一種利用水產(chǎn)蛋白發(fā)酵制備綠色抗菌促生長飼料添加劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用水產(chǎn)蛋白發(fā)酵制備綠色抗菌促生長飼料添加劑的方法，屬于飼料添加劑制備的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]自20世紀(jì)50年代以來，在動(dòng)物飼養(yǎng)和飼料中廣泛使用抗生素、化學(xué)合成藥物、激素、β-興奮劑、重金屬、鎮(zhèn)靜劑等促生長保健劑?？股氐却偕L保健劑在飼料中的應(yīng)用歷史由來已久，它創(chuàng)造了養(yǎng)殖業(yè)和飼料工業(yè)的革命，使得規(guī)模養(yǎng)殖在全世界范圍內(nèi)得到了迅速發(fā)展，動(dòng)物的生產(chǎn)數(shù)量和飼料轉(zhuǎn)化率得到大幅度提高。但是，正如所有工業(yè)文明的成果都有它的負(fù)面影響一樣，長期以來使用抗生素等非綠色飼料添加劑，導(dǎo)致了如下的問題:畜禽和水產(chǎn)產(chǎn)品中藥物殘留嚴(yán)重，直接危害人體健康；畜禽和水產(chǎn)產(chǎn)品品質(zhì)下降，缺乏市場競爭力和信任感;細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、耐藥菌株增多，威脅人類安全;破壞生態(tài)環(huán)境等。隨著飼料工業(yè)和畜牧水產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，目前我國的畜產(chǎn)品和水產(chǎn)品已從短缺轉(zhuǎn)變?yōu)殡A段性過剩，人們更關(guān)心食品是否安全、衛(wèi)生，因而綠色消費(fèi)已成為今后的發(fā)展趨勢，加之我國已加入WT O，發(fā)達(dá)國家對我國出口的農(nóng)產(chǎn)品要求越來越嚴(yán)格，目前藥物殘留問題成為我國畜產(chǎn)品和水產(chǎn)品走出國門的主要障礙之一。因此加速開發(fā)、推廣和應(yīng)用新型綠色飼料添加劑勢在必行。
[0003]綠色飼料添加劑，最基本要求是無毒副作用、無殘留，并且還要能促進(jìn)動(dòng)物生長。目前國際公認(rèn)的促生長綠色飼料添加劑主要有以下幾種:小肽、酶制劑、植物源產(chǎn)品及其提取物、微生態(tài)制劑、寡糖(化學(xué)益生素)和酵母類產(chǎn)品(天然益生元)等。
[0004]酶制劑作為一種飼料添加劑具有無殘留、無污染，提高飼料的利用價(jià)值，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能和產(chǎn)品品質(zhì)等作用。飼用酶制劑大致可以分為消化酶和非消化酶兩類，通常在營養(yǎng)層面發(fā)揮作用。比如提高畜禽消化道內(nèi)源酶活性，補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足;破壞植物細(xì)胞壁，提高飼料的利用效率;消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。目前，酶制劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)，主要有蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等酶制劑。然而，市場上現(xiàn)有的飼用酶制劑多不耐高溫，在飼料高溫造粒過程中活性損失非常大。
[0005]中草藥是中國醫(yī)學(xué)寶庫中的瑰寶，且中草藥作為飼料添加劑，在我國古代已經(jīng)開始。中草藥具有無毒副作用、不易引發(fā)細(xì)菌抗藥性、無殘留等特性，作為一種飼用抗生素的綠色替代品在飼料工業(yè)得到了廣泛的認(rèn)可。從20世紀(jì)80年代起，中草藥已被用于作飼用抗生素替代品，且取得了一定的應(yīng)用效果。中草藥經(jīng)過微生物發(fā)酵后，其有效成分被充分釋放，使其更具生物活性和療效近年來更是研究熱點(diǎn)。中國飼料〔2010，419( 15): 13-17〕文獻(xiàn)公開了從不同中草藥原料中分離得到的米曲霉對中草藥進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵料蒸煮液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性分別較對照提高36.03%、60.83%、27.64%、41.32%。
[0006]國內(nèi)外的研究結(jié)果表明，在日糧中添加一定的小肽可以改善機(jī)體對日糧中蛋白質(zhì)和氨基酸的利用率，提高動(dòng)物的生長性能。近年來，小肽作為一種綠色促生長飼料添加劑在飼料工業(yè)備受關(guān)注。目前小肽的制備方法有酶解法和微生物發(fā)酵法。酶解法生產(chǎn)活性肽是以蛋白原料為底物，運(yùn)用蛋白酶的酶解作用，生產(chǎn)小分子肽。酶解法易于控制，作用條件溫和適合活性肽的生產(chǎn)。但酶解法需要大量的蛋白酶，生產(chǎn)成本高。因此，酶解法制備活性肽多用于食品與醫(yī)藥行業(yè)，低端的飼用活性肽產(chǎn)品很少采用酶解的方法。微生物發(fā)酵法是以大分子蛋白質(zhì)為原料，接入產(chǎn)蛋白酶的微生物，利用微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生的蛋白酶的酶解作用，生成小分子肽。發(fā)酵法把蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)和酶解過程有機(jī)結(jié)合在一起，降低了活性肽的生成成本，更適合活性肽的生產(chǎn)。專利CNZL200410029787.0“一種活性肽飼料添加劑及制備方法和用途”公開了一種發(fā)酵發(fā)制備小肽飼料添加劑的方法，它是以植物蛋白和動(dòng)物蛋白的一種或幾種的混合物，經(jīng)芽孢桿菌等發(fā)酵降解，使其水解度控制在20?35%，然后經(jīng)過后處理可得到小肽飼料添加劑。
[0007]小肽作為一種新型綠色促生長飼料添加劑在飼料工業(yè)有著很好的應(yīng)用前景，然而目前小肽并沒有在飼料工業(yè)得到廣泛的應(yīng)用。無論是酶解法生產(chǎn)的小肽，還是發(fā)酵法生產(chǎn)的小肽，高昂的生產(chǎn)成本制約了小肽在飼料工業(yè)的廣泛應(yīng)用。另外，現(xiàn)有技術(shù)制備的小肽產(chǎn)品功能性成分過于單一，特別是缺乏抗菌性能。因此，亟需大幅度降低小肽的生產(chǎn)成本，以促進(jìn)小肽在飼料工業(yè)的廣泛應(yīng)用；另外，需增強(qiáng)小肽產(chǎn)品的抗菌性能，以進(jìn)一步增強(qiáng)其促生長性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對現(xiàn)有技術(shù)制備的小肽由于成本高，很難在飼料工業(yè)廣泛的應(yīng)用這一問題，本發(fā)明的目的是提供一種方法能夠低成本地生產(chǎn)小肽。另外，本發(fā)明的另一目的是通過采用耐高溫地衣芽孢桿菌發(fā)酵制備小肽，使得制備得到的小肽產(chǎn)品還富含耐高溫蛋白酶等酶制劑。這不但可以進(jìn)一步提高小肽產(chǎn)品的促生長效果，而且還能通過生產(chǎn)出耐高溫飼用酶制劑而進(jìn)一步降低其生產(chǎn)成本。此外，本發(fā)明的又一目的是通過發(fā)酵液和中草藥的混合發(fā)酵，使得制備的小肽產(chǎn)品還具備抗菌性能。
[0009]為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:一種利用水產(chǎn)蛋白發(fā)酵制備綠色抗菌促生長飼料添加劑的方法，包括如下步驟:
(1)將斜面保藏的能產(chǎn)耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(BaciIIuslicheniformis)HL_3接入到滅菌后冷卻的LB液體培養(yǎng)基中，于55 °C、150r/min培養(yǎng)12h，制備成地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)HL-3種子液備用；
(2)將新鮮的水產(chǎn)蛋白絞碎后備用；
(3)將步驟(2)制得的絞碎的水產(chǎn)蛋白放入到發(fā)酵罐中，并向發(fā)酵罐中加入水和營養(yǎng)物，混勻后得到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；
(4)往步驟(3)獲得的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)上接入步驟(I)所制備的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)HL-3 種子液；
(5)發(fā)酵過程的控制:發(fā)酵溫度為55°C?60°C，無菌空氣通入量為0.5vvm?2.5vvm，發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速為150rpm?350rpm，發(fā)酵時(shí)間為36h?48h ；
(6)發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液過濾去除沉淀后與粉碎后過60目篩的中草藥按0.5?1.5:1的比例混合，并攪拌均勻作為接有菌種的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基； (7)固態(tài)發(fā)酵:將步驟(6)獲得的接有菌種的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基按照下列方法進(jìn)行發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基分裝在已消毒的發(fā)酵淺盤中，裝料厚度為4cm?8cm，淺盤中發(fā)酵培養(yǎng)基表面覆蓋已滅菌的濕紗布，再將淺盤置于已滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在55°C~60°C，發(fā)酵時(shí)間為46h?56h;
(8)成品處理:固態(tài)發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵后獲得的產(chǎn)品經(jīng)干燥、粉碎和包裝后，即制得了一種綠色抗菌促生長飼料添加劑成品。
[0010]所述步驟(I)中所用的能產(chǎn)耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(Baci I Iuslicheniformis)HL-3已于2016年I月18日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No:60003，保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所。
[0011]所述步驟(2)中的水產(chǎn)蛋白為羅非魚下腳料、南極磷蝦、蝦頭、扇貝裙邊、鱈魚下腳料、魷魚下腳料、青鱗魚下腳料、青魚下腳料、鰱魚下腳料、草魚下腳料和鰹魚下腳料中的一種。
[0012]所述步驟(3)中水產(chǎn)蛋白的加入量以添加的水產(chǎn)蛋白的質(zhì)量占液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，為10%?40%。所述步驟(3)中營養(yǎng)物為葡萄糖、氯化鈣、氯化亞鐵和磷酸氫二鉀組成的混合物。所述步驟(3 )中的營養(yǎng)物的加入量以添加的營養(yǎng)物的質(zhì)量占液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，分別為:葡萄糖0.01%?5%，氯化鈣0.01%?5%，氯化亞鐵0.01%?5%，
磷酸氫二鉀0.01%?5%。
[0013]所述步驟(4)中地衣芽孢桿菌(Baci I Ius I ichenif ormis)HL_3種子液的接種量以接入的種子液的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，為I %?9%。
[0014]所述步驟(6)中的中草藥為甘草、連翹、車前草、蘇子、五味子、馬鞭草、黃芪、金銀花、石榴皮、地榆、黃連、魚腥草、苦參和土茯苓中的一種或其中兩種以上的混合物。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有的發(fā)酵法制備小肽的技術(shù)相比，有如下優(yōu)點(diǎn)。
[0016](I)發(fā)酵產(chǎn)品可以在飼養(yǎng)動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮蛋白酶的功效?，F(xiàn)有小肽的發(fā)酵制備采用的都是常溫的菌種，其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶的活性在產(chǎn)品制備的干燥過程和用于飼料的高溫造粒過程中會損失殆盡。因而，現(xiàn)有發(fā)酵技術(shù)制備的小肽產(chǎn)品用于飼料在動(dòng)物體內(nèi)并不能發(fā)揮蛋白酶的功效。而本技術(shù)采用耐高溫的地衣芽孢桿菌(Baci I Iuslicheniformis)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程產(chǎn)生耐高溫的蛋白酶，這些耐高溫蛋白酶的活性在產(chǎn)品制備的干燥和用于飼料的高溫造粒過程中基本沒有損失，因而本技術(shù)制備的飼料添加劑可在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮蛋白酶的功效。
[0017](2)成本低。與現(xiàn)有的發(fā)酵法制備小肽相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案中，原料不用滅菌，可降低能耗和成本。另外，本發(fā)明將小肽的發(fā)酵生產(chǎn)和飼用酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)合二為一，飼用酶制劑的生產(chǎn)會分?jǐn)偛糠稚a(chǎn)成本，從而進(jìn)一步降低小肽的生產(chǎn)成本。此外，本發(fā)明將小肽產(chǎn)品的后處理程序與中草藥的固態(tài)發(fā)酵有機(jī)結(jié)合在一起，中草藥的發(fā)酵生產(chǎn)會分?jǐn)偛糠稚a(chǎn)成本，這又進(jìn)一步降低小肽的生產(chǎn)成本。
[0018](3)發(fā)酵效果好，小肽含量高。與現(xiàn)有的發(fā)酵法制備小肽相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案中，原料不用滅菌，從而使得水產(chǎn)蛋白豐富的內(nèi)源酶得以保留；另外，內(nèi)源酶的最適酶解溫度和微生物發(fā)酵溫度一致。因此，在內(nèi)源酶和發(fā)酵所產(chǎn)酶的協(xié)同作用下，制備得到的小妝含量會更尚；在加上尚溫會提尚酶的活性，會進(jìn)