TATTAGATAT AGTAGCATCA TTTTCAAGTC TTGATATTAC TAATTACCCA1260ATAGAAACAG ATTTTCAGTT GAGTAGGGTC ATTTATACAG ATCCAATTGG TTTTGTACAT1320CGTAGTAGTC TTAGGGGAGA AAGTTGGTTT AGCTTTGTTA ATAGAGCTAA TTTCTCAGAT1380TTAGAAAATG CAATACCTAA TCCTAGACCG TCTTGGTTTT TAAATAATAT GATTATATCT1440ACTGGTTCAC TTACATTGCC GGTTAGCCCA AGTACTGATA GAGCGAGGGT ATGGTATGGA1500AGTCGAGATC GAATTTCCCC TGCTAATTCA CAATTTATTA CTGAACTAAT CTCTGGACAA1560CATACGACTG CTACACAAAC TATTTTAGGG CGAAATATAT TTAGAGTAGA TTCTCAAGCT 1620TGTAATTTAA ATGATACCAC ATATGGAGTG AATAGGGCGG TATTTTATCA TGATGCGAGT 1680GAAGGTTCTC AAAGATCCGT GTACGAGGGG TATATTCGAA CAACTGGGAT AGATAACCCT 1740AGAGTTCAAA ATATTAACAC TTATTTACCT GGAGAAAATT CAGATATCCC AACTCCAGAA 1800GACTATACTC ATATATTAAG CACAACAATA AATTTAACAG GAGGACTTAG ACAAGTAGCA 1860TCTAATCGCC GTTCATCTTT AGTAATGTAT GGTTGGACAC ATAAAAGTCT GGCTCGTAAC 1920AATACCATTA ATCCAGATAG AATTACACAG ATACCATTGA CGAAGGTTGA TACCCGAGGC 1980ACAGGTGTTT CTTATGTGAA TGATCCAGGA TTTATAGGAG GAGCTCTACT TCAAAGGACT 2040GACCATGGTT CGCTTGGAGT ATTGAGGGTC CAATTTCCAC TTCACTTAAG ACAACAATAT 2100CGTATTAGAG TCCGTTATGC TTCTACAACA AATATTCGAT TGAGTGTGAA TGGCAGTTTC 2160GGTACTATTT CTCAAAATCT CCCTAGTACA ATGAGATTAG GAGAGGATTT AAGATACGGA 2220TCTTTTGCTA TAAGAGAGTT TAATACTTCT ATTAGACCCA CTGCAAGTCC GGACCAAATT 2280CGATTGACAA TAGAACCATC TTTTATTAGA CAAGAGGTCT ATGTAGATAG AATTGAGTTC 2340ATTCCAGTTA ATCCGACGCG AGAGGCGAAA GAGGATCTAG AAGCAGCAAA AAAAGCGGTG 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1.用于改善昆蟲防治的修飾合成DNA序列，該序列包括由蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種(Bacillus thuringiensis ssp.galleria)的截短的cry9Aa基因修飾的合成DNA序列，它編碼特征為具有氨基酸序列(SEQID NO1)或其變體的殺蟲蛋白，所述變體與所選定的Cry 9Aa蛋白的殺蟲活性N端結(jié)構(gòu)域具有大致相同的特性。
2.權(quán)利要求1的修飾合成DNA序列，其中所述修飾合成DNA序列包含修飾的SEQ ID NO3。
3.權(quán)利要求1的修飾合成DNA序列，其中所述修飾合成DNA序列是SEQ ID NO2和大致相似的序列。
4.權(quán)利要求1的修飾合成DNA序列，其中所述修飾的SEQ IDNO3包括所選定的優(yōu)選密碼子變化。
5.權(quán)利要求1的修飾合成DNA序列，其中所述核苷酸序列變化包括去除推定的聚腺苷酸化序列。
6.權(quán)利要求1的修飾合成DNA序列，其中所述核苷酸序列變化包括去除或改變剪接和mRNA不穩(wěn)定信號序列。
7.權(quán)利要求1的修飾合成DNA序列，其中所述核苷酸序列變化包含一個或多個在起始密碼子鄰近位置的任選變化，以增加其與所選定的高等植物的相容性。
8.用于克隆和/或轉(zhuǎn)化原核生物或真核生物的DNA構(gòu)建物，它包含權(quán)利要求1-7的修飾合成DNA序列。
9.包含權(quán)利要求1-7的修飾合成DNA序列的原核或真核宿主。
10.制備權(quán)利要求1-7的修飾合成DNA序列的方法，包括以下步驟(a)選擇編碼特征為具有SEQ ID NO1和Cry9Aa蛋白的獨特特性并明顯不同于其它CryI蛋白的殺蟲蛋白DNA序列；(b)提供編碼特征為具有(SEQ ID NO1)的蛋白的合成DNA序列，所述SEQ ID NO1可天然Cry9Aa基因(SEQ ID NO4)獲得的由胰蛋白酶切割位點截短的DNA序列(SEQ ID NO3)編碼；(c)通過按所選定的方向改變其優(yōu)選密碼子以便獲得仍然編碼含有所述氨基酸序列(SEQ ID NO1)或其變體的殺蟲蛋白的修飾的SEQID NO3，從而提高SEQ ID NO3的翻譯，所述變體仍然具有和蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種的天然Cry9Aa基因編碼的殺蟲蛋白大致相似的殺蟲作用。
11.權(quán)利要求10的方法，其中在所述合成DNA序列中的修飾包括按所選定的方向改變SEQ ID NO3的優(yōu)選密碼子，采用的方法包括去除推定的聚腺苷酸化、剪接和mRNA不穩(wěn)定信號序列和/或通過修飾一個或幾個核苷酸改變起始密碼子鄰近序列，以增加所述合成DNA序列與所選定的高等植物的相容性。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述修飾合成DNA序列包括SEQID NO2及其大致相似的修飾變體。
13.提供殺蟲控制改善的高等植物的方法，包括以下步驟將權(quán)利要求1-7的修飾合成DNA序列導(dǎo)入到DNA構(gòu)建物中，以便將所述修飾DNA序列有效導(dǎo)入植物基因組中。
14.權(quán)利要求1-7的修飾合成DNA序列用于生產(chǎn)獨特的殺蟲蛋白的用途，所述殺蟲蛋白特征為具有氨基酸序列(SEQ ID NO1)或其變體，所述變體與蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種的天然Cry9Aa基因編碼的殺蟲蛋白的N端結(jié)構(gòu)域具有大致相似的特性。
15.權(quán)利要求1-7的修飾合成DNA序列的用途，其中所述改善的特性包括通過改進(jìn)mRNA加工、穩(wěn)定性和/或翻譯來增強表達(dá)，從而提高對靶昆蟲的耐受性。
16.權(quán)利要求1-7的修飾合成DNA序列用于生產(chǎn)具有改善特性的轉(zhuǎn)基因植物的用途，所述轉(zhuǎn)基因植物能夠表達(dá)有效量的殺蟲蛋白，所述殺蟲蛋白大致相似于氨基酸序列SEQ ID NO1及其變體，所述變體與蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種的天然Cry9Aa基因編碼的殺蟲蛋白的N端結(jié)構(gòu)域具有大致相似的特性。
17.權(quán)利要求1-7的修飾合成DNA序列用于提高高等植物的昆蟲抗性的用途。
18.權(quán)利要求1-7的修飾合成DNA序列作為抗性管理策略工具的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及修飾合成DNA序列,所述序列由于改善了它們的mRNA加工、穩(wěn)定性以及增強了它們在高等植物中的翻譯而改善了昆蟲防治。所述合成DNA序列包含對抗性管理尤其是克服交叉抗性問題有用的工具。通過提供合成修飾的cry9Aa基因的截短的DNA序列(SEQ ID NO:3:)實現(xiàn)所述提高,所述合成修飾的cry9Aa基因的截短的DNA序列優(yōu)選SEQ IDNO:2:,它編碼特征為具有氨基酸序列SEQ ID NO:1:的蛋白或其變體,所述變體仍具有與蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種(Btg)的Cry9Aa基因編碼的殺蟲蛋白大致相似的殺蟲作用。還公開了所述修飾合成DNA序列用于生產(chǎn)所述殺蟲蛋白和用于生產(chǎn)表達(dá)有效量的所述殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的用途。
文檔編號C12N15/32GK1326464SQ99812455
公開日2001年12月12日 申請日期1999年8月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月24日
發(fā)明者V·庫夫施諾夫, A·卡納瓦, K·科伊武, E·佩胡 申請人:尤尼克羅普有限公司