專利名稱：一種新型導(dǎo)向溶栓劑，其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更確切地說涉及一種新型導(dǎo)向溶栓劑，還涉及其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著社會工業(yè)化程度的提高，生活節(jié)奏加快及飲食習(xí)慣的改變，心血管疾病已經(jīng)成為當(dāng)今世界上威脅人類最嚴(yán)重的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率已超過腫瘤性疾病而躍居第一。其中血栓病引起的死亡率和致殘率極高，常見的血栓性疾病主要有急性心肌梗死、腦血栓和靜脈血栓等。血栓在血液循環(huán)系統(tǒng)中的非正常形成往往是導(dǎo)致此類疾病的直接原因。因此有效地清除堵塞血管的病理性血栓，疏通血管，恢復(fù)缺血組織正常的血液流通，實現(xiàn)對組織正常的營養(yǎng)、氧氣供應(yīng)，成為治療的關(guān)鍵。目前的治療主要包括兩個方面手術(shù)治療及藥物治療。作為常規(guī)的治療手段，選用良好的溶栓藥物一直是治療方案的首選。
經(jīng)過30多年的研究和實踐，溶栓制劑經(jīng)歷了多次的更新?lián)Q代，第一代溶栓制劑包括鏈激酶、尿激酶等，第二代溶栓制劑包括t-PA，scu-PA和葡激酶等。但這些溶栓制劑在臨床應(yīng)用中都出現(xiàn)了一些明顯的問題，主要集中體現(xiàn)在對血栓的特異性差、臨床使用劑量大，并導(dǎo)致全身性出血等毒副作用。因而目前，國內(nèi)外都在積極地開展第三代溶栓藥物的研制。第三代溶栓制劑研制的思路是通過基因工程技術(shù)，對天然的溶栓藥物進行結(jié)構(gòu)改造，以提高溶栓劑的血栓特異性和延長溶栓劑的半衰期，從而減少溶栓劑的臨床使用劑量，減少其毒副作用。目前的研究主要集中在兩個方面，其一為改造t-PA或構(gòu)建t-PA/scu-PA嵌合體，以期提高溶栓制劑對血栓特異性溶解能力。第二個方面則主要是利用血栓特異性抗體進行導(dǎo)向溶栓。目前，在導(dǎo)向溶栓制劑的研制中都是采用尿激酶或低分子量單鏈尿激酶作為溶栓劑，因而研究的焦點在于導(dǎo)向抗體。由于在血栓形成過程中，產(chǎn)生了一些新的抗原標(biāo)志，包括纖維蛋白，激活的血小板表面GPIIb/IIIa受體以及損傷血管內(nèi)皮等，因而這些抗原標(biāo)志提供了導(dǎo)向抗體的結(jié)合靶位作用。
在國外，早在二十世紀(jì)九十年代初就開始了利用抗人纖維蛋白的抗體進行導(dǎo)向溶栓藥物的研制，在不同的動物(包括倉鼠和狒狒等)體內(nèi)進行溶栓實驗表明，構(gòu)建的抗體-尿激酶雜合體能夠降低溶栓劑的使用劑量10倍以上，而且能夠極大的延長溶栓劑在體內(nèi)的半衰期。(Characterization of achimeric plasminogen activator consisting of a single-chain Fv fragment derivedfrom a fibrin fragment D-dimer-specific antibody and a truncated single-chainurokinase.J Biol Chem.1991 Oct 15；266(29)19717-24.)在1999年，德國漢堡大學(xué)的一個研究小組利用抗人纖維蛋白抗體和抗活化血小板抗體與尿激酶進行偶聯(lián)，制備了雙特異性的導(dǎo)向溶栓制劑，體外實驗表明，制備的雙特異性的導(dǎo)向溶栓制劑的纖溶活性提高約10倍(Abispecific antifibrin-antiplateleturokinase conjugate(BAAUC)induces enhanced clot lysis and inhibits plateletaggregation.Biochim Biophys Acta 2001 Apr 7；1546(2)399-405)。但是這些研究所用的導(dǎo)向抗體都為鼠抗體，而鼠抗體用于體內(nèi)時因其較強的免疫原性而導(dǎo)致人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)，并降低了重復(fù)用藥的效果。因而近年來，國外大量的研究單位和制藥公司都在積極的研制免疫原性低的人源化(humanized)抗體或人抗體。截至到2002年，文獻報導(dǎo)的在美國進行臨床試驗的約100多種抗體中，其中絕大部分為人源化抗體和人源性抗體(其中有大約60％為人源化抗體)。因而在現(xiàn)階段，制備和采用免疫原性更低的人源化抗體或人源性抗體作為導(dǎo)向抗體研制導(dǎo)向溶栓藥物是大勢所趨。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新型導(dǎo)向溶栓制劑，該溶栓制劑是一種雜合體，是將抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶(scu-PA-32k，殘基144-411)融合而成。本發(fā)明主要包括如下內(nèi)容鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(A11)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，殘基144-411)雜合體，它具有序列表中序列1所示的氨基酸序列，或序列表中序列1的一個或幾個氨基酸經(jīng)過取代，缺失或增加后衍生的，具有與原序列相同功能的氨基酸序列。
編碼上述雜合體氨基酸序列的DNA序列，其中之一如序列表中序列2所示。
上述雜合體的制備方法包括如下步驟1、A11-scuPA32k融合基因的構(gòu)建和克隆鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(A11)為本發(fā)明的發(fā)明人利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)篩選到的一株對人纖維蛋白特異的鼠抗體。利用PCR等方法，構(gòu)建出A11-scuPA32k融合基因，該融合基因的DNA序列之一如序列表中序列2所示。然后利用常規(guī)的分子克隆技術(shù)將該融合基因克隆至原核表達載體pET15，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，建立表達A11-scuPA32k融合基因的工程菌株。
2、A11-scuPA32k融合基因在大腸桿菌中的可溶性表達利用IPTG誘導(dǎo)，如上所述的工程菌株能夠表達重組A11-scuPA32k雜合體，而且胞內(nèi)可溶組分中能夠檢測到明顯的尿激酶活性，表明重組蛋白至少部分以可溶蛋白形式存在于胞內(nèi)。
3、重組A11-scuPA32k雜合體的純化利用兔抗尿激酶抗體，采用親和層析方法對表達的重組A11-scuPA32k雜合體進行純化，純化產(chǎn)物達到電泳純(圖1)。重組A11-scuPA32k雜合體具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。
4、重組A11-scuPA32k雜合體的體外活性分析利用溶圈法分析純化后重組A11-scuPA32k雜合體的尿激酶的溶纖功能，利用體外血栓吸附實驗分析純化后重組A11-scuPA32k雜合體結(jié)合血栓的能力，結(jié)果表明制備的重組A11-scuPA32k雜合體保持了良好的雙功能(圖2，圖3)。
5、重組A11-scuPA32k雜合體的體內(nèi)溶栓實驗在大鼠體內(nèi)制備血栓模型，分析重組A11-scuPA32k雜合體的體內(nèi)溶栓效果，結(jié)果表明得到相同體內(nèi)溶栓效果時，重組鼠單鏈抗體-尿激酶融合蛋白的用量約為尿激酶用量的1/4(圖4，5，6，7)。
人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(IIn)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，殘基144-411)雜合體，它具有序列表中序列5或7所示的氨基酸序列，或序列表中序列5或7的一個或幾個氨基酸經(jīng)過取代，缺失或增加后衍生的，具有與原序列相同功能的氨基酸序列。
編碼上述雜合體氨基酸序列的DNA序列，其中編碼序列表中序列5所述氨基酸序列的DNA序列之一如序列表中序列6所示，編碼序列表中序列7所述氨基酸序列的DNA序列之一如序列表中序列8所示。
上述雜合體的制備方法包括如下步驟1、IIn-scu-PA-32k融合基因的構(gòu)建和克隆在分子模建的基礎(chǔ)上，利用表面重塑的人源化方案對鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體進行了人源化改造。然后借助于噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，采用CDR3突變和DNA shuffling等方法對人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體進行了體外親和力成熟，并篩選到如序列表中序列3所示的一株人源化單鏈抗體，該人源化單鏈抗體的親和力和特異性都較親本鼠抗體更好(圖8)。
利用PCR等其他分子生物學(xué)方法，構(gòu)建出如序列表中序列6和8中所示的兩種IIn和scuPA32k的融合基因，兩種融合基因的主要差別在于IIn和scuPA32k的順序不同，一種為IIn-scuPA32k，另一種為scuPA32k-IIn。然后利用常規(guī)的分子克隆技術(shù)分別將該融合基因克隆至真核表達載體pMCE(圖9)，構(gòu)建了兩種融合基因的真核表達載體pMCE-IIn-scuPA32k(圖10)和pMCE-scuPA32k-IIn(圖11)。
2、高效表達IIn和scuPA32k融合基因的CHO細胞株的建立利用invitrogen公司的脂質(zhì)體lipofectinAMINE2000，分別將構(gòu)建的兩種融合基因，即IIn-scuPA32k和scuPA32k-IIn的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細胞株。分別用G418篩選表達IIn-scuPA32k雜合體或scuPA32k-IIn雜合體的陽性克隆，然后利用MTX分別對陽性克隆進行加壓以擴增目的基因在基因組中拷貝數(shù)，并篩選和亞克隆高表達IIn-scuPA32k雜合體或scuPA32k-IIn雜合體的細胞株。表達該兩種雜合體細胞株的表達量都達到10μg/106細胞·24小時。
3、重組IIn-scuPA32k和scuPA32k-IIn雜合體的體外活性分析利用溶圈法分析重組IIn-scuPA32k和scuPA32k-IIn雜合體的尿激酶的溶纖功能，利用ELISA分析表達的IIn-scuPA32k雜合體或scuPA32k-IIn雜合體對抗原D-Dimer的結(jié)合能力。結(jié)果表明CHO細胞表達的IIn-scuPA32k雜合體或scuPA32k-IIn雜合體都保持了良好的雙功能(圖12，表1)。
表1ELISA分析IIn-scupa32k和scupa32k-IIn雜合體的抗體活性樣品(n＝3)CHO/dhfr- IIn-scupa32kScupa32k-IInOD4920.04±0.010.87±0.15 0.76±0.10本發(fā)明的抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶的雜合體，為一種具有導(dǎo)向溶栓功能的新型溶栓制劑，可用于治療血栓性心腦血管疾病。
本發(fā)明的雜合體，具有單鏈抗體結(jié)合抗原D-dimer(DD)活性，其對血栓的結(jié)合能力強，得到相同體內(nèi)溶栓效果時，重組鼠單鏈抗體-尿激酶融合蛋白的用量比尿激酶用量少的多，具有導(dǎo)向和溶栓雙功能，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。


圖1為純化后重組A11-scupa32k的SDS-PAGE。其中A為純化后重組A11-scupa32k，B為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖2為溶圈法分析A11-scupa32k溶纖活性。其中
A為PBS標(biāo)準(zhǔn)B為純化后重組A11-scupa32kC為尿激酶標(biāo)準(zhǔn)(1IU)圖3為體外血栓吸附實驗分析A11-scupa32k的血栓結(jié)合能力。
圖4為近心端血管溫度變化(UK組)。
圖5為近心端血管溫度變化(Ab-UK組)。
圖6為血栓塊重量變化(UK組)。
圖7為血栓塊重量變化(Ab-UK組)。
圖8為人源化單鏈抗體與鼠單鏈抗體的相對親和力和特異性比較。
圖9為質(zhì)粒pMCE結(jié)構(gòu)示意圖。
圖10為質(zhì)粒pMCE-IIn-scuPA32k結(jié)構(gòu)示意圖。
圖11為質(zhì)粒pMCE-scuPA32k-IIn結(jié)構(gòu)示意圖。
圖12為溶圈法分析IIn-scupa32k和scupa32k-IIn雜合體的溶纖能力。
其中A為2IU尿激酶標(biāo)準(zhǔn)B為含IIn-scupa32k雜合體的細胞培養(yǎng)上清C為含scupa32k-IIn雜合體的細胞培養(yǎng)上清D為CHO/dhfr-細胞的培養(yǎng)上清(對照)具體實施方式
實施例一 鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(A11)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，殘基144-411)融合基因的構(gòu)建、表達、純化和體內(nèi)外活性分析一、材料菌株E.coli BL21(DE3)購自novagen公司；質(zhì)粒pET15b-HLSP2為本室構(gòu)建，克隆有低分子量尿激酶基因(參見文獻生物工程學(xué)報，2000，16(4)514-516)，質(zhì)粒pCANTAB5E-A11為本室構(gòu)建，克隆有鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(A11)基因(參見文獻生物技術(shù)通訊，1996，7(1)1-5)。
引物P1見序列表中序列9，P2見序列表中序列10。
化學(xué)試劑與酶類常用限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、pfu DNA聚合酶，dNTP等購自TAKARA公司和上海生工生物技術(shù)公司；抗原D-dimer(DD)，為人交聯(lián)纖維蛋白經(jīng)纖溶酶原水解后產(chǎn)生的一個特異性降解片段，帶有交聯(lián)纖維蛋白的特異性抗原表位(Pizzo SV，Taylor LM Jr，Schwartz ML，et al.Subunit structure of fragment from fibrinogen and cross-linked fibrin.J Biol Chem.1973 Jul 10；248(13)4584-90.)；兔抗人尿激酶IgG為本室制備；其他常用生化試劑市購，為分析純。
實驗設(shè)備PCR儀(PE GeneAmp PCR system 2400)，超聲波破碎儀(ColePalmer CPX-600)，透射式紫外分析儀(LKB 2011 Macrovue)，高速冷凍離心機(Beckman J2-21)，臺式高速冷凍離心機(Sigma 3K 12)，低溫循環(huán)水浴槽(LKB 2219 Multiteivip II)，低溫冰箱(San Yo Medical freezer)，電子分析天平(Chyo JP-300 WP)，微型蛋白電泳儀(BioRAD Mini II)，721型分光光度計(上海，冷光牌)，恒溫空氣浴搖床(哈爾濱醫(yī)療器材廠)，恒溫水浴搖床(哈爾濱醫(yī)療器材廠)。
二、方法與結(jié)果1、鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(A11)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，殘基144-411)融合基因的構(gòu)建以質(zhì)粒pET15b-HLSP2為模板，以P1和P2為引物，用pfuDNA聚合酶擴增低分子量尿激酶基因(scuPA32k)，并在其5’端添加連接肽(G4S)3的編碼基因。電泳回收約870bp的PCR產(chǎn)物，用NotI和NdeI雙酶切處理；載體pCANTAB5E-A11用NcoI和NotI雙酶切處理，電泳回收約750bp的A11基因；載體pET15用NcoI和NdeI雙酶切處理，回收載體大片段。隨后進行三片段連接，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET15b-A11-scuPA32k，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)。挑取單克隆，首先提質(zhì)粒進行酶切鑒定，取酶切鑒定正確者進行序列分析，結(jié)果表明序列完全正確。
2、A11-scuPA32k融合基因在大腸桿菌中的可溶性表達將鑒定正確的pET15b-A11-scuPA32k質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，同時以pET15b-A11質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)作為對照。分別挑取單克隆，接種于3ml含200μg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)過夜。然后按1∶500轉(zhuǎn)接于500ml含200μg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基中，30℃，250rpm培養(yǎng)至OD600達到0.8，加入IPTG至終濃度為1mM誘導(dǎo)表達5小時，然后5000g，4℃，20min離心收菌，重懸于200mlPBS中，5000g，4℃，20min收菌，重懸于50ml PBS中，超聲破碎細菌。然后10000g，4℃，20min離心，取上清，用溶圈法分析上清中尿激酶活性，結(jié)果表明表達上清中能夠檢測到尿激酶活性。
3、重組A11-scuPA32k雜合體的純化首先用抗人尿激酶IgG與CNBr活化的Sepharose 4B偶聯(lián)，制備人尿激酶抗體親和柱；然后將如上制備的上清上抗體親和層析柱，隨后用0.2MHcl-Glycine(pH2.0)洗脫，收集洗脫液，進行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明純化產(chǎn)物達到電泳純(圖1)。
4、重組A11-scuPA32k雜合體的體外活性分析4.1溶圈法測定尿激酶的溶纖活性，詳見文獻(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1987；11101)，結(jié)果表明純化產(chǎn)物具有尿激酶的溶纖活性(圖2)。
4.2體外血栓結(jié)合實驗分析單鏈抗體活性4.2.1血栓的制備取新鮮人血漿5ml，加入2單位牛凝血酶原，迅速混勻，用注射器灌注入硅膠管內(nèi)，置37℃溫育30分鐘，凝固后用刀片將硅膠管切成1cm小段，用注射器吹出硅膠管內(nèi)血漿凝塊，即為體外制備的血栓柱。
4.2.2體外血栓結(jié)合實驗取干凈試管，加入2ml經(jīng)適當(dāng)稀釋的純化樣品，然后加入上述制備的血栓柱兩條，放37℃水浴，每10分鐘取出50μl上清至干凈離心管中，取出的樣品同樣置37℃水浴。80分鐘后結(jié)束實驗。
4.2.3用溶圈法檢測各時間點樣品中尿激酶活性殘留情況，以確定重組A11-scuPA32k雜合體與血栓結(jié)合能力。結(jié)果表明純化產(chǎn)物具有明顯的體外血栓結(jié)合能力(圖3)。
5、重組A11-scuPA32k雜合體的體內(nèi)溶栓實驗5.1實驗動物實驗采用Wistar雌性大鼠，180～200g。
5.2血栓模型的建立動物用2％戊巴比妥鈉麻醉，取腹主靜脈，阻斷血管兩端，取出血管內(nèi)血液，注入0.2ml人的血液，30min后即可。
5.3給藥方法及給藥劑量給藥方法采用尾靜脈給藥，給藥劑量為8、2、1、0.5萬單位/Kg。
5.4實驗分組實驗設(shè)正常對照組(注射生理鹽水)，2、8萬單位尿激酶(UK)給藥組和0.5、1、2、8萬單位A11-scuPA32k(Ab-UK)給藥組。對照組10只動物，UK組90只動物，AB-UK組180只動物。
5.5觀察指標(biāo)及療效評價A遠心端、近心端溫度變化。血栓形成后在血管遠心端和近心端分別測定給藥前血管溫度的正常值，給藥后每隔15min測定溫度一次，直至給藥后3小時，比較動物給藥前后及不同時間血管溫度變化情況。
B根據(jù)實驗分組，正常對照組動物，血栓形成后立即取出血管血塊，稱其重量，作為藥前值。給藥組分別在給藥后30、45、60、75、90、105、120、150、180min取出血栓，稱重，觀察比較不同藥物、給藥不同時間血栓大小變化情況。
結(jié)果表明得到相同體內(nèi)溶栓效果時，重組鼠單鏈抗體-尿激酶融合蛋白的用量約為尿激酶用量的1/4(圖4，5，6，7)。
實施例二 人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(IIn)和低分子量尿激酶(scu-PA-32k，殘基144-411)融合基因的構(gòu)建、表達及活性分析一、材料菌株E.coli XL1-blue為本室保存，CHO/dhfr-細胞株購自美國ATCC公司；質(zhì)粒pcDNA3.1(+)購目invitrogen公司；質(zhì)粒pSV2-dhfr，購自ATCC公司；質(zhì)粒pIRESneo購自Clontech公司。質(zhì)粒pET15b-IIn-UK為本室構(gòu)建(參見文獻生物工程學(xué)報，2002，18(4)509-511)，該質(zhì)?？寺∮腥嗽椿罂谷死w維蛋白單鏈抗體(IIn)基因及低分子量尿激酶(scuPA32k)突變基因，該基因的突變都為同義突變，不改變其編碼的氨基酸序列，詳見序列表中序列3，質(zhì)粒pET15b-HLSP2克隆有低分子量尿激酶基因(參見文獻生物工程學(xué)報，2000，16(4)514-516)。引物P3見序列表中序列11，P4見序列表中序列12，P5見序列表中序列13，P6見序列表中序列14，P7見序列表中序列15，P8見序列表中序列16，P9見序列表中序列17，P10見序列表中序列18。
化學(xué)試劑與酶類常用限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、pfu DNA聚合酶，dNTP等購子自TAKARA公司和上海生工生物技術(shù)公司；抗原D-dimer(DD)，為人交聯(lián)纖維蛋白經(jīng)纖溶酶原水解后產(chǎn)生的一個特異性降解片段，帶有交聯(lián)纖維蛋白的特異性抗原表位，為本室制備；羊抗兔IgG-HRP購自北京中山生物技術(shù)公司；其他常用生化試劑購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院條件處，為分析純。
實驗設(shè)備PCR儀(Perkin Elmer GeneAmp PCR system 2400)，超聲波破碎儀(Cole Palmer CPX-600)，透射式紫外分析儀(LKB 2011Macrovue)，高速冷凍離心機(Beckman J2-21)，臺式高速冷凍離心機(Sigma 3K 12)，低溫循環(huán)水浴槽(LKB 2219 Multiteivip II)，低溫冰箱(SanYo Medical freezer)，電子分析天平(Chyo JP-300 WP)，微型蛋白電泳儀(BioRAD Mini II)，臺式高速離心機(上海，TGL·16G型)，潔凈工作臺(北京半導(dǎo)體一廠)，721型分光光度計(上海，冷光牌)，恒溫空氣浴搖床(哈爾濱醫(yī)療器材廠)，恒溫水浴搖床(哈爾濱醫(yī)療器材廠)，二氧化碳培養(yǎng)箱(德國，Hereaus)二、方法與結(jié)果1、真核表達質(zhì)粒pMCE的構(gòu)建以質(zhì)粒pSV2-dhfr為模板，以P9和P10為引物，擴增出DHFR基因，然后利用smaI+xbaI雙酶切分別處理載體pIRESneo和回收的PCR產(chǎn)物，將DHFR基因克隆至載體pIRESneo(替換neo基因)，構(gòu)建質(zhì)粒pIRESdhfr；然后利用EcoRV+xbaI雙酶切，分別處理載體pIRESdhfr和pcDNA3.1(+)，前者回收約1700bp的小片斷，后者回收約5400bp的載體大片斷，連接，構(gòu)建載體pMCE(圖9)。轉(zhuǎn)化E.coli XL1-blue，挑取單克隆，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和序列分析，結(jié)果表明序列完全正確。
2、融合基因IIn-scuPA32k的構(gòu)建與克隆以質(zhì)粒pET15b-IIn-UK為模板，首先以P4和P2(見實施例1)為引物，用pfuDNA聚合酶進行PCR反應(yīng)，然后再以回收的PCR產(chǎn)物為模板，以P5和P2為引物，用pfuDNA聚合酶擴增出IIn-scuPA32k融合基因，并在融合基因的5’端添加一個抗體的信號肽的編碼基因。然后對PCR產(chǎn)物首先用NdeI切開，并用T4DNA聚合酶補平，熱滅活T4DNA聚合酶后，再用EcoRV處理；載體pMCE先用EcoRI，并用T4DNA聚合酶補平，熱滅活T4DNA聚合酶后，再用EcoRV處理，隨后將處理后的載體和PCR產(chǎn)物進行連接，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pMCE-IIn-scuPA32k(圖10)，轉(zhuǎn)化E.coli XL1-blue，挑取單克隆，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和序列分析，結(jié)果表明序列完全正確。
3、融合基因scuPA32k-IIn的構(gòu)建和克隆以質(zhì)粒pET15b-HLSP2為模板，以P5和P6為引物，用pfuDNA聚合酶進行PCR反應(yīng)，然后再以回收的PCR產(chǎn)物為模板，以P3和P6為引物，用pfuDNA聚合酶擴增出scuPA32k基因，并在scuPA32k基因的5’端添加一個抗體的信號肽的編碼基因，在3’端添加連接肽(G4S)3的編碼基因，隨后HindIII單酶切處理該PCR產(chǎn)物；以質(zhì)粒pET15b-IIn-UK為模板，以P7和P8為引物，用pfuDNA聚合酶擴增出IIn基因，并用HindIII和NotI對該PCR產(chǎn)物進行雙酶切處理；載體pMCE用EcoRV和NotI雙酶切進行處理；隨后利用T4DNA連接酶對處理過的載體和兩種PCR產(chǎn)物進行三片段連接，構(gòu)建表達質(zhì)粒pMCE-scuPA32k-IIn(圖11)，轉(zhuǎn)化E.coli XL1-blue，挑取單克隆，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和序列分析，結(jié)果表明序列完全正確。
4、高效表達IIn和scuPA32k融合基因的CHO細胞株的建立分別用SspI對質(zhì)粒pMCE-IIn-scuPA32k和pMCE-scuPA32k-IIn進行線形化，然后利用invitrogen公司的脂質(zhì)體lipofectin AMINE2000分別轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細胞。隨后用400μg/ml的G418篩選，挑取至少20個陽性克隆，取表達上清用溶圈法進行尿激酶活性分析。然后選擇表達量較高的克隆用MTX進行逐步加壓，以擴增目的基因的拷貝數(shù)并提高目的蛋白的表達量。MTX濃度依次為2.5×10-8，5×10-8，1×10-7，每次MTX加壓后，都挑選至少20個單克隆分析表達量，然后挑選表達量較高的克隆進行下一步加壓。
5、重組IIn-scuPA32k和scuPA32k-IIn雜合體的體外活性分析5.1溶圈法測定尿激酶的溶纖活性，詳見文獻(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1987；11101)結(jié)果表明表達上清中具有明顯的尿激酶溶纖活性(圖12)。
5.2 ELISA分析單鏈抗體的活性抗原DD包被酶聯(lián)孔，隨后用1％BSA-1‰Tween20封閉；培養(yǎng)上清樣品中先加BSA至1％，加Tween20至1‰進行封閉，然后加封閉后的上清樣品至酶聯(lián)孔，37℃，1h；洗滌后加入兔抗尿激酶IgG，37℃，1h；洗滌后加入HRP-羊抗兔IgG抗體，37℃，1h；洗滌后加入OPD底物液顯色至適當(dāng)強度，用2mol/L H2SO4終止反應(yīng)并測定OD492。結(jié)果表明，表達上清產(chǎn)物具有單鏈抗體結(jié)合抗原DD活性(表1)。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所<120>一種新型導(dǎo)向溶栓劑，其制備方法及用途<130>
<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>530<212>PRT<213>
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tcttgcaaag catctggtta cactttcacc tcctacccga tcgaatggat gaagcaggct120ccgggcaaat ccctggagtg gatcggtagc ttacacccgt acaacgacga cactaagtac180aacgagaagt tcaaaggtcg tgctactctg actgttgaca cttctacctc tactgtttac240ctggaactgt cctctctgcg ttctgaagat actgctgttt actactgcgc tatctacgcc300ggtaagcgta ggcaagcgta ctggggtcag ggtactctgg tcaccgtctc ctcaggtgga360ggcggctcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcccgggat cggaaatcgt actgacccag420tctccgggta ctctgtctct gtctccgggt gaacgtgtta ctatgtcttg ccgtgcttct480tcctctgttt ettccaacta cctacactgg tatcagcaaa aaccgggtca ggctccgcgt540ccgtggttct acggtacttc taacctggct tctggtgttc cggaccgttt ctctggtagc600ggttctggta ctgactacac tctgactatc tcccgtatgg atccggaaga cttcgctgtt660tactactgcc agctgtggaa ctacccgctg tacactttcg gtcagagcac caagctggaa720atcaaacgc729<210>5<211>548<212>PRT<213>
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<210>14<211>77<212>DNA<213>
<400>14acaagcttca cctggctacc tccgcctccg cttccgccac ctccgctgcc tccaccgccg60agggccaggc cattctc 77<210>15<211>31<212>DNA<213>
<400>15gtgaagcttg ttgaatctgg tgtagaagtt g 31<210>16<211>35<212>DNA<213>
<400>16cagcggccgc ttatttgatt tccagcttgg tgctc 35<210>17<211>36<212>DNA<213>
<400>17agcccgggcc gccttcatgg ttcgaccatt gaactg 36<210>18<211>32<212>DNA<213>
<400>18agtctagatt agtctttctt ctcgtagact tc 3權(quán)利要求
1.一種新型導(dǎo)向溶栓劑，為鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶的雜合體，其特征在于具有序列表中序列1所示的氨基酸序列，或序列表中序列1的一個或幾個氨基酸經(jīng)過取代，缺失或增加后衍生的，具有與原序列相同功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述溶栓劑的融合基因，其特征在于具有序列表中序列2所示的DNA序列。
3.制備權(quán)利要求1所述溶栓劑的方法，包括以下步驟(1)利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體-低分子量尿激酶融合基因并克隆至原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；(2)將(1)中的大腸桿菌培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達；(3)重組鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體-低分子量尿激酶的分離純化；(4)重組鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體-低分子量尿激酶的體內(nèi)外活性分析。
4.一種新型導(dǎo)向溶栓劑，其特征在于人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶的雜合體，具有序列表中序列5或7所示的氨基酸序列，或序列表中序列5或7的一個或幾個氨基酸經(jīng)過取代，缺失或增加后衍生的，具有與原序列相同功能的氨基酸序列。
5.編碼權(quán)利要求4所述溶栓劑的融合基因，其特征在于具有如序列表中序列6或8所示的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的溶栓劑，其特征在于其中的人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體，具有如序列表中序列3所示的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的溶栓劑，其特征在于編碼人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體的融合基因具有如序列表中序列4所示的DNA序列。
8.制備權(quán)利要求4所述溶栓劑的方法，包括以下步驟(1)利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建兩種人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶融合基因的真核表達載體，轉(zhuǎn)染真核細胞；(2)細胞培養(yǎng)，篩選分別表達兩種人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶雜合體的陽性克隆，以及利用MTX加壓提高重組雜合體的表達量；(3)兩種重組人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶雜合體的體外活性分析。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于真核表達載體為pMCE，真核細胞為CHO/dhfr-細胞，轉(zhuǎn)染方法為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，篩選試劑為G418。
10.權(quán)利要求1或4所述的溶栓劑在制備心腦血管疾病治療藥物中的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中的心腦血管疾病為血栓性疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型導(dǎo)向溶栓制劑，還公開了其制備方法及用途。本發(fā)明第一部分為鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體－低分子量尿激酶雜合體，其制備方法包括表達載體構(gòu)建，表達，純化，活性分析等步驟。第二部分為兩種人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體－低分子量尿激酶雜合體，其制備方法包括構(gòu)建真核表達載體，建立細胞株，雜合體的雙功能分析等。本發(fā)明的雜合體具有導(dǎo)向溶栓功能，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號A61P7/02GK1593655SQ0315678
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月12日
發(fā)明者俞煒源, 劉志剛, 黃君健, 林建波, 徐桂清 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所