專利名稱：一種重組胸腺素α1及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種重組胸腺素α1及其制備方法。
Gly-Tα1的制備方法如下以人胎盤cDNA為模板進行PCR，其產(chǎn)物經(jīng)膠回收，EcoRI/BamHI雙酶切，與pGEX-4T-1載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)Ply S株，經(jīng)酶切、測序、鑒定后得到工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1。該工程菌采用分批補料培養(yǎng)技術(shù)進行發(fā)酵，以終濃度為1mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)3～5小時，終止發(fā)酵，收獲菌體。按每克濕菌加入10ml的比例加入超聲緩沖液，冰浴中超聲破碎菌體，離心，取上清用Glutathione Sepharose 4B柱進行親和層析純化融合蛋白。將GST-Tα1融合蛋白對酶切緩沖液透析，按每單位凝血酶酶切50～500μg融合蛋白的比例加入凝血酶，25～30℃反應(yīng)2～16小時。將凝血酶酶切的裂解液過GlutathioneSepharose 4B柱，收集穿過峰，對50mmol/L Tris pH8.0透析后上sourceQ陰離子交換柱，用0～1mol/LNaCl線性梯度洗脫，收集主峰。純化出的Gly-Tα1純度大于90％，表觀分子量為3.1KD。
1.試劑與材料載體質(zhì)粒pGEX-4T-1 由美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳室潘星華博士贈送大腸桿菌E.coli BL21(DE3)Ply S株 購自Stratagene公司人胎盤Marathon-RoadyTM-cDNA 購自Clontech公司限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶 購自上海華美公司PCR引物 由上?；瞪锛夹g(shù)公司合成膠回收試劑盒 購自上海生工生物公司2.方法(1)寡核苷酸引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中(登錄號S38640)設(shè)計出的上游引物5′-G GG G A T C CG A C G C A G C C G T A G A C-3′下游引物5′-G GG A A T T CT T A T T T T C T G C C T C T T C C A C-3′上游引物內(nèi)含BamHI酶切位點/G G A T C C，下游引物內(nèi)含EcoRI酶切位點/G A A T T C。5′端去掉了ATG起始密碼，3′端加上了終止密碼。
(2)PCR擴增按照Takara生物公司Pre Mix PCR Kit說明書，取5微升人胎盤cDNA為模板，取上游引物和下游引物各100個pmol然后進行PCR反應(yīng)，第一循環(huán)為94℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃1分鐘，然后進入94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，共35個循環(huán)，再進入72℃延伸8分鐘。
(3)重組質(zhì)粒的構(gòu)建將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收，然后用Eco RI和Bam HI分別雙酶切回收的DNA片段和質(zhì)粒載體pGEX-4T-1，再將兩種酶切回收片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)Ply S株，通過酶切鑒定轉(zhuǎn)化子。
將上述酶切鑒定的重組載體由上海基康生物公司測序，獲得正確序列的重組質(zhì)粒稱為融合表達(dá)載體pGEX-4T-1/Tα1。重組胸腺素α1的核苷酸序列見表1，與其相應(yīng)的氨基酸序列見表2。
上述含重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/Tα1的大腸桿菌BL21(DE3)為工程菌，將工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。實施例2大腸桿菌工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1的發(fā)酵1.取少量大腸桿菌工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1于20ml含100μg/ml氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L)37℃振蕩培養(yǎng)過夜作為一級種子液。
2.取一級種子液，以4％接種量接種于含100μg/ml氨卞青霉素的200ml LB培養(yǎng)基，于三角搖瓶中37℃振蕩培養(yǎng)6小時，作為二級種子液。
3.按發(fā)酵罐工作體積的4％接種量將二級種子液接入含半合成培養(yǎng)基[(每升含胰化蛋白胨5g、酵母提取物5g、甘油10g、KH2PO42g、K2HPO44g、Na2HPO4·12H2O 7g、(NH4)2SO41.2g、NH4Cl 0.2g)]和微量元素溶液(每升含MnSO4·5H2O 0.001g、CoCl2·6H2O 0.004g、Na2MoO4·2H2O 0.002g、ZnCl20.002g、CuSO4·5H2O 0.001g、H3BO30.0005g、FeSO4·7H2O 0.02g、CaCl2·H2O 0.02g、MgSO4·7H2O 0.3g)的發(fā)酵罐中，控制溫度為37℃、空氣流速為10L/分鐘、攪拌轉(zhuǎn)速為250rpm，同時自動流加30％的氨水使pH值保持在7.0左右，培養(yǎng)8～12小時。
4.加入補料(每升含甘油170g、胰化蛋白胨71g、酵母提取物71g、MgSO4·7H2O 5.7g)，加快攪拌轉(zhuǎn)速至400～700rpm，增大空氣流速為12～15L/分鐘，培養(yǎng)4小時左右。
5.繼續(xù)補料，加入終濃度為1mmol/L的I PTG，誘導(dǎo)3～5小時，停止發(fā)酵，得發(fā)酵菌液。實施例3Gly-Tα1蛋白的制備與純化1.將發(fā)酵菌液離心收集菌體，用磷酸緩沖液(PBSNaCl 140mmol/L KCl2.7mmol/L Na2HPO410mmol/L KH2PO41.8mmol/L pH7.3)離心洗滌一次，再按每克濕重菌體加入10mlPBS懸浮菌體沉淀。
2.置冰浴中超聲破碎菌體，離心，取上清過Glutathione Sepharose 4B柱，棄去穿過峰，用50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L還原型谷胱甘肽(pH8.0)洗脫，收集洗脫峰，得GST-Tα1融合蛋白。
3.將GST-Tα1融合蛋白對PBS或50mmol/L Tris-HCl、2.5mmol/L CaCl2、150mmol/L NaCl(pH8.0)透析，按每單位凝血酶酶切50～500μg融合蛋白的比例加入凝血酶，25～30℃反應(yīng)2～16小時，融合蛋白酶切后生成Gly-Tα1。
4.酶切裂解液過Glutathione Sepharose 4B柱，收集含Gly-Tα1的穿過峰。
5.將上述Gly-Tα1收集液對50mmol/L Tris pH8.0透析后上sourceQ陰離子交換柱，用0～1mol/LNaCl線性梯度洗脫，收集主峰，即得純Gly-Tα1。純度為90％以上，表觀分子量為3.1KD。
活性測定1.E玖瑰花結(jié)實驗按常規(guī)方法分離健康人外周血單核細(xì)胞，小牛血清調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2×106/ml。各取200ul細(xì)胞液入試管，分別加入樣品。37℃水浴90分鐘。每支試管中加入200μl綿羊紅細(xì)胞(2×108/ml)，4℃放置2～3小時；涂片，染色，于高倍鏡下計數(shù)200個淋巴細(xì)胞中形成玖瑰花結(jié)的細(xì)胞數(shù)(結(jié)合3個及3個以上綿羊紅細(xì)胞)，計算玖瑰花形成細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，按下述公式計算激活率。結(jié)果見表3
表3 Gly-Tα1對E-玫瑰花結(jié)形成率的影響E-玫瑰花結(jié)形成率激活率對照43.3±1.00 0Gly-Tα1(20μg/ml) 57.6±1.00**33.0％合成Tα1(20μg/ml) 60.3±2.08**39.3％n＝3，**P＜0.01，與對照相比由表3可見Gly-Tα1可顯著提高人外周血淋巴細(xì)胞E-玫瑰花結(jié)形成率，且其作用與進口的合成Tα1(日達(dá)仙)相當(dāng)。
2.細(xì)胞增殖實驗取小鼠脾臟，用無菌注射器芯將脾臟擠壓過200目的鋼絲網(wǎng)，得到單個細(xì)胞。用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液將脾細(xì)胞配成5×106個細(xì)胞/ml，將細(xì)胞懸液以200μl/孔鋪96孔板，每孔加5μl不同濃度的Gly-Tα1及合成Tα1，復(fù)3孔，并設(shè)對照。37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)72小時，MTT法測定。結(jié)果見表4表4 Gly-Tα1對小鼠脾細(xì)胞增殖的作用吸收值(630nm)濃度(mol/L) Gly-Tα1合成Tα1對照10-70.185±0.021**△△0.153±0.012**0.123±0.01210-80.160±0.020**0.167±0.000**10-90.177±0.019**0.178±0.016**10-100.146±0.001**0.146±0.002**10-110.121±0.0000.118±0.01510-120.122±0.0110.109±0.005n＝6，**P＜0.01，與對照相比；ΔΔP＜0.01，與合成Tα1相比由表4可見Gly-Tα1對小鼠脾細(xì)胞增殖具有顯著促進作用，其活性與進口的合成Tα1(日達(dá)仙)相當(dāng)。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.采用基因工程方法制備重組胸腺素α1(Gly-Tα1)，克服了化學(xué)合成成本高，且污染環(huán)境的缺點。
2.獲得的Gly-Tα1經(jīng)E-玫瑰花結(jié)試驗及脾細(xì)胞增殖試驗顯示，Gly-Tα1可顯著提高人外周血淋巴細(xì)胞E-玫瑰花結(jié)形成率，對小鼠脾細(xì)胞增殖具有顯著促進作用，且Gly-Tα1的生物學(xué)活性與進口的合成Tα1(日達(dá)仙)相當(dāng)。
表1Gly-Tα1基因核苷酸序列表5’-GGA TCC GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC AAGGAC TTA AAG GAG AAG AAG GAA GTT GTG GAA GAG GCA GAA AAT-3’表2Gly-Tα1氨基酸序列表Gly Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu IleThr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu ValVal Glu Glu Ala Glu Asn
權(quán)利要求
1.一種重組胸腺素α1，其特征在于氨基酸組成較天然胸腺素α1的氨基酸序列的N端前多一個甘氨酸。
2.權(quán)利要求1所述重組胸腺素α1的制備方法，包括(1)融合表達(dá)載體的構(gòu)建；(2)大腸桿菌工程菌的發(fā)酵；(3)重組胸腺素α1的制備與純化；其特征在于所構(gòu)建的融合表達(dá)載體為pGEX-4T-1/Tα1，所用的上游引物為5′-G G G G A T C C G A C G C A G C C G T A G A C-3′，下游引物為5′-G G G A A T T C T T A T T T T C T G C C T C T T C C A C-3′，模板為人胎盤cDNA。
3.按權(quán)利要求2所述的重組胸腺素α1的制備方法，其特征在于所用的大腸桿菌工程菌為DE3/pGEX-4T-1/Tα1。
4.權(quán)利要求1所述重組胸腺素α1用于制備免疫制劑藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種重組胸腺素α1即Gly－Tα1及其制備方法。天然胸腺素α1都采用固相合成法全合成，不僅成本高，而且易污染環(huán)境。本發(fā)明采用基因工程方法，以5′－GGGGATCCGACGCAGCCGTAGAC－3′為上游引物、5′－GGGAATTCTTATTTTCTGCCTCTTCCAC－3′為下游引物，以人胎盤cDNA為模板進行PCR，擴增出目的基因片段，通過EcoRI/BamHI雙酶切將目的基因定向克隆到質(zhì)粒pGEX－4T－1上構(gòu)建融合表達(dá)載體pGEX－4T－1/Tα1。制備的工程菌可表達(dá)出谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶－胸腺素α1融合蛋白，親和層析純化融合蛋白，凝血酶酶切釋放出Gly－Tα1，最后通過親和層析和離子交換層析純化出Gly－Tα1。經(jīng)試驗，Gly－Tα1的生物學(xué)活性不亞于合成的胸腺素α1。本發(fā)明制備方法簡單，成本低廉，且不會造成環(huán)境污染。
文檔編號A61P37/00GK1398899SQ02136180
公開日2003年2月26日 申請日期2002年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月25日
發(fā)明者郭葆玉, 苗紅, 章杰, 袁鵬群, 道書艷, 邱磊, 張冉 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)