專利名稱：針對(duì)腫瘤壞死因子－α的單結(jié)構(gòu)域抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了多肽，其含有針對(duì)腫瘤壞死因子α(TNF-α)的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體。本發(fā)明還涉及它們用于診斷和治療的用途。這些抗體可以具有與人框架序列高度同源的框架序列。描述了僅含有腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體或者其與其他藥物聯(lián)合的組合物。
背景技術(shù)：
認(rèn)為腫瘤壞死因子α(TNF-α)在各種疾病，例如，在炎性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎和多發(fā)性硬化中起重要作用。已經(jīng)很詳細(xì)地研究了TNF-α和受體(CD120a，CD120b)。生物活性形式的TNF-α是三聚體并且通過(guò)鄰近亞單位形成的溝對(duì)于細(xì)胞因子-受體相互作用是重要的。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了拮抗細(xì)胞因子的作用的一些策略并且這些策略當(dāng)前被用于治療各種疾病狀態(tài)。
對(duì)TNF-α具有足夠特異性和選擇性的TNF-α抑制劑可以是有效的預(yù)防或治療性藥物化合物，其用于預(yù)防或治療某些疾病，其中TNF-α被暗示作為病因。已經(jīng)描述了通過(guò)針對(duì)TNF-α的抗體治療毒性休克(EP 486526)、腫瘤退化、細(xì)胞毒性抑制(US 6448380，US 6451983，US 6498237)、自身免疫疾病如RA和局限性回腸炎(EP 663836，US 5672347，US 5656272)、移植排斥宿主反應(yīng)(US 5672347)、細(xì)菌性腦膜炎(EP 585705)的方法。
然而當(dāng)前可利用的藥物沒(méi)有一種可以完全有效治療自身免疫病，并且多數(shù)受到嚴(yán)重毒性的限制。此外，開(kāi)發(fā)對(duì)這種靶序列具有足夠潛能和選擇性的新的化學(xué)實(shí)體(NCE)是極端困難和漫長(zhǎng)的過(guò)程。另一方面基于抗體的治療劑具有作為藥物的重要潛力，因?yàn)閷?duì)它們的靶標(biāo)具有異常的特異性和低的內(nèi)在毒性。此外，當(dāng)與開(kāi)發(fā)新的化學(xué)實(shí)體(NCE)相比時(shí)，開(kāi)發(fā)時(shí)間可以顯著縮短。然而，當(dāng)配體的受體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域嵌入在溝中時(shí)(TNF-α就是這樣)，難以針對(duì)多聚體蛋白產(chǎn)生常規(guī)抗體。本發(fā)明中描述的重鏈抗體來(lái)自駱駝科，公知該這些抗體具有腔結(jié)合傾向(WO 97/49805；Lauwereys等人EMBO J.17，5312，1998))。因此，這種重鏈抗體內(nèi)在地適于結(jié)合諸如TNF的配體的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此外，公知這種抗體長(zhǎng)期保持穩(wěn)定，因此，增加了它們的保存期限(Perez等人，Biochemistry，40，74，2001)。此外，使用與哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵相比廉價(jià)的表達(dá)系統(tǒng)，如酵母或其他微生物在發(fā)酵罐中“一起”產(chǎn)生這種重鏈抗體片段(EP 0 698 097)。
使用來(lái)自諸如小鼠、綿羊、山羊、兔等等來(lái)源的抗體和其人源化衍生物治療需要調(diào)節(jié)炎癥的病癥由于幾個(gè)原因存在問(wèn)題，。常規(guī)抗體在室溫下不穩(wěn)定，并且必須冷凍制備和保存，需要必要的冷凍實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、保存和運(yùn)輸，這消耗了時(shí)間和費(fèi)用。冷凍有時(shí)在發(fā)展中國(guó)家中是不可行的。此外，所述抗體的生產(chǎn)或者小規(guī)模產(chǎn)生是昂貴的，因?yàn)楸磉_(dá)完整和由活性的抗體所需的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)需要時(shí)間和設(shè)備的高水平支持，并且產(chǎn)率非常低。此外，常規(guī)抗體的大尺寸將限制，例如，發(fā)炎組織部位的組織滲透。此外，常規(guī)抗體的結(jié)合活性依賴于pH，并因此不適于用于通常生理pH范圍之外的環(huán)境中諸如，例如，治療胃出血、胃手術(shù)。而且，常規(guī)抗體在低或高pH下不穩(wěn)定并因此不適于經(jīng)口施用。然而，已經(jīng)闡明駱駝科抗體抗嚴(yán)酷的條件，如極端pH、變性試劑和高溫(Dumoulin等人，Protein Science11，500，2002)，因此使得它們適于通過(guò)經(jīng)口施用遞送。此外，常規(guī)抗體具有結(jié)合活性，其取決于溫度，因此不適于用于在生物活性溫度范圍(例如，37±20℃)之外的溫度下實(shí)施的測(cè)定或試劑盒。
多肽治療劑，尤其基于抗體的治療劑具有作為藥物的重要潛力，因?yàn)樗鼈兙哂袑?duì)它們的靶標(biāo)的異常特異性和低的內(nèi)在毒性。然而，技術(shù)人員公知已得到的針對(duì)治療上有用的靶標(biāo)的抗體需要額外的修飾以準(zhǔn)備將其用于人的治療，從而避免當(dāng)施用于人時(shí)在人個(gè)體中發(fā)生的不想要的免疫學(xué)反應(yīng)。該修飾過(guò)程通常被稱為“人源化”。技術(shù)人員公知在不同于人的物種產(chǎn)生的抗體需要人源化以便使得該抗體可用于人的抗體治療((1)CDR嫁接Protein Design LabsUS 6180370，US 5693761；Genentech US6054297；Celltech460167，EP 626390，US 5859205；(2)貼面(veneering)XomaUS 5869619，US 5766886，US 5821123)。需要一種產(chǎn)生抗體的方法，該方法避免了對(duì)實(shí)質(zhì)人源化的需要，或者完全不需要人源化。需要一類新的抗體，這些抗體具有明確的框架區(qū)或者氨基酸殘基并且可被施用于人受試者而不需要實(shí)質(zhì)人源化，或者根本不需要人源化。
常規(guī)抗體的另一個(gè)重要的缺陷是它們是復(fù)雜的大分子并且因此相對(duì)不穩(wěn)定，并且它們對(duì)蛋白酶降解敏感。這意味著常規(guī)抗體藥物不能經(jīng)口、舌下、局部、鼻、陰道、直腸或者吸入施用，因?yàn)樗鼈儾荒艿挚惯@些部位的低pH、這些部位和血液中蛋白酶的作用和/或因?yàn)樗鼈兊拇蟪叽?。它們必須通過(guò)注射(靜脈內(nèi)、皮下，等)施用以克服這些問(wèn)題的若干問(wèn)題。通過(guò)注射施用需要專家訓(xùn)練以便正確和安全地使用皮下注射器或針。還需要無(wú)菌設(shè)備、治療性多肽的液體制劑、所述多肽無(wú)菌和穩(wěn)定形式的小瓶包裝，和對(duì)于受試者，需要針進(jìn)入的適合部位。此外，在接受注射前和注射時(shí)受試者通常經(jīng)歷生理和心理上的壓力。因此，需要一種遞送治療多肽的方法，該方法避免了對(duì)注射的需要，該方法不僅節(jié)省費(fèi)用/時(shí)間，而且對(duì)受試者更方便和更舒適。
基于單結(jié)構(gòu)域的抗體治療具有作為藥物的重要潛力，因?yàn)樗鼈兙哂袑?duì)它們的靶標(biāo)的異常特異性和低的內(nèi)在毒性。然而，進(jìn)一步提高它們的內(nèi)在和功能親合力導(dǎo)致對(duì)患者的許多益處，如更小的治療劑量、更快的治療，和更小的副作用。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供包含結(jié)合TNF-α的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的多肽、所述多肽的同系物、所述多肽的同系物的功能部分。所述多肽結(jié)合TNF-α?xí)r改變TNF-α的生物學(xué)活性。所述多肽可以結(jié)合到TNF-α的受體-結(jié)合溝，或者可以不結(jié)合到受體結(jié)合溝中。這種多肽是單結(jié)構(gòu)域抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供單結(jié)構(gòu)域抗體，其可以是本領(lǐng)域中任一種單結(jié)構(gòu)域抗體或者任一將來(lái)的單結(jié)構(gòu)域抗體。實(shí)例包括，但不限于，重鏈抗體、天然沒(méi)有輕鏈的抗體、從常規(guī)4-鏈抗體衍生的單結(jié)構(gòu)域抗體、工程化抗體和單結(jié)構(gòu)域支架，其不同于從抗體衍生的那些支架。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，如此處所用的單結(jié)構(gòu)域抗體是天然存在的單結(jié)構(gòu)域抗體，其已知為缺少輕鏈的重鏈抗體(WO 9404678)。為了闡明，從缺少輕鏈的重鏈抗體衍生的該可變結(jié)構(gòu)域被稱為VHH或者nanobody以將其與四鏈免疫球蛋白的常規(guī)VH區(qū)別。這種VHH分子可以來(lái)自在駱駝科(Camelidae)物種，例如在駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝和馱馬中產(chǎn)生的抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)口、舌下、局部、經(jīng)鼻、陰道、直腸或通過(guò)吸入施用抗-TNF-α多肽的方法。
本發(fā)明的另一目的是增強(qiáng)單價(jià)單結(jié)構(gòu)域抗體的結(jié)合親合力。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是含有至少一種抗-TNF-α單結(jié)構(gòu)域抗體的抗TNF-α多肽。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其中單結(jié)構(gòu)域抗體相應(yīng)于SEQ ID NOs1到16和79到84任一個(gè)代表的序列。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其還含有針對(duì)血清蛋白至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其中所述血清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、運(yùn)鐵蛋白、或血纖蛋白原之一。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其中單結(jié)構(gòu)域抗血清蛋白單結(jié)構(gòu)域抗體相應(yīng)于SEQ ID NOs26到29和85到97任一個(gè)代表的序列。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其相應(yīng)于SEQID NOs30到43之一代表的序列。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其還含有選自抗-IFN-γ單結(jié)構(gòu)域抗體、抗-TNF-α受體單結(jié)構(gòu)域抗體和抗-IFN-γ受體單結(jié)構(gòu)域抗體的至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其中針對(duì)TNF-α的單結(jié)構(gòu)域抗體的數(shù)目為至少2個(gè)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其相應(yīng)于SEQID NOs73到76之一代表的序列。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是如上所述的抗TNF-α多肽，其中至少一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是人源化的駱駝科VHH。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，其中人源化駱駝科VHH相應(yīng)于SEQ ID NOs17到19和21到24之一代表的序列。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是組合物，其含有如上描述的抗TNF-α多肽和來(lái)自抗-IFN-γ單結(jié)構(gòu)域抗體、抗-TNF-α受體單結(jié)構(gòu)域抗體和抗-IFN-γ受體單結(jié)構(gòu)域抗體的至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體，用于同時(shí)、分開(kāi)或順序地施用于受試者。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，或者如上述的組合物，其中至少一種抗-IFN-γ單結(jié)構(gòu)域抗體相應(yīng)于SEQ ID NOs44到72之一代表的序列。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，或者如上述的組合物，其中所述單結(jié)構(gòu)域抗體是全長(zhǎng)單結(jié)構(gòu)域抗體的同源序列、功能部分或者同源序列的功能部分。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，或者如上述的組合物，其中抗TNF-α多肽是全長(zhǎng)抗TNF-α多肽的同源序列、功能部分或者同源序列的功能部分。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，或者如上述的組合物，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是駱駝科VHH。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是編碼如上述抗TNF-α多肽的核酸。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是鑒定一種試劑的方法，該試劑調(diào)節(jié)如上描述的抗TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結(jié)合，該方法包括步驟(a)將如上描述的抗TNF-α多肽與靶標(biāo)腫瘤壞死因子-α在存在和不存在候選調(diào)節(jié)劑時(shí)，在允許所述多肽和靶標(biāo)結(jié)合的條件下接觸，和(b)測(cè)量步驟(a)的多肽和靶標(biāo)之間的結(jié)合，其中相對(duì)于不存在所述候選調(diào)節(jié)劑時(shí)的結(jié)合，在所述候選調(diào)節(jié)劑的存在下結(jié)合降低，將所述候選調(diào)節(jié)劑鑒定為一種試劑，該試劑調(diào)節(jié)如上描述的抗TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結(jié)合。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是鑒定一種試劑的方法，該試劑通過(guò)如上描述的抗TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結(jié)合調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的疾病，該方法包括(a)將如上描述的抗TNF-α多肽與靶標(biāo)腫瘤壞死因子-α在存在和不存在候選調(diào)節(jié)劑時(shí)，在允許所述多肽和靶標(biāo)結(jié)合的條件下接觸，和(b)測(cè)量步驟(a)的多肽和靶標(biāo)之間的結(jié)合，其中相對(duì)于不存在所述調(diào)節(jié)劑時(shí)的結(jié)合，在所述候選調(diào)節(jié)劑的存在下結(jié)合降低，將所述候選調(diào)節(jié)劑鑒定為一種試劑，該試劑調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的疾病。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是鑒定一種試劑的方法，該試劑通過(guò)如上描述的抗TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結(jié)合調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α與其受體的結(jié)合，該方法包括(a)將如上描述的抗TNF-α多肽與靶標(biāo)腫瘤壞死因子-α在存在和不存在候選調(diào)節(jié)劑時(shí)，在允許所述多肽和靶標(biāo)結(jié)合的條件下接觸，和(b)測(cè)量步驟(a)的多肽和靶標(biāo)之間的結(jié)合，其中相對(duì)于不存在所述候選調(diào)節(jié)劑時(shí)，在所述候選調(diào)節(jié)劑的存在下結(jié)合降低，將所述候選調(diào)節(jié)劑鑒定為一種試劑，該試劑調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α與其受體的結(jié)合。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是篩選調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的疾病的試劑的試劑盒，該試劑盒含有如上描述的抗TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是通過(guò)根據(jù)上述方法鑒定的一種未知試劑，該試劑調(diào)節(jié)如上描述的抗TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結(jié)合。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是通過(guò)根據(jù)上述方法鑒定的一種未知試劑，該試劑調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的疾病。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的一種未知試劑，其中所述疾病是炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化的一種或多種。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽、或者如上描述的核酸、或者如上描述的組合物，或者如上描述的試劑，它們用于治療和/或預(yù)防和/或減輕與炎癥過(guò)程有關(guān)的疾病。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的核酸、或者如上描述的組合物，或者如上描述的試劑的用途，用于制備治療和/或預(yù)防和/或減輕與炎癥反應(yīng)有關(guān)的疾病的藥物。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病，該物質(zhì)能夠穿過(guò)胃環(huán)境而該物質(zhì)不被失活。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物的用途，用于制備治療，預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病癥狀的藥物，該物質(zhì)能夠穿過(guò)胃環(huán)境而該物質(zhì)不被失活。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到陰道和/或直腸道。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的藥物，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到陰道和/或直腸道。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病癥狀的藥物，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜的滲透性。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病癥狀的藥物，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜的滲透性。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)舌下的組織。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病癥狀的藥物，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)舌下的組織。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)皮膚。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病癥狀的藥物，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)皮膚。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的方法、如上描述的試劑盒、如上描述的核酸或試劑、如上描述的核酸或試劑的用途、如上描述的組合物、如上描述的組合物的用途、如上描述的抗-TNF-α多肽、如上描述的抗-TNF-α多肽的用途，其中所述疾病是炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征、多發(fā)性硬化、阿狄森氏病、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、I型糖尿病、附睪炎、腎小球性腎炎、突眼性甲狀腺腫、急性熱病性多神經(jīng)炎、淋巴瘤性甲狀腺腫、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、男性不育癥、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、天皰瘡、牛皮癬、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肉樣瘤病、硬皮病、斯耶格倫綜合征、脊柱關(guān)節(jié)病(spondyloarthropathies)、甲狀腺炎，和脈管炎之一。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是組合物，其含有如上描述的核酸或試劑、如上描述的抗-TNF-α多肽、或者如上描述的組合物，和適宜的藥物載體。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是特征為腫瘤壞死因子-α的機(jī)能障礙的疾病的診斷方法，該方法包括(a)將樣品與如上描述的抗-TNF-α多肽接觸，(b)檢測(cè)所述多肽與所述樣品的結(jié)合，和(c)將步驟(b)中所檢測(cè)到的結(jié)合與標(biāo)準(zhǔn)比較，其中相對(duì)于所述樣品的結(jié)合中的差異可以診斷特征為腫瘤壞死因子-α的機(jī)能障礙的疾病。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是使用如上描述的方法篩選如上引用的疾病的試劑盒。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是篩選如上引用的疾病的試劑盒，該試劑盒含有分離的如上描述的抗-TNF-α多肽。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗-TNF-α多肽的用途，用于純化所述腫瘤壞死因子-α。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的抗-TNF-α多肽的用途，用于抑制腫瘤壞死因子-α和一種或多種腫瘤壞死因子-α受體之間的相互作用。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是產(chǎn)生如上描述的抗-TNF-α多肽的方法，該方法包括步驟(a)得到編碼針對(duì)腫瘤壞死因子-α的駱駝科VHH的雙鏈DNA，(b)克隆和表達(dá)步驟(b)中所選的DNA。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是產(chǎn)生如上描述的抗-TNF-α多肽的方法，該方法包括步驟(a)在允許該多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有能夠編碼如上描述的抗-TNF-α多肽的核酸的宿主細(xì)胞，和(b)從培養(yǎng)物回收所產(chǎn)生的多肽。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如上描述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌或酵母。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是含有如上描述的抗-TNF-α多肽的試劑盒，該試劑盒用于篩選炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征或多發(fā)性硬化的任一種。
附圖和附表簡(jiǎn)述

圖1如實(shí)施例1中描述的抗人TNF VHH的對(duì)比。
圖2根據(jù)實(shí)施例1的ELISA中檢驗(yàn)的抗人TNF-αVHH的稀釋系列。
圖3使用根據(jù)實(shí)施例1的人細(xì)胞系KYM在細(xì)胞毒性測(cè)定中測(cè)量的VHH的拮抗作用。
圖4野生型VHH#12B和突變體A74S+Y76N+K83R+P84A的體外受體結(jié)合測(cè)定。
圖5野生型VHH#12B和突變體1E+Q5LA74S+Y76N+K83R+P84A的體外受體結(jié)合測(cè)定。
圖6野生型VHH#3E和突變體VHH的ELISA中的結(jié)合。
圖7野生型VHH#3E和突變體VHH的體外受體結(jié)合測(cè)定。
圖8如實(shí)施例3中描述的拮抗性抗小鼠TNF的對(duì)比。
圖9使用根據(jù)實(shí)施例3的鼠細(xì)胞系L929在細(xì)胞毒性測(cè)定中測(cè)量的抗小鼠TNF VHH的拮抗作用。
圖10用于產(chǎn)生二價(jià)或雙特異VHH的載體pAX11(pUC119主鏈)的EcoRI-HindIII插入片段。
圖11IMAC純化的單價(jià)-(泳道8)、二價(jià)-(泳道1)、三價(jià)-(泳道2、3、和5)和四價(jià)(泳道4、6和7)抗-TNF a VHH的考馬斯染色的PAGE(15％)。
圖12通過(guò)單價(jià)-、二價(jià)-、三價(jià)和四價(jià)VHH在Superdex 75HR上的凝膠過(guò)濾分析的層析圖。
圖13抗人TNF VHH的單價(jià)-、二價(jià)-、三價(jià)和四價(jià)形式與臨床使用的產(chǎn)品英夫利昔單抗(Remicade)和依那西普(Enbrel)的拮抗特征的比較。
圖14針對(duì)小鼠TNFα的單價(jià)-和二價(jià)VHH的拮抗行為。
圖15來(lái)自實(shí)施例4中描述的人IgG1的VHH-Fc-融合物的考馬斯染色的PAGE。
圖16在生物測(cè)定中確定的與VHH#3E的二價(jià)形式相比VHH#3E衍生的VHH-Fc融合物的拮抗效能。
圖17參比和胃蛋白酶處理的TNF3E在pH 2.2、pH 3.2和pH 4.2下的ELISA(100％是在1/100稀釋下測(cè)量的信號(hào))。
圖18實(shí)驗(yàn)設(shè)置表1針對(duì)TNF-α的本發(fā)明各方面的肽的氨基酸序列。
表2用于VHH#12B的誘變的誘變反應(yīng)、誘變引物和模板的列表。
表3用于VHH#3E的誘變的誘變反應(yīng)、誘變引物和模板的列表。
表4人源化和野生型VHH的概況。
表5抗小鼠血清清蛋白/抗TNF-α。
表6針對(duì)人IFN-γ的VHH的氨基酸序列表。
表7針對(duì)TNF-α的二價(jià)(BIV 3E，BIV#m3F)、三價(jià)(TRI3E)或四價(jià)(TETRA 3E)VHH的序列。
表8本發(fā)明的抗小鼠血清清蛋白VHH的氨基酸序列之間的部分同源性。
表9本發(fā)明的抗-TNF-αVHH間的部分同源性。
表10本發(fā)明的抗-IFN-γVHH的之間的百分比同源性。
表11治療程序表詳述本發(fā)明涉及抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)多肽，其含有針對(duì)TNF-α的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體。本發(fā)明還涉及能夠編碼所述多肽的核酸。
單結(jié)構(gòu)域抗體是這樣的抗體，它們的互補(bǔ)決定區(qū)是單結(jié)構(gòu)域多肽的部分。實(shí)例包括，但不限于，重鏈抗體、天然沒(méi)有輕鏈的抗體、從常規(guī)4-鏈抗體衍生的單結(jié)構(gòu)域抗體、工程化抗體和單結(jié)構(gòu)域支架，其不同于從抗體衍生的那些支架。單結(jié)構(gòu)域抗體可以是本領(lǐng)域中任一種單結(jié)構(gòu)域抗體或者任一將來(lái)的單結(jié)構(gòu)域抗體。單結(jié)構(gòu)域抗體可以來(lái)自任何物種，包括，但不限于，小鼠、人、駱駝、美洲駝、山羊、兔、牛。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，此處所用的單結(jié)構(gòu)域抗體是稱作無(wú)輕鏈的重鏈抗體的天然存在的單結(jié)構(gòu)域抗體。這種單結(jié)構(gòu)域抗體在例如WO 94/04678中描述。為了闡明，從天然缺少輕鏈的重鏈抗體衍生的該可變結(jié)構(gòu)域被稱為VHH或者nanobody，以將其與四鏈免疫球蛋白的常規(guī)VH區(qū)別。這種VHH分子可以來(lái)自在駱駝科物種，例如在駱駝、單峰駱駝、美洲駝、羊駝和馱馬中產(chǎn)生的抗體。除了駱駝科之外的其他物種可以產(chǎn)生天然缺少輕鏈的重鏈抗體；這種VHHs在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明并且技術(shù)人員公知的VHHs是從天然缺少輕鏈的免疫球蛋白衍生的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，如WO 94/04678中描述的從駱駝科衍生的那些(此后稱作VHH結(jié)構(gòu)域或nanobodies)。VHH分子小于IgG分子約10倍。它們是單一多肽并且非常穩(wěn)定，抗極端pH和溫度條件。此外，它們抗蛋白酶的作用，而常規(guī)抗體卻不能抗蛋白酶作用。此外，VHHs的體外表達(dá)產(chǎn)生高產(chǎn)率的、正確折疊的功能VHHs。此外，在Camelids中產(chǎn)生的抗體將識(shí)別某些表位，這些表位不同于通過(guò)使用抗體文庫(kù)在體外產(chǎn)生的抗體或者通過(guò)免疫不同于Camelids的哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的抗體所識(shí)別的表位(WO 9749805)。同樣，抗-TNF-αVHH可以比常規(guī)抗體更有效地與TNF-α相互作用，從而更有效地阻斷其與TNF-α受體的相互作用。
根據(jù)本發(fā)明，TNF-α來(lái)自任何物種。與本發(fā)明相關(guān)的物種的實(shí)例包括兔、山羊、小鼠、大鼠、奶牛、小牛、駱駝、美洲駝、猴子、驢、豚鼠、豬、雞、綿羊、狗、貓、馬，和優(yōu)選地人。
TNF-α也是TNF-α的片段，其能夠引起免疫應(yīng)答。TNF-α也是TNF-α的片段，其能夠結(jié)合針對(duì)全長(zhǎng)TNF-α產(chǎn)生的單結(jié)構(gòu)域抗體。
針對(duì)TNF-α的單結(jié)構(gòu)域抗體指單結(jié)構(gòu)域抗體，其能夠以好于10-6M的親合力結(jié)合TNF-α。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是抗-TNF多肽，其中單結(jié)構(gòu)域抗體含有針對(duì)TNF-α的駱駝科VHH。
針對(duì)TNF-α的抗TNF多肽的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體可以是相同的序列。備選地，它們可以并非全部具有相同的序列。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，抗-TNF多肽含有抗-TNF-α單結(jié)構(gòu)域抗體，這些抗體不都具有相同的序列，但是它們針對(duì)相同的靶標(biāo)、其一種或多種抗原。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是抗-TNF-α多肽，其中單結(jié)構(gòu)域抗體相應(yīng)于如表1中所示的SEQ ID NOs1到16和79到84之一代表的序列。所述序列來(lái)自駱駝科重鏈抗體(VHHs)，這些抗體針對(duì)TNF-α。
本發(fā)明還涉及抗-TNF-α多肽，其中所述單結(jié)構(gòu)域抗體是針對(duì)TNF-α的VHH，其中VHH屬于具有類似人序列的類別。該類別的特征在于VHHs在45位攜帶選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的一個(gè)氨基酸，如，例如，L45，并且在103位的攜帶色氨酸(根據(jù)Kabat編號(hào))。本發(fā)明中描述的駱駝科單結(jié)構(gòu)域抗體的新類別(表1，實(shí)施例1)由VHH#2B(SEQ ID NO3)和VHH#12B(SEQ ID No.14)代表，它們?cè)贔R2中含有疏水殘基并且在103位為疏水殘基色氨酸。
在WO03035694中已描述了由序列VHH#1A(SEQ ID NO.1)、VHH#4B(SEQ ID NO.12)、VHH#8-29(SEQ ID NO.81)、VHH#8-41(SEQID NO.82)、VHH#8-42(SEQ ID NO.83)和VHH#8-44(SEQ ID NO.84)(表1，實(shí)施例1)代表的駱駝科單結(jié)構(gòu)域抗體的另一個(gè)類似人的類別，并且這些抗體含有通常在人來(lái)源或者來(lái)自其他物種的常規(guī)抗體中發(fā)現(xiàn)的疏水FR2殘基，但是通過(guò)103位上的帶電精氨酸彌補(bǔ)了親水性的損失，該精氨酸殘基置換了來(lái)自雙鏈抗體的VH中存在的保守色氨酸殘基。同樣，屬于這兩類的肽顯示出與人VH框架區(qū)的高度氨基酸序列同源性，并且所述肽可以被直接施用于人而不會(huì)預(yù)期出現(xiàn)不想要的免疫應(yīng)答，并且沒(méi)有進(jìn)一步人源化的負(fù)擔(dān)。本發(fā)明還涉及能夠編碼所述多肽的核酸。
因此，本發(fā)明的一方面允許對(duì)需要其的患者直接施用抗-TNF-α多肽，其中單結(jié)構(gòu)域抗體屬于VHH的人源化類別，并且含有由SEQ ID NO1、3、12、14、81、82、83、和84之一代表的序列。
本發(fā)明所用的VHHs的任一種可以是常規(guī)類別或者類似人的駱駝科抗體類別。所述抗體可以針對(duì)完整TNF-α或者其片段，或者其同源序列的片段。這些多肽包括全長(zhǎng)駱駝科抗體，即Fc和VHH結(jié)構(gòu)域，重鏈駱駝科抗體與人Fc結(jié)構(gòu)域的嵌合形式或者VHH自身或者衍生的片段。
抗血清清蛋白VHH可以以比常規(guī)抗體更有效的方式與血清清蛋白相互作用，公知血清清蛋白是載體蛋白。作為載體蛋白，血清清蛋白的一些表位不能被結(jié)合的蛋白、肽和小分子化合物接近。因?yàn)楣猇HH結(jié)合到“不尋常的”或者非常規(guī)表位如腔(WO 97/49805)中，所以這種VHH與循環(huán)的清蛋白的親合力可以被增加。
本發(fā)明還涉及如下發(fā)現(xiàn)如此處描述的抗-TNF多肽還含有針對(duì)受試者的一種或多種血清蛋白的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體，與不是所述構(gòu)建體的部分的抗TNF-α單結(jié)構(gòu)域抗體的半壽期相比，該抗-TNF多肽在所述受試者中循環(huán)半壽期令人驚奇地顯著延長(zhǎng)。這些多肽的實(shí)例在表5中通過(guò)SEQ ID NOs30到43代表。此外，發(fā)現(xiàn)所述多肽顯示出單結(jié)構(gòu)域抗體的相同的有利性質(zhì)，諸如在小鼠中保持完整的高穩(wěn)定性、極端pH抗性、高溫穩(wěn)定性和高靶標(biāo)親合力。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是還含有針對(duì)一種或多種血清蛋白的一個(gè)或多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的抗-TFN-α多肽，所述抗-TFN-α多肽含有由SEQ IDNOs30到43(表5)任一個(gè)代表的序列。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是抗-TFN-α多肽，其中抗血清蛋白單結(jié)構(gòu)域抗體相應(yīng)于如表5中SEQ ID NOs26到29和85到97之一代表的序列。
血清蛋白可以是受試者血清中發(fā)現(xiàn)的任一適宜的蛋白。在本發(fā)明的一方面，血清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、運(yùn)鐵蛋白、或血纖蛋白原。根據(jù)所計(jì)劃的用途，如有效治療所要求的半壽期和/或靶抗原的區(qū)室化，VHH-配偶體可以針對(duì)上面的血清蛋白之一。
本發(fā)明的另一方面是如此處公開(kāi)的抗-TFN-α多肽，其還含有至少一個(gè)多肽，所述多肽選自抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受體多肽和抗-IFN-γ受體多肽。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是針對(duì)IFN-γ的單結(jié)構(gòu)域抗體相應(yīng)于如表6中所示的SEQID NOs44到72任一個(gè)代表的序列。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，單結(jié)構(gòu)域抗體針對(duì)TNF-α受體。所述單結(jié)構(gòu)域抗體可以是駱駝科VHH。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，單結(jié)構(gòu)域抗體是針對(duì)IFN-γ受體。所述單結(jié)構(gòu)域可以是駱駝科VHH。
本發(fā)明的另一方面是治療如此處引用的自身免疫疾病或病癥的方法，該方法包括對(duì)患者施用有效量的抗-TNF-α多肽，該多肽還含有選自抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受體多肽和抗-IFN-γ受體多肽的至少一種多肽，這些多肽如下面描述相互連接。
這種多特異性構(gòu)建體可以比單特異性構(gòu)建體具有作為炎癥治療化合物的更大的潛能。
本發(fā)明的一方面是組合物，該組合物含有如此處公開(kāi)的抗-TNF-α多肽和選自抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受體多肽和抗-IFN-γ受體多肽的至少一種多肽，用于同時(shí)、分開(kāi)或順序施用于受試者。
本發(fā)明的一方面是治療自身免疫疾病的方法，該方法包括對(duì)個(gè)體同時(shí)、分開(kāi)或順序地施用有效量的抗-TNF-α多肽和選自抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受體多肽和抗-IFN-γ受體多肽的至少一種多肽。
本發(fā)明的另一方面是試劑盒，其含有用于同時(shí)、分開(kāi)或順序施用于受試者的抗-TNF-α多肽和選自抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受體多肽和抗-IFN-γ受體多肽的至少一種多肽。本發(fā)明的一個(gè)方面是可以根據(jù)本發(fā)明使用的試劑盒。本發(fā)明的一方面是試劑盒可用于治療此處引用的疾病。
同時(shí)施用指多肽同時(shí)施用于受試者。例如，作為多肽混合物或者包含所述多肽的組合物。實(shí)例包括，但不限于靜脈內(nèi)施用的溶液、片劑、液體、局部霜?jiǎng)?，等等，其中每種制劑都含有目標(biāo)多肽。
分開(kāi)施用指多肽在同時(shí)或者基本上相同的時(shí)間被施用于受試者。這些多肽作為單獨(dú)的、未混合的制劑存在于試劑盒中。例如，不同的多肽可作為單獨(dú)的片劑存在于試劑盒中。通過(guò)同時(shí)或者一個(gè)片劑接一個(gè)地吞咽將片劑施用于受試者。
順序施用指多肽被順序施用于受試者。多肽作為單獨(dú)的、未混合的制劑存在于試劑盒中。制劑之間存在時(shí)間間隔。例如，一種多肽可以在另一組分施用后長(zhǎng)達(dá)336、312、288、264、240、216、192、168、144、120、96、72、48、24、20、16、12、8、4、2、1、或0.5小時(shí)時(shí)被施用。
在順序施用中，一種多肽可以在另一多肽施用之前和/或之后施用一次，或者任一次數(shù)并且以各種劑量施用。順序施用可以與同時(shí)或順序施用聯(lián)合。
下述抗-TNF-α多肽的醫(yī)學(xué)應(yīng)用還應(yīng)用于含有如此處公開(kāi)的抗-TNF-α多肽和選自抗-IFN-γ多肽、抗-TNF-α受體多肽和抗-IFN-γ受體多肽的至少一種多肽的組合物，用于同時(shí)、分開(kāi)或順序施用于如上文中公開(kāi)的受試者。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，抗IFN-γ多肽抗TNF-α單結(jié)構(gòu)域抗體針對(duì)IFN-γ。所述單結(jié)構(gòu)域抗體可以是駱駝科VHH。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是針對(duì)IFN-γ的單結(jié)構(gòu)域抗體相應(yīng)于如表6中所示的SEQ ID NOs44到72之一代表的序列。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，抗TNF-α單結(jié)構(gòu)域抗體針對(duì)TNF-α受體。所述單結(jié)構(gòu)域抗體可以是駱駝科VHH。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，抗IFN-γ受體多肽抗TNF-α單結(jié)構(gòu)域抗體針對(duì)IFN-γ受體。所述單結(jié)構(gòu)域抗體可以是駱駝科VHH。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如此處公開(kāi)的抗TNF-α多肽，其中針對(duì)TNF-α的單結(jié)構(gòu)域抗體的數(shù)目是兩個(gè)或更多。這種多價(jià)抗TNF-α多肽與它們的單價(jià)對(duì)應(yīng)物相比具有對(duì)靶標(biāo)的不尋常的高功能親合力、顯示出比預(yù)期的抑制性質(zhì)更高的抑制性質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。
多價(jià)抗-TNF-α多肽的功能親合力比單價(jià)親本抗-TNF-α多肽高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些多價(jià)多肽的功能親合力比現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于二價(jià)和多價(jià)抗體所報(bào)導(dǎo)的親合力高得多。令人驚奇地，本發(fā)明的抗-TNF-α多肽直接相互連接(SEQ ID No.77和78)或者通過(guò)短接頭序列連接，這些多肽顯示出對(duì)多價(jià)常規(guī)四鏈抗體理論上預(yù)測(cè)的高功能親合力。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)優(yōu)選用由多結(jié)構(gòu)域和多聚體蛋白組成的抗原，在直接結(jié)合測(cè)定或者功能測(cè)定，例如細(xì)胞毒性測(cè)定中可以檢測(cè)這種顯著增強(qiáng)的功能活性。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是如此處公開(kāi)的抗-TNF-α多肽，其中針對(duì)TNFα的單結(jié)構(gòu)域抗體的數(shù)目為兩個(gè)或多個(gè)，所述抗-TNF-α多肽含有相應(yīng)于SEQ ID NOs73到76任一個(gè)所代表的序列。
利用本領(lǐng)域中公知的方法或者任何將來(lái)的方法可以將單結(jié)構(gòu)域抗體連接起來(lái)形成此處公開(kāi)的任一多肽，該多肽含有一個(gè)以上的單結(jié)構(gòu)域抗體。例如，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)將氨基酸殘基與Blattler等人，Biochemistry24，1517-1524；EP294703所描述的有機(jī)衍生試劑反應(yīng)可以將這些單結(jié)構(gòu)域抗體融合。備選地，可以在DNA水平上基因融合單結(jié)構(gòu)域抗體，即，形成多核苷酸構(gòu)建體，其編碼含有一個(gè)或多個(gè)抗靶標(biāo)單結(jié)構(gòu)域抗體和一個(gè)或多個(gè)抗血清蛋白單結(jié)構(gòu)域抗體的完整多肽構(gòu)建體。產(chǎn)生二價(jià)或多價(jià)VHH多肽構(gòu)建體的方法在PCT專利申請(qǐng)WO 96/34103中公開(kāi)。連接多個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的一種方法是通過(guò)基因途徑將單結(jié)構(gòu)域抗體編碼序列直接連接或者通過(guò)肽接頭連接。例如，第一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的C-末端可以連接到下一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的N-末端?？梢詫⒃撨B接模式擴(kuò)展以便連接額外的單結(jié)構(gòu)域抗體以構(gòu)建和產(chǎn)生三功能構(gòu)建體、四功能構(gòu)建體，等等。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，單結(jié)構(gòu)域抗體被直接相互連接，沒(méi)有使用接頭。與連接大體積的常規(guī)抗體(其中需要接頭序列以保持兩個(gè)亞單位中的結(jié)合活性)相反，本發(fā)明的多肽可以直接連接(SEQ ID No.77和78)，從而避免了接頭序列的潛在問(wèn)題，諸如施用于人類受試者時(shí)的抗原性、接頭序列的不穩(wěn)定導(dǎo)致亞單位解離。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，單結(jié)構(gòu)域抗體通過(guò)肽接頭序列相互連接。這種接頭序列可以是天然存在的序列或者非天然存在的序列。預(yù)期接頭序列在該抗-TNF-α多肽所施用的受試者中是非免疫原性的。接頭序列可以對(duì)多價(jià)抗-TNF-α多肽提供足夠的柔性，同時(shí)可以抗蛋白水解降解。接頭序列的一個(gè)非限制性實(shí)例是可以衍生自WO96/34103中描述的VHHs的鉸鏈區(qū)的接頭序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，含有兩個(gè)以上單結(jié)構(gòu)域抗體的多價(jià)單結(jié)構(gòu)域抗體可以直接或者通過(guò)接頭序列相互連接。用常規(guī)抗體難以產(chǎn)生這種構(gòu)建體并且由于大體積亞單位的空間位阻，功能性將喪失或者極大地減小，而不是與單價(jià)構(gòu)建體相比用本發(fā)明的VHH所看到的功能性顯著增加(對(duì)于這種多價(jià)VHH構(gòu)建體的凝膠過(guò)濾分析，見(jiàn)圖12)。
技術(shù)人員根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法或者任一種將來(lái)的方法可以制備此處公開(kāi)的多肽構(gòu)建體。例如，用本領(lǐng)域中公知的方法，如通過(guò)免疫駱駝和從駱駝得到雜交瘤，或者利用本領(lǐng)域中公知的分子生物學(xué)技術(shù)克隆單結(jié)構(gòu)域抗體的文庫(kù)并隨后通過(guò)噬菌體展示選擇可以得到VHH。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，抗-TNF-α多肽可以是全長(zhǎng)抗-TNF-α多肽的同源序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，抗-TNF-α多肽可以是全長(zhǎng)抗-TNF-α多肽功能部分。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，抗-TNF-α多肽可以是全長(zhǎng)抗-TNF-α多肽的同源序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，抗-TNF-α多肽可以是全長(zhǎng)抗-TNF-α多肽的同源序列的功能部分。根據(jù)本發(fā)明的一方面，抗-TNF-α多肽可以含有抗-TNF-α多肽的序列。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，用于形成抗-TNF-α多肽的單結(jié)構(gòu)域抗體可以是完整單結(jié)構(gòu)域抗體(例如，VHH)或者其同源序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，用于形成多肽構(gòu)建體的單結(jié)構(gòu)域抗體可以是完整單結(jié)構(gòu)域抗體的功能部分。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，用于形成多肽構(gòu)建體的單結(jié)構(gòu)域抗體可以是完整單結(jié)構(gòu)域抗體的同源序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，用于形成多肽構(gòu)建體的單結(jié)構(gòu)域抗體可以是完整單結(jié)構(gòu)域抗體的同源序列的功能部分。
如文中所用的，本發(fā)明的同源序列可以含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的加入、缺失或置換，這些加入、缺失或置換不實(shí)質(zhì)性地改變本發(fā)明多肽的功能特征。氨基酸缺失或置換的數(shù)目?jī)?yōu)選多達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個(gè)氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的同源序列可以是通過(guò)氨基酸的加入、缺失或置換修飾的多肽，所述修飾與未修飾的多肽相比不實(shí)質(zhì)上改變功能特征。
根據(jù)本發(fā)明的同源序列可以是通過(guò)氨基酸的加入、缺失或置換修飾的多肽，所述修飾與未修飾的多肽相比不實(shí)質(zhì)上改變功能特征。
根據(jù)本發(fā)明的同源序列可以是存在于其他駱駝科物種如，例如，駱駝、單峰駱駝、美洲駝、羊駝、馱馬等中的序列。
當(dāng)同源序列指出序列同一性時(shí)，其表示一個(gè)序列與親本序列具有高度序列同一性(多于70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％序列同一性)并且優(yōu)選特征為與親本序列具有相似的性質(zhì)，即親合力，所述同一性為利用公知的方法計(jì)算得到。
備選地，同源序列還可以是根據(jù)下式從親本序列的任何數(shù)目的位置上允許的置換得到的任一氨基酸序列Ser被Ser、Thr、Gly、和Asn置換；Arg被Arg、His、Gln、Lys、和Glu之一置換；Leu被Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、和Val之一置換；Pro被Pro、Gly、Ala、和Thr之一置換；Thr被Thr、Pro、Ser、Ala、Gly、His、和Gln之一置換；Ala被Ala、Gly、Thr、和Pro之一置換；Val被Val、Met、Tyr、Phe、Ile、和Leu之一置換；Gly被Gly、Ala、Thr、Pro、和Ser之一置換；Ile被Ile、Met、Tyr、Phe、Val、和Leu之一置換；Phe被Phe、Trp、Met、Tyr、Ile、Val、和Leu之一置換；Tyr被Tyr、Trp、Met、Phe、Ile、Val、和Leu之一置換；His被His、Glu、Lys、Gln、Thr、和Arg之一置換；Gln被Gln、Glu、Lys、Asn、His、Thr、和Arg之一置換；Asn被Asn、Glu、Asp、Gln、和Ser之一置換；Lys被Lys、Glu、Gln、His、和Arg之一置換；Asp被Asp、Glu、和Asn之一置換；Glu被Glu、Asp、Lys、Asn、Gln、His、和Arg之一置換；Met被Met、Phe、Ile、Val、Leu、和Tyr之一置換。
根據(jù)本發(fā)明的同源核苷酸序列可以指50、100、200、300、400、500、600、800或1000個(gè)核苷酸以上的核苷酸序列，其在嚴(yán)格雜交條件(如Sambrook等人，Molecular Cloning，Laboratory Manuel，Cold Spring，HarborLaboratory出版社，New York中描述的雜交條件)下能夠與能夠編碼親本序列的核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列雜交。
如文中所用的，功能部分指單結(jié)構(gòu)域抗體的序列，該序列具有足夠大小從而目標(biāo)相互作用保持在親合力為1×10-6M或更好。
備選地，功能部分含有完整氨基酸序列的部分缺失并且仍然保持結(jié)合靶標(biāo)并與其相互作用所需的結(jié)合部位和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
如文中所用的，功能部分指完整序列的100％以下(例如，99％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％，等)，但是含有5個(gè)或更多的氨基酸或者15個(gè)或更多核苷酸。
本文中所提到的靶標(biāo)諸如TNF-α、TNF-α受體、血清蛋白(例如血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、運(yùn)鐵蛋白、血纖蛋白原)和IFN-γ、IFN-γ受體可以是所述靶標(biāo)的片段。從而靶標(biāo)也是所述靶標(biāo)的片段，其能夠引起免疫應(yīng)答。靶標(biāo)還是所述靶標(biāo)的片段，其能夠與針對(duì)全長(zhǎng)靶標(biāo)產(chǎn)生的單結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合。
如本文中所用的片段指序列的100％以下(例如，99％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％等)，但是含有5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多氨基酸。片段足夠長(zhǎng)從而目標(biāo)相互作用保持在親合力為1×10-6M或更好。
如本文所用的片段也指一個(gè)或多個(gè)氨基酸的任選插入、缺失和置換，這些插入、缺失和置換不實(shí)質(zhì)性地改變靶標(biāo)與針對(duì)野生型靶標(biāo)產(chǎn)生的單結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合的能力。氨基酸插入缺失或置換的數(shù)目?jī)?yōu)選多達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的同源序列可以包括已經(jīng)被人源化的抗-TNF-α多肽。VHH的新類別的抗體的人源化將使施用時(shí)在人類個(gè)體中的不需要的免疫反應(yīng)性的可能性進(jìn)一步降低。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及制備基于美洲駝抗體的修飾的多肽的方法，通過(guò)確定抗體可變結(jié)構(gòu)域(VHH)的氨基酸殘基，可以修飾抗體可變結(jié)構(gòu)域而不減小該結(jié)構(gòu)域?qū)乖奶烊挥H合力，而減小其關(guān)于異源物種的免疫原性可以實(shí)現(xiàn)該方法；還涉及用于施用于異源物種的在所鑒定的殘基處具有修飾的VHHs的用途，還涉及如此修飾的VHH。
更具體地，本發(fā)明涉及修飾的VHHs的制備，為了施用于人而修飾該VHHs，還涉及所得VHH自身，和這種“人源化”VHHs在治療人類的疾病的用途。人源化意味著突變，使得當(dāng)施用于人類患者時(shí)免疫原性很小或者不存在。根據(jù)本發(fā)明，將多肽人源化包括將一個(gè)或多個(gè)駱駝科氨基酸用在人共有序列中發(fā)現(xiàn)的它們的人對(duì)應(yīng)物置換，而該多肽不喪失其典型特征，即，該人源化不顯著影響所得多肽的抗原結(jié)合能力。這種方法是技術(shù)人員公知的。
駱駝科單結(jié)構(gòu)域抗體的人源化需要在單個(gè)多肽鏈中導(dǎo)入和誘變有限量的氨基酸。這與scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化相反，scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化需要在兩條鏈——輕鏈和重鏈中導(dǎo)入氨基酸，還需要保留兩條鏈的裝配。
作為非限制性實(shí)例。將在FR2中包含類人殘基的VHH#12B的多肽人源化。人源化需要誘變FR1中1和5位上的殘基，其通過(guò)用于所有組成成分克隆的引物導(dǎo)入并且在美洲駝序列中不天然地存在。那些殘基中的誘變不導(dǎo)致結(jié)合和/或抑制活性的損失。人源化還需要在FR3中74、76、83、84、93位上殘基的誘變。那些殘基中的誘變不導(dǎo)致結(jié)合和/或抑制活性的顯著損失(見(jiàn)圖4)。因此聯(lián)合FR1和FR3的突變不影響結(jié)合和/或抑制活性(圖5)。人源化還需要在FR4中108位上的誘變。Q108L的誘變導(dǎo)致在大腸桿菌中生產(chǎn)水平降低。108位在camelid VHH中暴露于溶劑，而在人抗體中，該位置被埋藏在VH-VL界面(Spinelli，1996；Nieba，1997)。在分離的VHs中，108位暴露于溶劑。導(dǎo)入非極性疏水Leu而不是極性未帶電的Gln可以對(duì)該分子的內(nèi)在折疊/穩(wěn)定性具有顯著影響。
作為非限制性實(shí)例，將VHH#3E中所代表的多肽人源化，VHH#3E中所代表的多肽在37、44、45和47位上含有camelid標(biāo)志性殘基，它們具有親水特征。在44和45位通過(guò)人疏水殘基置換親水殘基(E44G和R45L)對(duì)結(jié)合和/或抑制沒(méi)有影響。然而，當(dāng)導(dǎo)入F37V和F47W時(shí)，觀察到結(jié)合和/或抑制活性的損失。建模數(shù)據(jù)證明殘基37對(duì)于保持CDR3環(huán)構(gòu)象的完整性從而對(duì)于活性的保持是關(guān)鍵的(見(jiàn)圖6)(所有編號(hào)都根據(jù)Kabat)。
SEQ ID NO3和14顯示出與人VH框架區(qū)的90％以上的氨基酸序列同源性并且因此所述VHH可以直接施用于患者而不預(yù)期從中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且沒(méi)有額外的人源化負(fù)擔(dān)。因此，本發(fā)明的一方面允許對(duì)需要該治療的患者直接施用含有SEQ ID NO3和14的多肽、其同源序列，或者其同源序列的功能部分。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是人源化VHH的方法，該方法包括單獨(dú)或聯(lián)合置換下面的殘基之一FR1位置1、5、28和30，F(xiàn)R2中44和45位標(biāo)志氨基酸，F(xiàn)R3殘基74、75、76、83、84、93和94，和FR4中103、104、108和111位；根據(jù)Kabat編號(hào)方法編號(hào)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是抗-TNF-α多肽，或者能夠編碼所述多肽的核酸，它們用于治療、預(yù)防和/或減輕與炎癥過(guò)程有關(guān)的疾病的癥狀。TNF-α與炎癥過(guò)程有關(guān)，并且TNF-α作用的阻斷具有抗炎癥作用，該抗炎癥作用在某些疾病狀態(tài)諸如，例如，局限性回腸炎中是非常理想的。我們的實(shí)施例闡明了根據(jù)本發(fā)明的VHHs，它們結(jié)合TNF-α并且阻斷其與TNF-α受體的結(jié)合。
本發(fā)明的抗TNF-α多肽可應(yīng)用于自身免疫病，如阿狄森氏病(腎上腺)、耳朵的自身免疫疾病(耳朵)、眼睛的自身免疫疾病(眼睛)、自身免疫肝炎(肝)、自身免疫腮腺炎(腮腺)、局限性回腸炎(腸)、I型糖尿病(胰腺)、附睪炎(附睪)、腎小球性腎炎(腎)、突眼性甲狀腺腫(甲狀腺)、急性熱病性多神經(jīng)炎(神經(jīng)細(xì)胞)、淋巴瘤性甲狀腺腫(甲狀腺)、溶血性貧血(紅細(xì)胞)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(多種組織)、男性不育癥(精液)、多發(fā)性硬化(神經(jīng)細(xì)胞)、重癥肌無(wú)力(神經(jīng)肌肉接點(diǎn))、天皰瘡(主要是皮膚)、牛皮癬(皮膚)、風(fēng)濕熱(心臟和關(guān)節(jié))、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(關(guān)節(jié)襯里)、肉樣瘤病(許多組織和器官)、硬皮病(皮膚和結(jié)締組織)、斯耶格倫綜合征(外分泌腺、及其他組織)、脊柱關(guān)節(jié)病(中軸骨骼、及其他組織)、甲狀腺炎(甲狀腺)、脈管炎(血管)。括號(hào)內(nèi)是受疾病影響的組織。該自身免疫疾病列表是代表性而非包括的。
本發(fā)明的抗-TNF-α多肽適用的自身免疫病癥包括，例如，AIDS、特異反應(yīng)性過(guò)敏、支氣管氣喘、濕疹、麻風(fēng)、精神分裂癥、遺傳性抑郁癥、組織和器官的移植、慢性疲勞綜合征、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、心肌梗死、中風(fēng)、孤獨(dú)癥、癲癇、阿圖斯現(xiàn)象、過(guò)敏反應(yīng)，和酒精和藥癮。上面鑒定的自身免疫病癥中，受影響的組織是主要靶標(biāo)，在其它情況下，該組織是次要靶標(biāo)。這些病癥部分或主要是自身免疫綜合征。因此，在治療它們時(shí)，可以使用本文公開(kāi)的相同方法，或者該相同方法的方面，有時(shí)與其他方法聯(lián)合。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明的抗-TNF-α多肽、或者編碼所述多肽的核酸的用途，用于制備治療與炎癥過(guò)程有關(guān)的疾病的藥物。疾病的實(shí)例包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化。
通過(guò)常規(guī)途徑，如靜脈內(nèi)途徑可以對(duì)受試者施用根據(jù)本發(fā)明的多肽和核酸。然而，本發(fā)明的抗-TNF-α多肽的一個(gè)特別的性質(zhì)是它們穿透諸如組織膜和/或腫瘤的屏障并且局部作用于它們，并且這些多肽足夠穩(wěn)定而可以抵抗諸如胃中的極端環(huán)境。因此，本發(fā)明的另一方面涉及抗-TNF-α多肽的遞送。
根據(jù)本發(fā)明的受試者可以是易受治療多肽的治療影響的任何哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的抗-TNF-α多肽的經(jīng)口遞送導(dǎo)致在結(jié)腸中受疾病影響的局部部位中提供活性形式的這種分子。這些部位可以高度發(fā)炎并且含有產(chǎn)生TNF-α的細(xì)胞。本發(fā)明的抗-TNF-α多肽結(jié)合TNF-α，可以局部中和TNF-α，避免了在全身的分布，從而限制了不利的副作用。遺傳修飾的微生物如乳酸微球菌(Micrococcus lactis)可以分泌抗體或者其功能部分。這種修飾的微生物可用作載體以在腸內(nèi)局部產(chǎn)生和遞送抗體或者其功能部分。通過(guò)使用產(chǎn)生抗-TNF-α多肽的株系，可以治療炎性腸綜合征。
本發(fā)明的另一方面包括使用諸如WO00/23471中描述的載體通過(guò)非侵染性細(xì)菌，如革蘭氏陽(yáng)性宿主生物，如乳球菌屬物種(Lactococcus spec.)的表面表達(dá)或者分泌遞送抗-TNF多肽。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是如本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽，其用于治療、預(yù)防和/或減輕疾病的癥狀，這些疾病易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)節(jié)，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠穿過(guò)胃環(huán)境而不被失活。
疾病的實(shí)例是導(dǎo)致炎癥的任一疾病，包括，但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化。如本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的，一旦擁有所述多肽構(gòu)建體，就可以應(yīng)用配制技術(shù)在正確位置(胃中、結(jié)腸中，等等)釋放大量多肽。該遞送方法對(duì)于治療、預(yù)防和/或減輕疾病的癥狀是重要的，其中這些疾病的靶標(biāo)位于內(nèi)臟系統(tǒng)中。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)對(duì)受試者經(jīng)口施用如本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽，治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠穿過(guò)胃環(huán)境而不被失活。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是如本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的藥物，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠穿過(guò)胃環(huán)境而不被失活。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)對(duì)受試者經(jīng)口施用如本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽向內(nèi)臟系統(tǒng)遞送TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)并且所述物質(zhì)不被失活的方法。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)對(duì)受試者經(jīng)口施用如本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽向受試者的血流遞送TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)并且所述物質(zhì)不被失活的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是如本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽，其用于治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到陰道和/或直腸道。
疾病的實(shí)例是導(dǎo)致炎癥的任一疾病，包括，但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化。在非限制性實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的制劑含有本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽，該制劑為凝膠、霜?jiǎng)?、栓劑、膜劑的形式或者為海綿或者陰道環(huán)的形式，該制劑隨時(shí)間緩慢釋放活性成分(這些制劑在EP 707473、EP 684814、US 5629001中描述)。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)將本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽經(jīng)陰道和/或直腸施用于受試者以治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的方法，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到陰道和/或直腸道。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的藥物，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到陰道和/或直腸道。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)將本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽經(jīng)陰道和/或直腸道施用于受試者以將TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)遞送到陰道和/或直腸道并且所述物質(zhì)不被失活的方法。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)將本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽經(jīng)陰道和/或直腸道施用于受試者以將TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)遞送所述受試者的血流并且所述物質(zhì)不被失活的方法。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽，其用于治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺。
疾病的實(shí)例是導(dǎo)致炎癥的任一疾病，包括，但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化。在非限制性實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的制劑含有本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽，該制劑為鼻噴霧劑(例如，氣溶膠)或者吸入器的形式。因?yàn)樵摱嚯臉?gòu)建體小，所以其可以比治療性IgG分子更有效地到達(dá)其靶標(biāo)。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)嘴或鼻吸入將本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽施用于受試者以治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到上呼吸道和肺。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的藥物，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺，并且所述多肽未被失活。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)將本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽施用于受試者的鼻、上呼吸道和/或肺，將TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)遞送到鼻、上呼吸道和肺而不失活的方法。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)將本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽施用于受試者的鼻、上呼吸道和/或肺，將TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)遞送到受試者的血流而不失活的方法。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽，其用于治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加腸粘膜的透性。文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽因?yàn)樗鼈兊男〕叽?，所以可以穿過(guò)腸粘膜并更有效地到達(dá)患有疾病的受試者的血流，所述疾病導(dǎo)致腸粘膜的透性增加，該疾病為例如，局限性回腸炎。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)對(duì)受試者經(jīng)口施用本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽治療、預(yù)防和/或減輕疾病的癥狀的方法，所述疾病易受被遞送到腸粘膜的TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)，其中所述疾病增加了腸粘膜的透性。
該方法甚至可以被本發(fā)明的額外方面——使用主動(dòng)運(yùn)輸載體——進(jìn)一步增強(qiáng)。在本發(fā)明的該方面，VHH與載體融合，該載體增強(qiáng)了穿過(guò)腸壁進(jìn)入血流的傳遞。在非限制性實(shí)例中，該“載體”是另一VHH，其融合到治療VHH。利用本領(lǐng)域中公知的方法制備這種融合構(gòu)建體。該“載體”VHH特異結(jié)合到腸壁上的受體，該結(jié)合誘導(dǎo)穿過(guò)腸壁的主動(dòng)傳遞。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是使用本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽制備用于治療、預(yù)防和/或減輕疾病的癥狀的藥物，該疾病易受遞送到腸粘膜的TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)，其中所述疾病增加了腸粘膜的通透性。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)對(duì)受試者經(jīng)口施用本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽將TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)遞送到腸粘膜而不失活的方法。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)對(duì)受試者經(jīng)口施用本發(fā)明的抗-TNF-α多肽將TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)遞送到受試者的血流而不失活的方法。
該方法甚至可以被本發(fā)明的額外方面——使用主動(dòng)運(yùn)輸載體——進(jìn)一步增強(qiáng)。在本發(fā)明的該方面，本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽與載體融合，該載體增強(qiáng)了穿過(guò)腸壁進(jìn)入血流的傳遞。在非限制性實(shí)例中，該“載體”是與所述多肽融合的VHH。利用本領(lǐng)域中公知的方法制備這種融合構(gòu)建體。該“載體”VHH特異結(jié)合到腸壁上的受體，該結(jié)合誘導(dǎo)穿過(guò)腸壁的主動(dòng)傳遞。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽，其用于治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)舌下的組織。
疾病的實(shí)例是導(dǎo)致炎癥的任一疾病，包括，但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化。本文中公開(kāi)的所述多肽構(gòu)建體的制劑，例如，片劑、噴霧劑、滴劑被置于舌下并通過(guò)粘膜吸收到舌下的毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)中。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)將本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽舌下施用于受試者，治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的方法，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)舌下的組織。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的藥物，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠穿過(guò)舌下的組織。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)將本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽舌下施用于受試者將TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)遞送到舌下的組織而不失活的方法。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)將本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽經(jīng)口施用于受試者而將TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)遞送到受試者的血流而不失活的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽在治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀中的應(yīng)用，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)皮膚。
疾病的實(shí)例是導(dǎo)致炎癥的任一疾病，包括，但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化。所述多肽構(gòu)建體的制劑，例如，霜?jiǎng)?、膜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑被置于皮膚上并穿過(guò)皮膚。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)將本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽局部施用于受試者，治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的方法，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)皮膚。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的藥物，該TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)皮膚。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)將本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽局部施用于受試者將TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)遞送到皮膚而不失活的方法。
本發(fā)明的一方面是通過(guò)將本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽局部施用于受試者而將TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)遞送到受試者的血流的方法。
在本發(fā)明的另一方面，抗-TNF-α多肽還含有載體單結(jié)構(gòu)域抗體(例如，VHH)，其作為主動(dòng)運(yùn)輸載體將所述抗-TNF-α多肽從肺腔運(yùn)輸?shù)窖褐小?br> 還含有載體的抗-TNF-α多肽特異結(jié)合粘膜表面(支氣管上皮細(xì)胞)上的受體，導(dǎo)致該多肽從肺腔向血液的主動(dòng)運(yùn)輸。該載體單結(jié)構(gòu)域抗體可以融合到多肽構(gòu)建體。這種融合構(gòu)建體可以利用本領(lǐng)域中公知的方法制備并且在本文中描述?！拜d體”單結(jié)構(gòu)域抗體特異結(jié)合粘膜表面上的受體，該結(jié)合誘導(dǎo)穿過(guò)該表面的主動(dòng)傳遞。
本發(fā)明的另一方面是確定當(dāng)經(jīng)鼻施用時(shí)那些單結(jié)構(gòu)域抗體(例如VHHs)被主動(dòng)運(yùn)輸?shù)窖髦械姆椒?。類似地，可以將首次用于?shí)驗(yàn)的或者免疫VHH噬菌體文庫(kù)經(jīng)鼻施用，并且施用后不同的時(shí)間點(diǎn)后，可以分離血液或器官以拯救已經(jīng)被主動(dòng)運(yùn)輸?shù)窖髦械氖删w。從肺腔向血流的主動(dòng)運(yùn)輸?shù)氖荏w的一個(gè)非限制性實(shí)例是Fc受體N(FcRn)。本發(fā)明的一方面包括通過(guò)該方法鑒定的VHH分子。然后這種VHH可以作為載體VHH在經(jīng)鼻施用時(shí)將治療VHH遞送到血流中的相應(yīng)靶標(biāo)中。
在本發(fā)明的一方面中，可以使用本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽，以便篩選調(diào)節(jié)該多肽與TNF-α結(jié)合的試劑。當(dāng)在測(cè)量結(jié)合或者僅所述多肽置換的測(cè)定中鑒定時(shí)，試劑將必須進(jìn)行功能試驗(yàn)以確定它們是否在體內(nèi)調(diào)節(jié)抗原的作用。下面主要關(guān)于SEQ ID NO3給出了篩選測(cè)定的實(shí)例，然而本文中公開(kāi)的任一種抗TNF-α多肽都是適宜的。
在置換實(shí)驗(yàn)的一個(gè)實(shí)例中，在漸增濃度的候選調(diào)節(jié)劑的存在或不存在時(shí)，將表達(dá)TNF-α或者其片段的噬菌體或者細(xì)胞與例如，SEQ ID NO3所代表的已經(jīng)被標(biāo)記的多肽在結(jié)合緩沖液中孵育。為了驗(yàn)證和校準(zhǔn)該測(cè)定，可以實(shí)施對(duì)照競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，該反應(yīng)使用漸增濃度的所述多肽并且該多肽未被標(biāo)記。孵育后，充分洗滌細(xì)胞，用對(duì)于給定標(biāo)記適宜的方法(例如，閃爍計(jì)數(shù)、熒光，等)測(cè)量結(jié)合的標(biāo)記多肽。候選調(diào)節(jié)劑存在下結(jié)合的所標(biāo)記的多肽的量下降至少10％表明結(jié)合被候選調(diào)節(jié)劑置換。如果候選調(diào)節(jié)劑在1μM或更小的濃度下置換50％被標(biāo)記的多肽(亞飽和多肽劑量)，那么認(rèn)為該候選調(diào)節(jié)劑在本文中描述的該測(cè)定或者其他測(cè)定中特異結(jié)合。
備選地，通過(guò)表面胞質(zhì)團(tuán)共振(SPR)可以監(jiān)視結(jié)合或者結(jié)合的置換。表面胞質(zhì)團(tuán)共振測(cè)定可用作定量方法以測(cè)量?jī)蓚€(gè)分子之間的結(jié)合，該測(cè)量是通過(guò)例如來(lái)自水相的SEQ ID NO3代表的多肽與傳感器上膜中固定的TNF-α之間的結(jié)合或者結(jié)合的喪失導(dǎo)致該被固定的傳感器附近質(zhì)量的改變實(shí)現(xiàn)的。該質(zhì)量的改變被測(cè)量為注射或除去所述多肽或者候選結(jié)合劑后相對(duì)于時(shí)間的共振單位并且使用Biacore生物傳感器(Biacore AB)測(cè)量。根據(jù)Salamon等人(Salamon等人，1996，Biophys J.71283-294；Salamon等人，2001，Biophys.J.801557-1567；Salamon等人，1999，Trends Biochem.Sci.24213-219，每一篇都被并入本文作為參考。)描述的方法，可以將TNF-α例如固定在薄膜液體膜中的傳感器芯片(例如，研究級(jí)CM5芯片，BiacoreAB)上。Sarrio等人闡明SPR可用于檢測(cè)配體與固定在芯片上的液體層中的GPCR A(1)腺苷受體的結(jié)合(Sarrio等人，2000，Mol.Cell.Biol.205164-5174，被并入本文作為參考)。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用Sarrio等人報(bào)導(dǎo)的條件作為起點(diǎn)可以微調(diào)SPR測(cè)定中SEQ ID NO3與TNF-α結(jié)合的條件。
SPR可以以至少兩種方法測(cè)定結(jié)合調(diào)節(jié)劑。首先，SEQ ID NO3所代表的多肽例如，可以預(yù)先結(jié)合到被固定的TNF-α，然后注射濃度為0.1nM到1μM的候選調(diào)節(jié)劑?？梢远克Y(jié)合的多肽的置換，從而可以檢測(cè)調(diào)節(jié)劑結(jié)合。備選地，膜-結(jié)合的TNF-α可以與候選調(diào)節(jié)劑預(yù)孵育并用例如，SEQ ID NO3所代表的多肽刺激。所述多肽和與調(diào)節(jié)劑預(yù)孵育的TNF-α之間的結(jié)合親合力與沒(méi)有調(diào)節(jié)劑時(shí)所述多肽和TNF-α之間的結(jié)合相比的差異將表明在調(diào)節(jié)劑的存在下所述多肽的結(jié)合或置換。在任一測(cè)定中，相對(duì)于不存在候選調(diào)節(jié)劑時(shí)結(jié)合的所述多肽的量，存在候選調(diào)節(jié)劑時(shí)結(jié)合的所述多肽的量降低10％或以上表明該候選調(diào)節(jié)劑抑制TNF-α和所述多肽之間的相互作用。
檢測(cè)例如SEQ ID NO3所代表的多肽與TNF-α之間的結(jié)合的抑制的另一種方法使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。FRET是一種量子力學(xué)現(xiàn)象，如果熒光供體(D)的發(fā)射光譜與熒光受體(A)的激發(fā)光譜重疊，在相互非常接近的熒光供體(D)和熒光受體(A)(通常相隔＜100)間發(fā)生FRET。所試驗(yàn)的分子，例如，SEQ ID NO3所代表的多肽和TNF-α被供體和受體熒光團(tuán)的互補(bǔ)對(duì)標(biāo)記。盡管被TNF-α多肽相互作用緊密結(jié)合，但是當(dāng)所述多肽和TNF-α不結(jié)合時(shí)，供體熒光團(tuán)的激發(fā)所發(fā)出的熒光將與應(yīng)答該激發(fā)波長(zhǎng)所發(fā)生的熒光具有不同的波長(zhǎng)，從而通過(guò)測(cè)量每個(gè)波長(zhǎng)下發(fā)射強(qiáng)度就可以定量結(jié)合的和未結(jié)合的分子。用于標(biāo)記TNF-α的供體熒光團(tuán)是本領(lǐng)域中熟知的。特別感興趣的是A.Victoria GFP的變體，它們已知為Cyan FP(CFP，供體(D))和Yellow FP(YFP，受體(A))。作為實(shí)例，可以將YFP變體與TNF-α制成融合蛋白。用于表達(dá)GFP變體為融合物的載體(Clontech)以及熒光團(tuán)標(biāo)記的試劑(Molecular Probes)是本領(lǐng)域中公知的。將候選調(diào)節(jié)劑加入熒光-標(biāo)記的多肽和YFP-TNF-α的混合物將導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移的抑制，這可以通過(guò)例如，相對(duì)于沒(méi)有候選調(diào)節(jié)劑的樣品YFP熒光的降低來(lái)證明。在使用FRET檢測(cè)TNF-α多肽相互作用的測(cè)定中，相對(duì)于沒(méi)有候選調(diào)節(jié)劑的樣品，含有候選調(diào)節(jié)劑的樣品中受體波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射強(qiáng)度降低10％或更大，表明該候選調(diào)節(jié)劑抑制TNF-α多肽相互作用。
此處所用的樣品可以是含有TNF-α的任一生物樣品，諸如臨床樣品(例如，細(xì)胞級(jí)分、全血、血漿、血清、組織、細(xì)胞，等)、來(lái)自臨床的樣品、農(nóng)業(yè)樣品、法醫(yī)樣品、研究樣品或者其他可能的樣品。臨床樣品可來(lái)自人或動(dòng)物來(lái)源。所分析的樣品可以本質(zhì)上是固體或液體。很明顯當(dāng)使用固體材料時(shí)，首先將它們?nèi)苡谶m宜的溶液中。
FRET的一種變通方案是使用熒光淬滅以監(jiān)視分子相互作用。相互作用對(duì)中的一個(gè)分子可以被熒光團(tuán)標(biāo)記，另一個(gè)分子被一種分子標(biāo)記，當(dāng)該熒光團(tuán)與該標(biāo)記分子密切接合時(shí)淬滅該熒光團(tuán)的熒光。激發(fā)時(shí)熒光的改變表明用熒光團(tuán)淬滅劑配對(duì)所標(biāo)記的分子的關(guān)聯(lián)的變化。通常，被標(biāo)記的TNF-α的熒光的增加表明具有淬滅劑的抗-TNF-α多肽已經(jīng)被置換。對(duì)于淬滅測(cè)定，相對(duì)于沒(méi)有候選調(diào)節(jié)劑的樣品，含有該候選調(diào)節(jié)劑的樣品中熒光發(fā)射強(qiáng)度增加10％或更大表明該候選調(diào)節(jié)劑抑制TNF-α抗-TNF-α多肽相互作用。
除了表面胞質(zhì)團(tuán)共振和FRET方法，還使用熒光偏振測(cè)定定量結(jié)合。熒光標(biāo)記的分子的熒光偏振值取決于轉(zhuǎn)動(dòng)相關(guān)時(shí)間(rotational correlationtime)或者翻轉(zhuǎn)速度(tumbling rate)。復(fù)合物，諸如通過(guò)TNF-α與熒光標(biāo)記的抗-TNF-α多肽結(jié)合形成的復(fù)合物比未復(fù)合的、標(biāo)記多肽具有更高的偏振值。TNF-α抗-TNF-α多肽相互作用的候選抑制劑的包含導(dǎo)致相對(duì)于沒(méi)有候選抑制劑的混合物而言熒光偏振減小(如果候選抑制劑破壞或者抑制TNF-α與所述多肽的相互作用)。熒光偏振非常適于鑒定破壞TNF-α抗-TNF-α多肽復(fù)合物形成的小分子。相對(duì)于沒(méi)有候選調(diào)節(jié)劑的樣品中熒光偏振，含有候選調(diào)節(jié)劑的樣品中熒光偏振減小10％或更多表明該候選調(diào)節(jié)劑抑制TNF-α抗-TNF-α多肽相互作用。
監(jiān)視TNF-α抗-TNF-α多肽相互作用的另一備選方案使用生物傳感器測(cè)定法。在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述的ICS生物傳感器(Australian MembraneBiotechnology Research Institute；Cornell B，Braach-Maksvytis V，King L，Osman P，Raguse B，Wieczorek L，和Pace R.“A biosensor that usesion-channel switches”Nature 1997，387，580)。在該技術(shù)中，TNF-α和抗-TNF-α多肽的結(jié)合與懸浮的膜雙層中g(shù)ramacidin-推動(dòng)的離子通道的關(guān)閉偶聯(lián)并從而與生物傳感器的導(dǎo)納(admittance)(類似于impedence)的可測(cè)量的變化偶聯(lián)。該方法在導(dǎo)納變化的6個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)是線性的并且非常適于小分子組合文庫(kù)的大規(guī)模、高通量篩選。相對(duì)于沒(méi)有候選調(diào)節(jié)劑的樣品的導(dǎo)納，含有候選調(diào)節(jié)劑的樣品中導(dǎo)納的10％或更大的變化(增加或減小)表明候選調(diào)節(jié)劑抑制TNF-α和所述多肽的相互作用。重要的是注意到在檢測(cè)TNF-α和抗-TNF-α多肽的相互作用的測(cè)定中，可能相互作用的調(diào)節(jié)劑不必一定直接與在生理上與所述多肽相互作用的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域相互作用。還可能調(diào)節(jié)劑在從相互作用部位除去的位置相互作用并導(dǎo)致，例如，TNF-α中的構(gòu)象變化。以該方式作用的調(diào)節(jié)劑(抑制劑或激動(dòng)劑)仍然可以作為調(diào)節(jié)TNF-α與其受體結(jié)合的目標(biāo)試劑。
所描述的任一種結(jié)合測(cè)定法都可用于確定樣品(例如，組織樣品)中試劑的存在，該試劑結(jié)合TNF-α或者影響例如，SEQ ID NO3所代表的多肽與TNF-α的結(jié)合。為此，在樣品的存在或缺乏時(shí)，將TNF-α與所述多肽反應(yīng)，并且用對(duì)所使用的結(jié)合測(cè)定適宜的方法測(cè)量多肽結(jié)合。所述多肽的結(jié)合減小10％或者以上表明該樣品含有調(diào)節(jié)所述多肽與TNF-α結(jié)合的試劑。當(dāng)然，上面的一般化方法可容易地應(yīng)用于篩選候選調(diào)節(jié)劑，該候選調(diào)節(jié)劑改變本發(fā)明的任何抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能部分或者其同源序列的功能部分與TNF-α或者其片段之間的結(jié)合。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)文中公開(kāi)的方法鑒定的未知試劑。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)文中公開(kāi)的方法鑒定的未知試劑，該試劑用于治療、預(yù)防和/或減輕與炎癥過(guò)程有關(guān)的疾病的癥狀。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)文中公開(kāi)的方法鑒定的未知試劑的用途，用于治療、預(yù)防和/或減輕與炎癥過(guò)程有關(guān)的疾病的癥狀。
疾病的實(shí)例包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化。
根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞優(yōu)選選自細(xì)菌細(xì)胞如，例如，大腸桿菌、酵母細(xì)胞如，例如，釀酒酵母(S.cerevisiae)、畢赤巴斯德酵母(P.pastors)、昆蟲(chóng)細(xì)胞，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞可以是任一細(xì)胞，依照本發(fā)明編碼含有本發(fā)明的抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能部分或者其同源序列的功能部分的多肽的核酸序列可被導(dǎo)入該細(xì)胞，從而該多肽可以以如文中定義的天然水平或者高于天然水平表達(dá)。優(yōu)選地，在細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的多肽顯示出如文中定義的正常的或者接近正常的藥理學(xué)。最優(yōu)選地，在細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的多肽包括核苷酸序列，該核苷酸序列能夠編碼表1中給出的氨基酸序列的任一個(gè)或者能夠編碼與表1中給出的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，細(xì)胞選自COS7-細(xì)胞、CHO細(xì)胞、LM(TK-)細(xì)胞、NIH-3T3細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞、K-562細(xì)胞或者1321N1星形細(xì)胞瘤細(xì)胞(astrocytoma cell)以及其他可被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
通常，“治療有效量”、“治療有效劑量”和“有效量”指實(shí)現(xiàn)所希望的一個(gè)或多個(gè)結(jié)果(調(diào)節(jié)TNF-α結(jié)合；治療或防止炎癥)所需的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到潛能和因此“有效量”將隨著用于本發(fā)明中調(diào)節(jié)TNF-α結(jié)合的多種化合物而變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易評(píng)估該化合物的潛能。
如文中所用的，術(shù)語(yǔ)“化合物”指本發(fā)明的抗-TNF-α多肽、組合物、或者能夠編碼所述多肽的核酸，或者根據(jù)文中描述的篩選方法鑒定的試劑或者含有一種或多種衍生氨基酸的所述多肽。
“藥學(xué)上可接受的”指不是生物學(xué)上的材料或者不是不希望的材料，即，該材料可以與該化合物一起施用于個(gè)體而不導(dǎo)致任何不希望的生物學(xué)效應(yīng)或不與藥物組合物中所含有的其他組分的任一種以有害的方式相互作用。
如本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽用于治療或者預(yù)防受試者中的病癥并且包括施用藥物有效量的化合物或組合物。
本發(fā)明的抗-TNF多肽用于治療或預(yù)防受試者中與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化有關(guān)的病癥并且包括施用藥物有效量的結(jié)合TNF-α的化合物或組合物。
本文中公開(kāi)的抗-TNF-α多肽用于治療或者預(yù)防受試者中的病癥并且包括聯(lián)合施用藥物有效量的化合物與另一種化合物如，例如，阿司匹林。
本發(fā)明的抗-TNF多肽可用于治療或預(yù)防受試者中與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化有關(guān)的病癥并且包括聯(lián)合施用藥物有效量的化合物與另一種化合物如，例如，阿司匹林。
本發(fā)明不限于施用含有本發(fā)明的單一化合物的制劑。在本發(fā)明范圍內(nèi)提供聯(lián)合治療，其中對(duì)需要該治療的患者施用制劑，該制劑含有一種以上的本發(fā)明化合物。
TNF-α介導(dǎo)的病癥包括，但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化。
用于本發(fā)明的化合物可配制成藥物組合物并且以適于所選施用途徑的各種形式施用于哺乳動(dòng)物宿主，諸如人類患者或者家畜動(dòng)物，該施用途徑即經(jīng)口或腸胃外、通過(guò)鼻內(nèi)或者吸入、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、局部或皮下途徑。
利用遞送的基因治療方法也可以施用本發(fā)明的化合物。見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,399,346，該專利被完整并入作為參考。使用遞送的基因治療方法，用本發(fā)明化合物的基因轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞還可以另外被組織特異的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染以靶定特定器官、組織、移植物、腫瘤，或者細(xì)胞。
因此，本發(fā)明化合物可以與藥學(xué)上可接受的載體，諸如惰性稀釋劑或者可同化的可食用載體組合全身施用，如經(jīng)口施用。它們可以被封閉在硬或軟殼明膠膠囊中，可被壓縮成片劑，或者可以直接摻入患者膳食的食物中。對(duì)于經(jīng)口治療施用，活性化合物可以與一種或多種賦形劑組合并且以可攝取的片劑、口含片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等的形式使用。這種組合物和制劑將含有至少0.1％活性化合物。當(dāng)然，組合物和制劑的百分?jǐn)?shù)可以改變并且可便利地為給定單位劑型重量的約2到約60％。這種治療上有用的組合物中活性化合物的量為將得到有效劑量水平的量。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等等還可以含有下面的結(jié)合劑，如黃蓍樹(shù)膠、阿拉伯樹(shù)膠、玉米淀粉或者明膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等等；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；和甜味劑如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦或者增香劑如歐薄荷、冬青油，或者櫻桃香料。當(dāng)單位劑型是膠囊劑時(shí)，其除了上面類型的物質(zhì)，還可以含有液態(tài)載體，如植物油或者聚乙二醇?？梢源嬖诙喾N其他材料組為包衣或者另外改變固態(tài)單位劑型的物理形式。例如，用明膠、蠟、蟲(chóng)膠或者糖等等可以將片劑、丸劑或者膠囊劑包衣。糖漿劑或者酏劑可以含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖或者果糖、作為防腐劑的對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯、染料和香料如櫻桃或者桔子香料。當(dāng)然，用制備任一單位劑型中的任一材料都應(yīng)該是藥學(xué)上可接受的并且在用量?jī)?nèi)實(shí)質(zhì)上無(wú)毒。此外，活性化合物可被摻入緩釋制劑和裝置。
還可以通過(guò)灌注或注射，靜脈內(nèi)或者腹膜內(nèi)地施用活性化合物?？梢栽谒兄苽浠钚曰衔锘蛘咂潲}的溶液，其任選與無(wú)毒表面活性劑混合。還可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇、三醋精，和它們的混合物和油中制備分散劑。在保存和使用的通常條件下，這些制劑含有用于防止微生物生長(zhǎng)的防腐劑。
適于注射或灌注的藥學(xué)劑型可包括含有活性成分的無(wú)菌水性溶液或者分散劑或者無(wú)菌粉劑，其適于臨時(shí)制備無(wú)菌注射液或者灌注液或分散劑，任選封裝在脂質(zhì)體中。在所有情況中，最終劑型在生產(chǎn)和保存條件下必須是無(wú)菌的、液態(tài)和穩(wěn)定的。
液態(tài)載體或賦形劑可以是溶劑或者液態(tài)分散介質(zhì)，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇，等等)、植物油、無(wú)毒甘油酯，和它們的適宜的混合物。通過(guò)例如，形成脂質(zhì)體，對(duì)于分散劑的情況，通過(guò)保持所需要的顆粒大小或者通過(guò)使用表面活性劑可以保持適當(dāng)流動(dòng)性。通過(guò)多種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞，等等可以防止微生物的作用。在許多情況中，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖、緩沖劑或者氯化鈉。通過(guò)在組合物中使用延遲吸收的試劑，例如，單硬脂酸鋁和明膠可以延長(zhǎng)可注射組合物的吸收。
將適當(dāng)溶劑中的所需要的量的活性化合物與上面列舉的多種其他成分(如果需要)合并，然后過(guò)濾除菌可以制備無(wú)菌注射液。對(duì)于用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉劑的情況，優(yōu)選制備方法是真空干燥和冰凍干燥技術(shù)，這些技術(shù)產(chǎn)生前面無(wú)菌過(guò)濾溶液中存在的活性成分加上額外的所希望的成分的粉末。
對(duì)于局部施用，本化合物可以以純的形式應(yīng)用(即，當(dāng)它們是液體時(shí))。然而，通常希望將它們作為組合物或者制劑，聯(lián)合皮膚病學(xué)上可接受的載體施用于皮膚，這些載體可以是固體或者液體。
可用的固態(tài)載體包括細(xì)分的固體，如滑石、粘土、微晶纖維素、硅土、礬土，等等?？捎玫囊簯B(tài)載體包括水、羥烷基或二元醇或者水-乙醇/二元醇摻合物，其中本化合物可以任選通過(guò)無(wú)毒表面活性劑的幫助以有效水平溶解或者分散。可以加入佐劑諸如芳香劑或者抗微生物劑以優(yōu)化給定用途的性質(zhì)。所得液態(tài)組合物可以從吸收墊應(yīng)用，用于浸漬繃帶或者其他包扎用品，或者使用泵型或者氣溶膠噴霧器噴到受侵襲的區(qū)域。
增稠劑如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、改性纖維素或者改性礦物材料可以與液態(tài)載體一起使用以形成可涂抹的膏劑、凝膠劑、軟膏劑、皂劑，等等，以直接應(yīng)用于使用者的皮膚。
可用于將該化合物遞送到皮膚的有用的皮膚病學(xué)組合物的實(shí)例是本領(lǐng)域中公知的；例如，見(jiàn)Jacquet等人(美國(guó)專利號(hào)4,608,392)、Geria(美國(guó)專利號(hào)4,992,478)、Smith等人(美國(guó)專利號(hào)4,559,157)和Wortzman(美國(guó)專利號(hào)4,820,508)。
通過(guò)比較化合物的體外活性和動(dòng)物模型中的體內(nèi)活性可以確定該化合物的有用劑量。將小鼠，和其他動(dòng)物中的有效劑量外推到人的方法是本領(lǐng)域中公知的；例如，見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,938,949。
通常，液態(tài)組合物如洗劑中化合物的濃度將為約0.1-25wt-％，優(yōu)選約0.5-10wt-％。半固態(tài)或者固態(tài)組合物如凝膠劑或者粉劑中的濃度將為約0.1-5wt-％，優(yōu)選約0.5-2.5wt-％。
用于治療所需的化合物，或者其活性鹽或者衍生物的量將不僅隨著所選的具體鹽而且隨著施用途徑、被治療的病癥的性質(zhì)和患者的年齡和狀況而變，并且將最終由主治醫(yī)生或者臨床醫(yī)生的判斷決定。而且該化合物的劑量將根據(jù)靶細(xì)胞、腫瘤、組織、移植物，或者器官而變。
所希望的劑量可便利地作為單劑給出或者作為分開(kāi)的劑量給出，該分開(kāi)的劑量以適宜的間隔施用，例如，作為每天2、3、4或多個(gè)亞劑量。該亞劑量本身還可以被分成例如，許多離散的松散隔開(kāi)的施用；諸如吹入器的多次吸入或者通過(guò)應(yīng)用于眼睛的多次滴劑。
施用方案可以包括長(zhǎng)期的、每日治療?！伴L(zhǎng)期”指至少兩周，優(yōu)選數(shù)周、數(shù)月或者數(shù)年持續(xù)時(shí)間。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅使用此處教導(dǎo)中的常規(guī)實(shí)驗(yàn)法就可以確定該劑量范圍中必要的修飾。見(jiàn)Remington′s PharmaceuticalSciences(Martin，E.W.，第四版)，Mack Publishing Co.，Easton，PA。如果發(fā)生任何并發(fā)癥，個(gè)別醫(yī)生還可以調(diào)節(jié)劑量。
本發(fā)明提供了試劑，該試劑是TNF-α/TNF-α-受體相互作用的調(diào)節(jié)劑。
候選試劑可以是合成試劑，或者試劑的混合物，或者可以是天然產(chǎn)物(例如，植物提取物或者培養(yǎng)上清液)。根據(jù)本發(fā)明的候選試劑包括可以合成的小分子、天然提取物、肽、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)等。
可以從合成的或天然試劑的大文庫(kù)中篩選候選調(diào)節(jié)劑。當(dāng)前利用多種方法隨機(jī)和定向合成糖、肽、和基于核酸的試劑?？梢酝ㄟ^(guò)商業(yè)途徑從許多公司得到合成試劑文庫(kù)，這些公司包括Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，NJ)、Brandon Associates(Merrimack，NH)、和Microsource(New Milford，CT)。從Aldrich(Milwaukee，WI)可以得到稀有化學(xué)物文庫(kù)?？梢缘玫讲⑶铱梢灾苽浣M合文庫(kù)。備選地，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然試劑的文庫(kù)可以從例如，Pan Laboratories(Bothell，WA)或MycoSearch(NC)得到，或者通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的方法容易地制備。此外，通過(guò)常規(guī)化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法容易修飾天然的和合成產(chǎn)生的文庫(kù)和試劑。
在多種化學(xué)品類別中可以發(fā)現(xiàn)有用的試劑。有用的試劑可以是有機(jī)試劑，或者小分子試劑。小分子試劑的分子量大于50但是小于約2,500道爾頓，優(yōu)選小于約750，更優(yōu)選小于約350道爾頓。代表性類別包括雜環(huán)類、肽、糖、類固醇，等等?？梢孕揎椷@些試劑以增強(qiáng)效能、穩(wěn)定性、藥物相容性，等等。試劑的結(jié)構(gòu)鑒定可用于鑒定、產(chǎn)生或者篩選額外試劑。例如，當(dāng)鑒定了肽試劑時(shí)，可將它們以各種方法修飾以增強(qiáng)它們的穩(wěn)定性，諸如使用非天然氨基酸，如D-氨基酸，尤其D-丙氨酸，通過(guò)功能化氨基或者羧基末端，例如，對(duì)于氨基，酰化或者烷基化，對(duì)于羧基，酯化或者酰胺化，等等。
對(duì)于初步篩選，根據(jù)本發(fā)明的候選試劑的有用濃度為約10mM到約100μM或以上(即，1mM、10mM、100mM、1M等)。初步篩選濃度將用作上限，以及9種額外的濃度，其中通過(guò)將初步篩選濃度以半對(duì)數(shù)間隔(例如，對(duì)于9種額外的濃度)減小用于二次篩選或者用于產(chǎn)生濃度曲線來(lái)確定額外的濃度。
高通量篩選試劑盒根據(jù)本發(fā)明的高通量篩選試劑盒含有實(shí)施試劑的檢測(cè)所有必要的方法和介質(zhì)，該試劑在優(yōu)選1μM到1mM濃度的多肽存在下通過(guò)與TNF-α相互作用調(diào)節(jié)TNF-α/TNF-α受體相互作用。
該試劑盒含有下面的本發(fā)明的重組細(xì)胞，其含有并表達(dá)編碼TNF-α的核苷酸序列，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員中公知的方法，特別是WO 00/02045中描述的方法，該重組細(xì)胞根據(jù)試劑盒生長(zhǎng)在固體支持體，諸如微量滴定板，更優(yōu)選地96孔微量滴定板上，備選地，本領(lǐng)域技術(shù)人員以純化的形式提供TNF-α，其被固定在例如96孔微量滴定板上。備選地，在試劑盒中提供TNF-α，其被預(yù)先固定在例如，96孔微量滴定板上。TNF-α可以是完整TNF-α或者其片段。
濃度為約1μM到1mM或以上的根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑被加到限定的孔中，孔中存在適當(dāng)濃度的抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能序列或者其同源序列的功能部分，所述多肽的所述濃度優(yōu)選為1μM到1mM。試劑盒可以含有一種或多種抗-TNF-α多肽(例如，SEQ ID NOs1到15之一代表的一種或多種多肽或其他抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能序列或者其同源序列的功能部分)。
根據(jù)文中已經(jīng)公開(kāi)的方法實(shí)施結(jié)合測(cè)定并將結(jié)果與基線水平比較，基線水平為例如，不存在所加入的調(diào)節(jié)劑時(shí)TNF-α結(jié)合抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能部分或者其同源序列的功能部分的水平。與不存在調(diào)節(jié)劑時(shí)活性水平相比，TNF-α-多肽結(jié)合(例如)增加或減少至少2倍、優(yōu)選5倍，更優(yōu)選10倍，最優(yōu)選100倍或以上的孔被選擇用于進(jìn)一步分析。
根據(jù)本發(fā)明使用的其他試劑盒本發(fā)明提供了用于篩選TNF-α/TNF-α受體結(jié)合的調(diào)節(jié)劑的試劑盒，以及用于診斷特征為T(mén)NF-α機(jī)能障礙的疾病的試劑盒。本發(fā)明還提供了用于篩選疾病的調(diào)節(jié)劑的試劑盒以及它們的診斷試劑盒，所述疾病的特征是與TNF-α有關(guān)的一種或多種過(guò)程。根據(jù)本發(fā)明使用的試劑盒可包括分離的TNF-α。備選地，或者額外地，試劑盒可以含有被轉(zhuǎn)化而表達(dá)TNF-α的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以含有編碼TNF-α的多核苷酸。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以含有用于擴(kuò)增TNF-α的特異引物。根據(jù)本發(fā)明使用的試劑盒可以含有分離的TNF-α多肽、其同源物，或者其功能部分。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以含有被轉(zhuǎn)化而表達(dá)所述多肽的細(xì)胞。試劑盒可以含有一種以上的多肽。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以含有編碼TNF-α的多核苷酸。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以含有用于擴(kuò)增大分子如，例如，TNF-α的特異引物。根據(jù)本發(fā)明的所有試劑盒將含有所陳述的物品或者物品的組合和包裝材料。試劑盒將還包括使用說(shuō)明書(shū)。
實(shí)施例通過(guò)下面的非限制性實(shí)施例闡明本發(fā)明。
實(shí)施例1針對(duì)人腫瘤壞死因子α的駱駝科抗體的實(shí)施例1)免疫和文庫(kù)構(gòu)建用人TNF-α免疫美洲駝(Llama glama)。為了免疫，用適宜的動(dòng)物友好佐劑(Specoll，CEDI Diagnostics B.V.)將細(xì)胞因子配制成乳劑。通過(guò)頸部肌內(nèi)雙地點(diǎn)注射使用該抗原混合物。動(dòng)物以每周的間隔接受6次乳劑注射，該乳劑含有100μg TNF-α。在免疫期間的不同時(shí)間點(diǎn)，從動(dòng)物收集10ml血樣并制備血清。使用血清樣品在ELISA實(shí)驗(yàn)中用TNF驗(yàn)證抗原特異的體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)(數(shù)據(jù)未顯示)。最后免疫后5天，收集150ml血樣。從該樣品分級(jí)分離(Lauwereys等人，1998)常規(guī)抗體和重鏈抗體(HcAbs)并用于ELISA中，ELISA揭示HcAbs負(fù)責(zé)抗原特異的體液免疫應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。使用菲可帕克梯度(Amersham Biosciences)從150ml血樣分離作為美洲駝重鏈免疫球蛋白(HcAbs)的遺傳來(lái)源的外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)，得到5×108個(gè)PBLs。預(yù)期抗體的最大多樣性等于采樣的B-淋巴細(xì)胞的數(shù)目，該數(shù)目為PBLs數(shù)目的約10％(5×107)。美洲駝中重鏈抗體的級(jí)分高達(dá)B淋巴細(xì)胞數(shù)目的20％。因此，150ml血樣中HcAbs的最大多樣性被計(jì)算為107種不同的分子。使用酸性硫氰酸胍提取(Chomczynski和Sacchi，1987)從這些細(xì)胞分離總RNA(約400μg)。
利用以前描述的(de Haard等人，1999)用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(GibcoBRL)和寡聚-dT-引物或者六核苷酸隨機(jī)引物(Amersham Biosciences)從100μg總RNA制備cDNA。用苯酚/氯仿萃取聯(lián)合乙醇沉淀純化cDNA并將其隨后用作模板以特異擴(kuò)增VHH所有組成成分。
使用寡聚dT引發(fā)的cDNA作為模板用單簡(jiǎn)并框架1(FR1)引物ABL013(5′-GAGGTBCARCTGCAGGASTCYGG-3′)導(dǎo)入PstI限制位點(diǎn)(粗體)，聯(lián)合EP01205100.9中描述的寡聚dT引物擴(kuò)增VHH所有組成成分。該擴(kuò)增產(chǎn)生了1650bp和1300bp的兩個(gè)片段，后一片段是從CH1-缺失的HcAb基因得到的產(chǎn)物。較小的PCR產(chǎn)物被凝膠純化并隨后用PstI和BstEII消化。BstEII位點(diǎn)通常在重鏈來(lái)源的VHH編碼DNA片段的FR4中存在。
備選地，用依賴鉸鏈的方法使用兩種IgG特異的寡核苷酸引物擴(kuò)增VHH-所有組成成分。在一次PCR反應(yīng)中，公知對(duì)HcAbs特異的短(5′-AACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′)或長(zhǎng)(5′-AACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT-3′)鉸鏈引物與FR1-引物ABL013(見(jiàn)上面)聯(lián)合。PstI和NotI(粗體下劃線)限制位點(diǎn)分別被導(dǎo)入FR1和鉸鏈引物內(nèi)以允許克隆。隨后，將DNA片段連接到用PstI-BstEII或PstI-NotI消化的噬菌粒載體pAX004中，該載體與pHEN1(Hoogenboom等人，1991)相同但是編碼分別用于純化和檢測(cè)的羧基末端(His)6-和c-myc-標(biāo)簽。連接混合物在Microcon濾器(YM-50，Millipore)脫鹽并電穿孔到大腸桿菌TG1細(xì)胞以得到含有1.8×107個(gè)克隆的文庫(kù)。被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在裝有含有100μg/ml氨芐西林和2％葡萄糖的LB的一個(gè)20×20cm盤(pán)上37℃下過(guò)夜生長(zhǎng)。用2×TY培養(yǎng)基從盤(pán)子刮除菌落并在20％甘油中-80℃保存。
作為質(zhì)量對(duì)照，通過(guò)PCR使用基于載體的引物的組合對(duì)每種文庫(kù)的24個(gè)克隆驗(yàn)證含有插入片段的克隆的百分?jǐn)?shù)。該分析揭示95％的克隆含有編碼VHH的插入片段。通過(guò)這24個(gè)克隆的擴(kuò)增的VHH片段的HinfI指紋分析檢查變異性，從而表明所有克隆實(shí)際上是不同的(數(shù)據(jù)未顯示)。
2)選擇拮抗的抗-TNF VHH’s從兩種文庫(kù)制備噬菌體。為了挽救多克隆噬菌體所有組成成分，將文庫(kù)在37℃下含有100μg/ml氨芐西林和2％葡萄糖的2×TY中生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期(OD600＝0.5)，并隨后用M13K07輔助噬菌體在37℃超感染30分鐘。將被感染的細(xì)胞以4000rpm離心5分鐘并重懸在含有100μg/ml氨芐西林和25μg/ml卡那霉素的2×TY中。通過(guò)在37℃和250rpm過(guò)夜生長(zhǎng)增殖噬菌體。將過(guò)夜培養(yǎng)物以4500rpm離心15分鐘并用1/5體積[20％聚乙二醇6000，1.5M NaCl]溶液在冰上孵育30分鐘沉淀噬菌體。以4000×g在4℃離心15分鐘沉淀噬菌體。噬菌體重懸在PBS中后，通過(guò)以在微量離心管中以最大速度(15000×g)離心1分鐘沉淀細(xì)胞碎片。將含有噬菌體顆粒的上清液轉(zhuǎn)移到新管中并如上描述的再次沉淀噬菌體。噬菌體溶于PBS中并且如上面提到的從剩余的細(xì)胞碎片分離。通過(guò)感染對(duì)數(shù)TG1細(xì)胞后在選擇培養(yǎng)基上涂平板確定噬菌體的效價(jià)。
用體外生物素化TNF-α選擇文庫(kù)。如Magni等人(Anal Biochem2001，298，181-188)所描述的實(shí)施生物素化。通過(guò)SDS-PAGE分析和用Extravidin-堿性磷酸酶綴合物(Sigma)檢測(cè)評(píng)估TNF中生物素的摻入。通過(guò)修飾蛋白結(jié)合固相包被的重組p75受體的能力來(lái)評(píng)價(jià)該修飾蛋白的功能性。
通過(guò)在鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板(用100μl 10μg/ml鏈霉抗生物素蛋白，4℃包被16小時(shí))上捕獲生物素化TNF-α(室溫下2小時(shí)，每孔10到400ng)選擇VHH。通過(guò)用過(guò)量受體一細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者表達(dá)該受體的細(xì)胞洗脫得到拮抗的VHH。噬菌體與被捕獲的細(xì)胞因子孵育2小時(shí)后，洗除非特異噬菌體，而將展示拮抗VHH的特定噬菌體用受體(CD120b或者p75的胞外結(jié)構(gòu)域，10μM)或者用展示受體的細(xì)胞(＞105個(gè)KYM細(xì)胞/孔)洗脫。高富集，即用受體洗脫的噬菌體數(shù)目與用血清清蛋白(50μg/孔)洗脫的噬菌體數(shù)目的比例大于20表明成功地選擇了TNF-α特異克隆。備選地，不是用受體洗脫，而是應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法，其中低pH導(dǎo)致VHH和/或抗原的變性(0.1M甘氨酸緩沖液，pH2.5)。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞用洗脫并被中和的噬菌體感染并鋪在選擇培養(yǎng)基上。挑選單個(gè)克隆并在微量滴定板上生長(zhǎng)以在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生VHH。用捕獲在Extravidin包被的平板上的TNF-α實(shí)施ELISA篩選揭示約50％陽(yáng)性克隆。HinfI-指紋分析表明選擇了13個(gè)不同的克隆，這些克隆以50ml規(guī)模被生長(zhǎng)和誘導(dǎo)。所述克隆的序列在表1中顯示。
更詳細(xì)地表征了具有不同序列(圖1)的5個(gè)克隆，它們的代號(hào)為VHH#1A、#2B、#3E、#3G、#7B和#12B。VHH#3E、#3G、和#7B是單結(jié)構(gòu)域抗體片段，它們?cè)贔R2中的45位攜帶典型的親水殘基(精氨酸)并且在47位具有苯丙氨酸向色氨酸的置換，從而在溶解性方面賦予了有利特征。VHH#1A含有疏水FR2殘基，其通常在人來(lái)源或者其他物種的雙鏈抗體中發(fā)現(xiàn)，但是通過(guò)103位上的帶電精氨酸殘基彌補(bǔ)了親水性的損失，該殘基置換了來(lái)自雙鏈抗體的VH中存在的保守色氨酸殘基(PCT/EP02/07804)。本發(fā)明中描述的人源化駱駝科單結(jié)構(gòu)域抗體的一個(gè)新的類別由VHH#2B和VHH#12B代表，其含有FR2中的疏水殘基以及103位的疏水殘基色氨酸。通過(guò)以50ml規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)更大量的抗體片段并通過(guò)IMAC使用TALON樹(shù)脂(Clontech)純化。對(duì)PBS透析除去洗脫液咪唑后通過(guò)OD280確定VHH的量；從每個(gè)克隆得到約300μg VHH。該材料用于確定ELISA中(生物素化)TNF檢測(cè)的靈敏性。為此，將鏈霉抗生物素蛋白(10μg/ml)包被的微量滴定板用于捕獲生物素化TNF(1μg/ml)，將VHH在0.2％酪蛋白/PBS中稀釋并在室溫孵育2小時(shí)。用抗-MYC mAB9E10(0.5μg/ml)和抗小鼠AP綴合物(1000倍稀釋，Sigma)檢測(cè)結(jié)合的VHH。結(jié)果在圖2中顯示。
3)用KYM細(xì)胞系在細(xì)胞毒性測(cè)定中確定拮抗作用通過(guò)Vandenabeele和同事(Vandenabeele，P.，Declercq，W.，Vercammen，D.，Van de Craen，M.，Grooten，J.，Loetscher，H.，Brockhaus，M.，Lesslauer，W.，F(xiàn)iers，W.(1992)Functional characterization of the human tumor necrosis factorreceptor p75 in a trasfected rat/moust T cell hybridoma.J.Exp.Med.176，1015-1024)描述的比色MTT測(cè)定法確定TNF-α誘導(dǎo)的白細(xì)胞郁積/細(xì)胞毒性。MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)是一種灰黃色底物，其被活細(xì)胞切割而產(chǎn)生暗藍(lán)色甲產(chǎn)物。該過(guò)程需要活性線粒體，甚至剛死亡的細(xì)胞也不能切割大量MTT。將KYM細(xì)胞(Sekiguchi M，ShirokoY，Suzuki T，Imada，Miyahara M，F(xiàn)ujii G.(1985)，Characterization of a humanrhabdomyosarcoma cell strain in tissue culture.Biomed.Pharmacother.39，372-380.)接種于96孔微量滴定板中并在TNF-α(0.216ng/ml或者約5pM三聚體)的存在或不存在下培養(yǎng)。除了TNF，培養(yǎng)期間還包括不同量的抗體(VHH或者英夫利昔單抗)。對(duì)于該測(cè)定，將MTT加入培養(yǎng)基，其終濃度為500μg/ml，將平板在37℃孵育以實(shí)現(xiàn)線粒體酶對(duì)MTT的切割。加入酸性異丙醇(40nM HCl溶于異丙醇中)或者DMSO溶解所形成的甲產(chǎn)物，該產(chǎn)物在孔的底部呈現(xiàn)黑色的、似絨毛的晶體。在570nm處測(cè)量吸收。
MTT測(cè)定(圖3)表明VHH#1A(其在103位為精氨酸結(jié)合FR2中類似人的疏水殘基)具有中等拮抗效果(IC50～100nM)。在FR2中具有特征型親水殘基的VHH#7B盡管在ELISA中靈敏檢測(cè)細(xì)胞因子(曲線為顯示)但是不能防止TNF-α與其配體的結(jié)合。相反，具有親水FR2標(biāo)志性殘基的VHH#3E和#3G是非常強(qiáng)的拮抗性VHH’s(IC50為20nM)。VHH#3E和#3G具有高度同源性并且在克隆上相關(guān)(Harmsen等人，Mol.Immunol.37，579-590)，但是VHH#3E比VHH#3G更強(qiáng)(圖2)，這可能是由于VHH#3E具有更高的親合力。(嵌合的)單克隆抗體英夫利昔單抗非常有效(IC50為80pM)，但是其衍生的Fab片段喪失了該效能的大部分(IC50為3nM，為完整mAB的30分之一)。這清楚地表明抗體和細(xì)胞因子之間相互作用的親合力效果具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的mAB通過(guò)協(xié)作結(jié)合更有效地與三聚體TNF分子相互作用。VHH片段是嚴(yán)格的單價(jià)，因此推測(cè)通過(guò)遺傳融合VHH基因增加親合力可以增加它們的拮抗效能(見(jiàn)實(shí)施例4)。
這些實(shí)驗(yàn)表明類似人的VHH的一個(gè)新的類別具有真實(shí)的結(jié)合和功能特征，從而使得它們可用于治療目的。
實(shí)施例2通過(guò)定點(diǎn)誘變?nèi)嗽椿疺HH#12B和VHH#3E1)VHH#3E/VHH#12B和人種系重鏈V-區(qū)DP-47之間的同源性VHH#12B和人VH3種系序列(DP-47)的比對(duì)揭示了高度同源性●FR1中1、5、28和30位上4個(gè)氨基酸的改變●FR3中74、76、83、84和93位上5個(gè)氨基酸的改變●FR4中108位上1個(gè)氨基酸改變?nèi)缭谙旅娴男蛄斜葘?duì)中代表
DP-47 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYVHH#12B QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFEFENHWMYWVRQAPGKGLEWVSTVNTNGLITRYDP-47ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK -------------- -----------VHH#12BADSVKGRFTISRDNAKYTLYLQMNSLKSEDTAVYYCTKVLPPYSDDSRTNADWGQGTQVTVSS因此，與人種系基因DP-47具有高度同源性的TNF-α細(xì)胞因子的特異抑制劑是進(jìn)一步人源化和評(píng)價(jià)ELISA中誘變對(duì)抑制能力的影響的理想候選者。
VHH#3E和人VH3種系(DP-47)的比對(duì)揭示與DP47中疏水殘基相比VHH#3E的FR2中存在親水氨基酸殘基。
DP-47 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMS-----WVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYVHH#3E QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDHSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGNTYYDP-47ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK --------------- -----------VHH#3EADSVKGRFAISRDIAKNTVDLTMNNLEPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSS通過(guò)人VH中存在的疏水殘基評(píng)價(jià)取代親水殘基的效果是重要的，因?yàn)閏amelid VHH序列的大部分含有親水殘基。
2)VHH#12B的誘變通過(guò)Chen和Ruffner描述并且被Stratagene(Quickchange定點(diǎn)誘變)商業(yè)化的基于非-PCR的定點(diǎn)誘變方法突變VHH#12B。質(zhì)粒DNA被用作模板，并使用2種誘變引物導(dǎo)入所希望的突變。這兩種引物每一種都與模板質(zhì)粒DNA的相反鏈互補(bǔ)。在使用PfuDNA聚合酶的聚合酶反應(yīng)中，在使用有限數(shù)目的循環(huán)的循環(huán)程序期間，每條鏈從引物序列延伸。這導(dǎo)致野生型和突變鏈的混合物。用DpnI消化可以選擇突變的體外合成的DNA鏈，因?yàn)閮H模板鏈對(duì)于消化是敏感的。將DNA沉淀并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中并通過(guò)序列分析分析所希望的突變。所產(chǎn)生的突變VHH’s和誘變引物在表2中列出。從突變克隆制備質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化到WK6電感受態(tài)細(xì)胞。單個(gè)菌落被用于在含有2％葡萄糖和100μg/ml氨芐西林的LB中過(guò)夜培養(yǎng)。該過(guò)夜培養(yǎng)物在含有100μg/ml氨芐西林的300ml TB培養(yǎng)基中稀釋100倍，并在37℃孵育直到OD600nm＝2，當(dāng)加入1mM IPTG和5mM MgSO4(終濃度)時(shí)并將培養(yǎng)物在37℃再孵育3小時(shí)。
將培養(yǎng)物在4℃以4,500rpm離心20分鐘。沉淀過(guò)夜冰凍或者-20℃1小時(shí)。接著，在室溫下解凍沉淀40分鐘，將其重懸在20ml PBS/1mMEDTA/1M NaCl中并在冰上搖動(dòng)1小時(shí)。通過(guò)在4℃以4,500rpm離心20分鐘分離周質(zhì)級(jí)分。將含有VHH的上清液裝入TALON(ClonTech)并純化到同質(zhì)。用計(jì)算的消光系數(shù)確定VHH的產(chǎn)率。所表達(dá)的所有突變VHH’s與野生型相當(dāng)。在體外受體結(jié)合測(cè)定中分析突變體的抑制能力。
用PBS中的2μg/ml依那西普(Wyeth)在4℃過(guò)夜包被微量滴定板。將該板用PBS-吐溫洗滌5次并用含有1％酪蛋白的PBS在室溫封閉1小時(shí)。用PBS-吐溫洗滌微量滴定板5次。將生物素化人TNF-α(80μg/ml)與突變的或者野生型VHH#12B的稀釋系列在室溫下預(yù)孵育1小時(shí)并將混合物在室溫下在微量滴定板的孔中孵育1小時(shí)。用PBS-吐溫洗滌板5次。用Extravidin-AP(1/1,000稀釋)和對(duì)硝基苯酚磷酸(pNPP)檢測(cè)結(jié)合的人TNF-α。405nm 30分鐘后測(cè)量信號(hào)。結(jié)果在圖4和5中給出。IC50從66nM(野生型)到200nM(突變的Q1E+Q5L+A74S+Y76N+K83R+P84A)增加了3倍。位置T93A突變導(dǎo)致抑制喪失(數(shù)據(jù)未顯示)。仍然需要人源化的位置是E28、E30和Q108。然而，E28和E30是H1正則結(jié)構(gòu)的部分從而是根據(jù)Chothia編號(hào)系統(tǒng)的CDR1的部分。
突變VHHs的氨基酸序列在表4中SEQ ID NOs17到19中給出。
3)VHH#3E的誘變使用上面描述的基于非PCR的定點(diǎn)誘變方法突變VHH#3E。所得突變的VHH’s和誘變引物在表3中列出。
所有突變VHH的表達(dá)與野生型相當(dāng)。在ELISA中分析純化的突變VHH的結(jié)合并且在與上面描述的方法相同的受體結(jié)合測(cè)定中分析VHH的抑制能力。
ELISA的結(jié)果在圖6中顯示，受體結(jié)合測(cè)定的結(jié)果在圖7中顯示。
突變VHHs的氨基酸序列在表4中SEQ ID NOs 21到24給出。
實(shí)施例3針對(duì)小鼠TNF-α的拮抗VHH的分離1)選擇抗小鼠TNF-αVHH為了在IBD或局限性回腸炎小鼠模型中實(shí)施效能研究，選擇小鼠TNF特異的VHH。因此，如實(shí)施例1中描述的用小鼠TNF-α免疫美洲駝。從最后免疫后第4和10天采樣的PBL以及第四天后從淋巴結(jié)的活組織檢查提取RNA。將總RNA轉(zhuǎn)化成隨機(jī)引發(fā)的或者寡聚-dT引發(fā)的cDNA并用作VHH編碼基因節(jié)段的擴(kuò)增模板，該擴(kuò)增使用Ig來(lái)源的引物或者寡聚-dT引物和單一Ig引物的混合物(見(jiàn)實(shí)施例1)。使用Ig引物從第一個(gè)PBL’s產(chǎn)生了含有8.5×107個(gè)克隆的文庫(kù)的文庫(kù)，從第二個(gè)PBL樣品產(chǎn)生了7×106個(gè)克隆的文庫(kù)，從淋巴結(jié)產(chǎn)生了5.8×108個(gè)克隆的文庫(kù)。使用寡聚-dT引物和Ig引物的混合物從第一個(gè)PBL樣品得到了含有1.2×108個(gè)克隆的文庫(kù)，從第二個(gè)PBL樣品得到了5.7×107個(gè)克隆的文庫(kù)，并且淋巴結(jié)來(lái)源的文庫(kù)含有2×108個(gè)克隆。根據(jù)所用的引物的組合合并文庫(kù)并將所得兩個(gè)文庫(kù)培養(yǎng)以增殖噬菌體，如前面描述的。通過(guò)被捕獲在包被的鏈霉抗生物素蛋白上的生物素化小鼠TNF-α實(shí)施選擇，結(jié)合的噬菌體通過(guò)與人受體p75競(jìng)爭(zhēng)而被洗脫，公知p75與小鼠TNF-α交叉反應(yīng)。從用Ig衍生的引物擴(kuò)增得到的文庫(kù)選擇兩種不同的小鼠TNF-α特異VHH(VHH#m3F和VHH#m9E)，而從通過(guò)PCR用寡聚-dT引物和Ig-引物構(gòu)建的文庫(kù)得到兩種密切相關(guān)的VHH(圖8)。
2)用L929細(xì)胞系在細(xì)胞毒性測(cè)定中確定拮抗功效如實(shí)施例1中描述的應(yīng)用相同類型的測(cè)定，但是使用鼠細(xì)胞系L929。證明VHH#m3F和VHH#m4B(圖9)比另外兩種VHH更有效10倍。
實(shí)施例4通過(guò)使用多價(jià)駱駝科抗體增加親合力而增強(qiáng)拮抗功效1)針對(duì)人和小鼠TNF-α的二價(jià)、三價(jià)和四價(jià)VHH的拮抗功效設(shè)計(jì)了大腸桿菌生產(chǎn)載體pAX11(圖10)，該載體允許兩步克隆二價(jià)或雙特異的VHH。首先用PstI和BstEII克隆羧基末端VHH，而在第二步中，通過(guò)SfiI和NotI插入另一VHH，SfiI和NotI不在第一個(gè)基因片段內(nèi)切割。該方法避免了通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)生新的位點(diǎn)從而避免了產(chǎn)生PCR錯(cuò)誤的危險(xiǎn)。
使用該載體產(chǎn)生了拮抗性抗-人TNF-αVHH#3E的二價(jià)衍生物。編碼該二價(jià)VHH的質(zhì)粒載體被用于產(chǎn)生三聚體和四聚體衍生物，這通過(guò)用BstEII部分消化該質(zhì)粒完成，該消化在兩個(gè)VHH基因片段中都發(fā)生。將線性化載體從凝膠純化，隨后去磷酸化并用作克隆約350bp的BstEII片段的受體，BstEII片段通過(guò)完全消化相同質(zhì)粒得到。僅將BstEII片段連接后加入載體增強(qiáng)了多聚體VHH編碼基因片段的插入。在大腸桿菌TG1中轉(zhuǎn)化后，通過(guò)PCR，用M13Rev和M13Fwd引物篩選所得克?。灰?yàn)锽stEII是不對(duì)成切割酶(5nt突出端)，所以僅得到正確方向的插入片段，這通過(guò)僅用PstI消化(350bp)或者用EcoRI和HindIII雙消化(對(duì)于二價(jià)(BIV 3E，SEQ ID NO73)得到1000bp，對(duì)于三價(jià)(TRI 3E，SEQ ID NO74)得到1350bp，對(duì)于四價(jià)(TETRA 3E，SEQ ID NO75)得到1700bp)，數(shù)據(jù)未顯示)質(zhì)粒來(lái)證實(shí)。序列在表7中列出。
以50ml規(guī)模生長(zhǎng)和誘導(dǎo)克隆，制備周質(zhì)級(jí)分并用于使用TALON樹(shù)脂實(shí)施的IMAC純化。用考馬斯染色的PAGE分析純化產(chǎn)物揭示了完整多價(jià)VHH的良好的生產(chǎn)水平(每升細(xì)胞培養(yǎng)物2到10mg)(見(jiàn)圖11)。通過(guò)Superdex 75HR柱上凝膠過(guò)濾確定IMAC純化的VHH的分子外觀并且如所預(yù)期的，具有更高親合力的分子更早地從柱子出來(lái)(見(jiàn)圖12)。
用基于細(xì)胞的測(cè)定法使用KYM細(xì)胞分析拮抗功效。細(xì)胞被接種于微量滴定板中并在TNF-α(1.29ng/ml或者約25pM三聚體)存在或不存在時(shí)培養(yǎng)。該測(cè)定(圖13)揭示用于該研究中的單價(jià)分子具有最弱的拮抗特征。通過(guò)它們的IC50值所反映的來(lái)自嵌合抗體英夫利昔單抗的Fab的IC50為2nM，對(duì)于VHH#3E，IC50為12nM(也見(jiàn)圖3)。所用分子的親合力對(duì)拮抗功效具有顯著的影響，這通過(guò)使用二價(jià)IgG分子英夫利昔單抗觀察到，該分子比Fab的有效性強(qiáng)40倍(IC5050pM)。TNF-α是三聚體分子，其與二聚體受體相互作用并且因此可以預(yù)期IgG的親合力允許與該細(xì)胞因子上的兩個(gè)表位相互結(jié)合并形成在前描述的(Santora等人，Anal.Biochem.299，119-129)大復(fù)合物。令人驚奇地，VHH從單體向二聚體的親合力的增加比用英夫利昔單抗所觀察到的具有大得多的顯著效果，因?yàn)槎垠w的IC50(30pM)比單體的低400倍。增加親合力甚至更導(dǎo)致更好的拮抗行為三聚體VHH的IC50為20pM，四價(jià)形式為6pM。VHH的所有更高親合力形式都比英夫利昔單抗更有效，而四價(jià)形式比依那西普更強(qiáng)，其中依那西普由受體p75的胞外結(jié)構(gòu)域與IgG的Fc融合組成，因此其是二價(jià)結(jié)合模式。
用針對(duì)小鼠TNF產(chǎn)生的VHH觀察到親合力對(duì)拮抗行為的同樣出乎意料的影響(圖14)。用MTT作為底物和小鼠TNF-α(65pg/ml或者1.3pM)實(shí)施相同類型的細(xì)胞毒性測(cè)定，但是使用鼠細(xì)胞系L929，該細(xì)胞系表達(dá)小鼠特異受體。鑒定了三種不同的拮抗(單價(jià))VHH，它們的代碼為9E和3F，其中前兩種的IC50為25nM，后一種的IC50為2nM(也見(jiàn)實(shí)施例3)。3F轉(zhuǎn)化成二價(jià)形式(BIV#m3F，SEQ ID NO76)導(dǎo)致IC50增加1000倍(2pM)，從而再一次表明該抗體的增加的親合力導(dǎo)致拮抗特征的出乎意料的改善。
2)與VHH-Fc融合的比較VHH#3E針對(duì)人TNF，通過(guò)PstI和BstEII將VHH#3E克隆到來(lái)自pCDNA3的改良載體，從而產(chǎn)生與人IgG1的CH1缺失的Fc部分的遺傳融合。通過(guò)測(cè)序證實(shí)后，將該質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到骨髓瘤細(xì)胞系NS0中。培養(yǎng)所得細(xì)胞系并且VHH-Fc融合體被分泌到培養(yǎng)上清液中。用抗-人FcVHH樹(shù)脂純化產(chǎn)物并在考馬斯染色的凝膠上分析(圖15)。在DTT存在下，觀察到融合體為45kDa蛋白，不存在DTT時(shí)，可以觀察到二價(jià)分子的分子量為90kDa。該二價(jià)產(chǎn)物由兩條鏈通過(guò)兩個(gè)二硫鍵連接產(chǎn)生，這兩個(gè)二硫鍵來(lái)自位于鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基。在生物測(cè)定中使用人細(xì)胞系KYM試驗(yàn)了VHH融合體并且結(jié)果比二價(jià)VHH功效少5倍，盡管這兩種分子具有相同的親合力并且它們都來(lái)自VHH#3E(圖16)?？赡苁谴篌w積的Fc尾的空間位阻導(dǎo)致該差異。
實(shí)施例5計(jì)算本發(fā)明的抗-靶標(biāo)-單結(jié)構(gòu)域抗體間的同源性使用Bioedit Sequence Alignment Editor計(jì)算本發(fā)明的抗-靶標(biāo)單結(jié)構(gòu)域抗體之間的氨基酸序列同源性程度。通過(guò)ClustalW.(Thompson，J.D.，Higgins，D.G和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W通過(guò)序列加權(quán)、位置特異的缺口罰分和權(quán)重矩陣選擇提高漸進(jìn)性多序列比對(duì)的靈敏度.NucleicAcids Research，1994年6月提交)比對(duì)序列，計(jì)算所有序列之間的相同殘基的比例。表8指出了本發(fā)明的抗-血清清蛋白VHHs之間的部分同源性。表9指出了本發(fā)明的抗-TNF-αVHH間的部分同源性。表10指出了本發(fā)明的抗-IFN-γVHH間的百分?jǐn)?shù)同源性。
實(shí)施例6VHH#3E的VHH-CDR3片段的表達(dá)使用位于框架4區(qū)(正向CCCCTGGCCCCAGTAGTTATACG)中的正義引物和位于框架3區(qū)(反向TGTGCAGCAAGAGACGG)的反義引物擴(kuò)增VHH#3E的CDR3區(qū)域。為了克隆pAX10中的CDR-3片段，用下面的引物實(shí)施第二輪PCR擴(kuò)增，導(dǎo)入所需的限制位點(diǎn)反向引物Sfi1GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTGTGCAGCAAGAGACGG正向引物Not1GTCCTCGCAACTGCGCGGCCGCCCCCTGGCCCCAGTAGTTATACG在50ml反應(yīng)體積中使用50pmol每種引物實(shí)施PCR反應(yīng)。初次PCR的反應(yīng)條件為94℃11分鐘，然后30個(gè)循環(huán)的94/55/72℃下30/60/120秒，和72℃5分鐘。用2.5mM MgCl2，200mM dNTP和1.25U AmpliTaq GodDNA聚合酶(Roche Diagnostics，Brussels，Belgium)實(shí)施所有反應(yīng)。
用Sfi1和Not1切割后將PCR產(chǎn)物克隆到pAX10。
實(shí)施例7對(duì)人TNFα特異的抗體片段的穩(wěn)定性試驗(yàn)經(jīng)口施用的蛋白質(zhì)受到胃中酸性pH的變性以及胃蛋白酶的分解。我們已選擇了研究VHH#3E對(duì)胃蛋白酶的抗性研究條件，假定這些條件模擬胃環(huán)境。在大腸桿菌中作為重組蛋白產(chǎn)生了對(duì)人TNFα特異一種VHHVHH#3E，將該蛋白通過(guò)IMAC和凝膠過(guò)濾層析純化至同質(zhì)。用280nm處的計(jì)算的摩爾消光系數(shù)通過(guò)分光光度法確定純化后的蛋白質(zhì)濃度。在分別為pH2、pH3和4的McIIvaine緩沖液(J.Biol.Chem.49，1921，183)中制備100微克/ml的稀釋液。然后將這些溶液在37℃孵育15分鐘，之后以1/30w/w比例加入豬胃粘膜胃蛋白。加入該蛋白酶60分鐘后，收集樣品并立即在含有0.1％酪蛋白的pH7.4的PBS中稀釋100倍使胃蛋白酶失活。從該樣品制備7份額外的3倍稀釋液以通過(guò)ELISA評(píng)估功能抗體片段的存在。從收集的等分試樣制備相同稀釋液，之后加入該蛋白酶作為參比。在ELISA測(cè)定中，在包被neutravidin的微量滴定板的孔中捕獲生物素化TNFα。對(duì)于胃蛋白酶處理的樣品和參比樣品，制備樣品的類似的連續(xù)稀釋液并向孔中加入100微升那些稀釋液。孵育1小時(shí)后洗滌微量滴定板。為了檢測(cè)VHH與被捕獲的TNFα的結(jié)合，使用多克隆兔抗-VHH抗血清(R42)和抗兔IgG堿性磷酸酶綴合物。洗滌后，用對(duì)硝基苯酚磷酸使板顯色。在圖17中繪制的數(shù)據(jù)對(duì)暴露于消化條件的所有樣品以及參比樣品顯示出相似的曲線。這表明VHH#3E在所有選擇的條件下基本上保留其功能活性。
實(shí)施例8小鼠中抗-人TNFα特異VHH的經(jīng)口施用制備含有抗-人TNFα特異的VHH#3E(100微克/微升，在PBS中稀釋100倍)的抗體溶液。三只小鼠首先被12小時(shí)不許引水，然后在后兩個(gè)小時(shí)內(nèi)允許自由接近抗體溶液。之后，處死小鼠并解剖它們的胃。立即通過(guò)含有1％BSA的500微升PBS沖洗胃以得到胃的內(nèi)容物。該沖洗的物質(zhì)被隨后用于制備連續(xù)三倍稀釋液，以未稀釋的物質(zhì)的1/5稀釋開(kāi)始。將100微升這些樣品轉(zhuǎn)移到用人TNFα包被的微量滴定板的各個(gè)孔中。孵育1小時(shí)并充分洗滌后，用多克隆兔抗-VHH抗血清(R42)接著用抗兔堿性磷酸酶綴合物孵育來(lái)評(píng)估免疫活性物質(zhì)的存在。用對(duì)硝基苯基乙酸使ELISA顯色。10分鐘后所得ELISA信號(hào)清楚地表明在這些小鼠的胃沖洗物中存在功能性VHH#3E。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，我們確定對(duì)于所試驗(yàn)的三只小鼠，胃沖洗液中功能性抗體片段的濃度分別為1.5、12.6和8.6微克/ml。
實(shí)施例9IBD動(dòng)物模型中的效能1)慢性結(jié)腸炎的動(dòng)物模型在DSS(葡聚糖硫酸鈉)誘導(dǎo)BALB/c小鼠中慢性結(jié)腸炎模型中評(píng)估通過(guò)各種施用途徑應(yīng)用的二價(jià)VHH構(gòu)建體的效能。該模型最初由Okayasu等人[Okayasu等人Gastroenterology 1990；98694-702]中描述并由Kojouharoff等人[G.Kojouharoff等人Clin.Exp.Immunol.1997；107353-8]改進(jìn)。動(dòng)物從德國(guó)的Charles River Laboratories得到，11周齡，并且保持在動(dòng)物設(shè)施中直到它們的體重達(dá)到21到22g。通過(guò)四個(gè)DSS處理周期在動(dòng)物中誘導(dǎo)慢性結(jié)腸炎。每個(gè)周期由DSS處理間隔(7天)組成，其中在飲用水中提供濃度為5％(w/v)的DSS，在恢復(fù)間隔(12天)中的飲用水中不存在DSS。最后的恢復(fù)周期從12天延長(zhǎng)到21天以提供炎癥狀態(tài)，在治療時(shí)該炎癥狀態(tài)代表慢性而不是急性炎癥。最后恢復(fù)間隔之后，小鼠被隨機(jī)分配到8只小鼠的組中并開(kāi)始用VHH-構(gòu)建體治療。治療間隔為2周。治療間隔后一周處死動(dòng)物，將腸解剖并實(shí)施組織學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)設(shè)置在圖18中示意性地顯示。
2)VHH治療方案在VHH治療期間，通過(guò)胃內(nèi)或者靜脈內(nèi)應(yīng)用100μg二價(jià)VHH3F對(duì)小鼠(每組8只)用二價(jià)VHH#3F(VHH#m3F-VHH#m3F；SEQ ID No.76)每天治療，連續(xù)治療14天。用二價(jià)VHH#3F直腸地每隔一天治療額外的動(dòng)物組，持續(xù)治療14天。在所有治療組中，以緩沖液中的1mg/ml濃度應(yīng)用二價(jià)VHH#3F的100μg劑量。陰性對(duì)照組在另外相同條件下接受100μl PBS。治療方案在表11中顯示。
3)結(jié)果處死小鼠后，確定體重并解剖結(jié)腸。確定解剖的結(jié)腸長(zhǎng)度并通過(guò)蘇木精-伊紅(HE)染色(標(biāo)準(zhǔn)條件)評(píng)估結(jié)腸的組織學(xué)。與陰性對(duì)照(PBS處理)相比，用二價(jià)nanobody 3F治療的組顯示出更長(zhǎng)的(prorogued)結(jié)腸長(zhǎng)度以及更高的組織學(xué)得分[G.Kojouharoff等人，Clin.Exp.Immunol.1997；107353-8]，從而表明治療的功效。
表1針對(duì)TNF-α的本發(fā)明各方面肽的氨基酸序列表
表2用于VHH#12B的誘變的誘變反應(yīng)、誘變引物和模板的列表
表3用于VHH#3E的誘變的誘變反應(yīng)、誘變引物和模板列表
表4人源化和野生型抗TNF-αVHH的概況
表5抗小鼠血清清蛋白，和抗小鼠血清清蛋白+抗TNF-αVHH
表6針對(duì)人IFN-γ的VHH的氨基酸序列表
表7針對(duì)TNF-α的二價(jià)(BIV 3E，BIV#m3F)、三價(jià)(TRI3E)或四價(jià)(TETRA 3E)VHH的序列
表8本發(fā)明的抗小鼠血清清蛋白VHH的氨基酸序列間的部分同源性
表9本發(fā)明的抗TNF-αVHH間的部分同源性
表10本發(fā)明的抗IFN-γVHH間的百分比同源性
表11治療程序表
權(quán)利要求
1.抗-TNF-α多肽，其含有至少一個(gè)抗-TNF-α單結(jié)構(gòu)域抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗-TNF-α多肽，其中單結(jié)構(gòu)域抗體相應(yīng)于SEQ IDNOs1到16和79到84之一代表的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的抗-TNF-α多肽，其還含有針對(duì)血清蛋白的至少一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽，其中所述血清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素-結(jié)合蛋白、運(yùn)鐵蛋白，或者血纖蛋白原的任何一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3和4的抗-TNF-α多肽，其中單結(jié)構(gòu)域抗血清蛋白單結(jié)構(gòu)域抗體相應(yīng)于SEQ ID NOs26到29和85到97任一個(gè)代表的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3到5任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽，其相應(yīng)于SEQ ID NOs30到43任一個(gè)代表的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽，其還含有至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體，所述單結(jié)構(gòu)域抗體選自由抗-IFN-γ單結(jié)構(gòu)域抗體、抗-TNF-α受體單結(jié)構(gòu)域抗體和抗-IFN-γ受體單結(jié)構(gòu)域抗體組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽，其中針對(duì)TNF-α的單結(jié)構(gòu)域抗體的數(shù)目至少為2。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的抗-TNF-α多肽，其相應(yīng)于SEQ ID NOs73到76任一個(gè)代表的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是人源化的駱駝科VHH。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的抗-TNF-α多肽，其中人源化的駱駝科VHH相應(yīng)于SEQ ID NOs17到19和21到24任一個(gè)代表的序列。
12.一種組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1到11任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽和至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體，所述單結(jié)構(gòu)域抗體選自由抗-IFN-γ單結(jié)構(gòu)域抗體、抗-TNF-α受體單結(jié)構(gòu)域抗體和抗-IFN-γ受體單結(jié)構(gòu)域抗體組成的組，用于同時(shí)、分開(kāi)或者順序地施用于受試者。
13.根據(jù)權(quán)利要求7到11任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中至少一種抗-IFN-γ單結(jié)構(gòu)域抗體相應(yīng)于SEQ ID NOs44到72任一個(gè)代表的序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到11和13任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12和13的組合物，其中所述單結(jié)構(gòu)域抗體是全長(zhǎng)單結(jié)構(gòu)域抗體的同源序列、功能部分，或者同源序列的功能部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到11和13和14任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到14的組合物，其中抗-TNF-α多肽是全長(zhǎng)抗-TNF-α多肽的同源序列、功能部分，或者同源序列的功能部分。
16.根據(jù)權(quán)利要求1到11和13和15任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到15的組合物，其中至少一種單結(jié)構(gòu)域抗體是駱駝科VHH。
17.核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1到16任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽。
18.一種鑒定試劑的方法，所述試劑調(diào)節(jié)權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結(jié)合，該方法包括步驟(a)在存在和不存在候選調(diào)節(jié)劑時(shí)，在允許所述多肽和靶標(biāo)結(jié)合的條件下，將權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽與靶標(biāo)腫瘤壞死因子-α接觸，和(b)測(cè)量步驟(a)的多肽和靶標(biāo)之間的結(jié)合，其中相對(duì)于不存在所述候選調(diào)節(jié)劑時(shí)的結(jié)合，在所述候選調(diào)節(jié)劑的存在下結(jié)合的降低將所述候選調(diào)節(jié)劑鑒定為一種試劑，該試劑調(diào)節(jié)權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結(jié)合。
19.一種通過(guò)權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結(jié)合鑒定試劑的方法，所述試劑調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的疾病，該方法包括(a)在存在和不存在候選調(diào)節(jié)劑時(shí)，在允許所述多肽和靶標(biāo)結(jié)合的條件下，將權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽與靶標(biāo)腫瘤壞死因子-α接觸，和(b)測(cè)量步驟(a)的多肽和靶標(biāo)之間的結(jié)合，其中相對(duì)于不存在所述候選調(diào)節(jié)劑時(shí)的結(jié)合，在所述候選調(diào)節(jié)劑的存在下結(jié)合的降低將所述候選調(diào)節(jié)劑鑒定為一種試劑，該試劑調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的疾病。
20.一種通過(guò)權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結(jié)合鑒定試劑的方法，所述試劑調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α與其受體的結(jié)合，該方法包括(a)在存在和不存在候選調(diào)節(jié)劑時(shí)，在允許所述多肽和靶標(biāo)結(jié)合的條件下，將權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽與靶標(biāo)腫瘤壞死因子-α接觸，和(b)測(cè)量步驟(a)的多肽和靶標(biāo)之間的結(jié)合，其中相對(duì)于不存在所述候選調(diào)節(jié)劑時(shí)的結(jié)合，在所述候選調(diào)節(jié)劑的存在下結(jié)合的降低將所述候選調(diào)節(jié)劑鑒定為一種試劑，該試劑調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α與其受體的結(jié)合。
21.一種篩選調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的疾病的試劑的試劑盒，該試劑盒含有權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的方法鑒定的未知試劑，該試劑調(diào)節(jié)權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結(jié)合。
23.根據(jù)權(quán)利要求19和20的方法鑒定的未知試劑，該試劑調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的疾病。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的未知試劑，其中所述疾病是炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化的一種和多種。
25.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求17的核酸，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物，或者根據(jù)權(quán)利要求22到24任一項(xiàng)的試劑，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕與炎癥過(guò)程有關(guān)的疾病。
26.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求17的核酸，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物，或者根據(jù)權(quán)利要求20到21任一項(xiàng)的試劑的用途，用于制備治療和/或預(yù)防和/或減輕與炎癥反應(yīng)有關(guān)的疾病的藥物。
27.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病，所述TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠穿過(guò)胃環(huán)境而該物質(zhì)不被失活。
28.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的藥物，所述TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠穿過(guò)胃環(huán)境而該物質(zhì)不被失活。
29.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病，所述TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到陰道和/或直腸道。
30.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的藥物，所述TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到陰道和/或直腸道。
31.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病，所述TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺。
32.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的藥物，所述TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺。
33.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病，所述TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜的通透性。
34.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的藥物，所述TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜的通透性。
35.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病，所述TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)舌下的組織。
36.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的藥物，所述TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)舌下的組織。
37.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物，用于治療和/或預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病，所述TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)皮膚。
38.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物的用途，用于制備治療、預(yù)防和/或減輕易受TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病的癥狀的藥物，所述TNF-α調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠有效穿過(guò)皮膚。
39.根據(jù)權(quán)利要求19的方法、根據(jù)權(quán)利要求21的試劑盒、根據(jù)權(quán)利要求25的核酸或者試劑，根據(jù)權(quán)利要求26的核酸或者試劑的用途，根據(jù)權(quán)利要求25、27、29、31、33、35、37和39任一項(xiàng)的組合物，根據(jù)權(quán)利要求26、28、30、32、34、36、和38任一項(xiàng)的組合物的用途，權(quán)利要求25、27、29、31、33、35、37和39任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽、根據(jù)權(quán)利要求26、28、30、32、34、36、和38任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽的用途，其中所述疾病是炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征、多發(fā)性硬化、阿狄森氏病、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、I型糖尿病、附睪炎、腎小球性腎炎、突眼性甲狀腺腫、急性熱病性多神經(jīng)炎、淋巴瘤性甲狀腺腫、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、男性不育癥、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、天皰瘡、牛皮癬、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肉樣瘤病、硬皮病、斯耶格倫綜合征、脊柱關(guān)節(jié)病、甲狀腺炎，和脈管炎的任一種。
40.一種組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求25的核酸或者試劑、權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽，或者根據(jù)權(quán)利要求12到16任一項(xiàng)的組合物，和適宜的藥物載體。
41.一種診斷特征為腫瘤壞死因子-α機(jī)能障礙的疾病的方法，該方法包括(a)將樣品與權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽接觸，(b)檢測(cè)所述多肽與所述樣品的結(jié)合，和(c)將步驟(b)中所檢測(cè)到的結(jié)合與標(biāo)準(zhǔn)比較，其中相對(duì)于所述樣品的結(jié)合中的差異診斷特征為腫瘤壞死因子-α的機(jī)能障礙的疾病。
42.一種試劑盒，其使用根據(jù)權(quán)利要求38的方法篩選權(quán)利要求39中引用的疾病。
43.一種篩選權(quán)利要求39中引用的疾病的試劑盒，該試劑盒含有權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的分離的抗TNF-α多肽。
44.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽的用途，用于純化所述腫瘤壞死因子-α。
45.權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽的用途，用于抑制腫瘤壞死因子-α和一種或多種腫瘤壞死因子-α受體之間的相互作用。
46.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽的方法，該方法包括步驟(a)得到編碼針對(duì)腫瘤壞死因子-α的駱駝科VHH的雙鏈DNA，(b)克隆和表達(dá)步驟(b)中所選的DNA。
47.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽的方法，該方法包括(a)在允許表達(dá)所述多肽的條件下，培養(yǎng)含有能夠編碼權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗-TNF-α多肽的核酸的宿主細(xì)胞，和(b)從培養(yǎng)物回收所產(chǎn)生的多肽。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌或酵母。
49.一種用于篩選炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸綜合征和多發(fā)性硬化任一種的試劑盒，其含有權(quán)利要求1到11和13到16任一項(xiàng)的抗TNF-α多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及從針對(duì)腫瘤壞死因子－α的單結(jié)構(gòu)域重鏈抗體衍生的多肽。本發(fā)明還涉及單結(jié)構(gòu)域抗體，這些抗體為駱駝科VHHs。還涉及施用所述多肽的方法。還涉及篩選調(diào)節(jié)TNF－α受體的試劑的方案，和從所述篩選得到的試劑。
文檔編號(hào)A61P37/06GK1735629SQ200380108511
公開(kāi)日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2003年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月8日
發(fā)明者卡倫·西萊恩克, 馬克·勞韋里斯, 漢斯·德哈德 申請(qǐng)人:埃博靈克斯股份有限公司