專利名稱：降鈣素和甲狀旁腺素治療功效的生物標志的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及組織樣品的體外分析性檢驗，并且更特別地涉及鈣調(diào)節(jié)的基因表達譜分析。
背景技術(shù)：
鈣是體內(nèi)眾多細胞過程所必需的并且尤其對骨代謝具有重要作用。體內(nèi)鈣水平由內(nèi)分泌控制系統(tǒng)細致地維持。降鈣素和甲狀旁腺素是這種內(nèi)分泌控制系統(tǒng)激素中的兩種。
降鈣素為大約32個氨基酸的多肽激素，是鈣體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的內(nèi)源性調(diào)節(jié)物并且可作為抗再吸收劑用于治療低血鈣癥相關(guān)性紊亂。降鈣素產(chǎn)生于甲狀腺濾泡旁腺細胞(C細胞)。多種降鈣素(包括例如鮭魚降鈣素和鰻魚降鈣素)可商業(yè)性獲得，并且通常在例如骨佩吉特病、惡性低血鈣癥和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥治療中使用。Pondel M，Intl.J.Exp.Pathol.，81(6)405-22(2000)。一種形式的降鈣素(Miacalcin)可作為鼻腔噴霧劑獲得。
甲狀旁腺素(PTH)為84個氨基酸的多肽。甲狀旁腺素調(diào)節(jié)骨重建和Ca2+體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。甲狀旁腺素還是已知的破骨細胞分化和活性旁分泌激活物。PTS893[SDZ PTS 893；Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34人PTH1-34[hPTH(1-34)]]是34個氨基酸的甲狀旁腺素類似物，可提高骨量和生物機械特性。Kneissel M等，Bone 28237-50(2001年3月)；Stewart AF等，J.Bone.Miner.Res.，15(8)1517-25(2000年8月)；Thomsen JS等，Bone，25(5)561-9(1999年11月)。
已知降鈣素和甲狀旁腺素在復(fù)合體中以相互依賴方式相互作用，但對降鈣素和甲狀旁腺素如何相互作用的理解仍不完全。已經(jīng)詳細記載了降鈣素對破骨細胞再吸收活性和腎小管鈣再吸收的抑制效應(yīng)。然而，對于降鈣素對成骨細胞的潛在影響及其與任何其他的骨骼代謝相關(guān)因子的相互作用仍存在爭論。
多器官基因譜分析將更好地描述整個生物體中化合物誘導(dǎo)的變化并且還提供了理解激素藥理學(xué)的新視角?；蚪M技術(shù)是目前賦予生物醫(yī)學(xué)研究者產(chǎn)生新假設(shè)能力的源泉。在藥物開發(fā)背景下，它們提供了理解藥物藥理學(xué)的新視角。因此，本領(lǐng)域需要從器官的尺度理解降鈣素和甲狀旁腺素的活性。
發(fā)明簡述
本發(fā)明滿足本領(lǐng)域的需求。多器官基因譜分析全景描述了整個生物體中化合物誘導(dǎo)的變化，并且提供理解藥物藥理學(xué)的新視角。在一個方面，本發(fā)明通過基因譜分析首次描述了通過鮭魚降鈣素的激素介導(dǎo)骨重建分子作用機制?？稍诜肿铀街貥?gòu)降鈣素作為抗再吸收劑的已知作用機制。還觀察到對連接骨重建活性的效應(yīng)物和途徑(BMP、IGF、胞外基質(zhì)成分和VEGF)的影響。這些結(jié)果支持降鈣素作為合成代謝劑的作用。在另一個方面，通過評估鮭魚降鈣素或甲狀旁腺素類似物PTS893在食蟹猴骨中所誘導(dǎo)的基因表達變化，本發(fā)明首次在完好的靈長類動物模型中重構(gòu)了藥劑對一種靶組織的分子作用機制，以闡明介導(dǎo)其效應(yīng)的分子作用機制?；蜃V分析允許對通過G蛋白偶聯(lián)受體刺激所啟動的降鈣素信號傳導(dǎo)所涉及途徑以及這些途徑對細胞周期的影響進行重建，如通過所觀察到的細胞周期蛋白變化所示。體內(nèi)(In vivo)基因譜表達研究允許對構(gòu)成藥物效應(yīng)基礎(chǔ)的分子機制進行鑒定。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供降鈣素在制造用于治療需要用合成代謝劑進行治療的疾病的藥物中的用途。在一個實施方案，所述疾病是動脈粥樣硬化。
本發(fā)明還提供降鈣素在制造用于在選定患者群中治療鈣代謝紊亂的藥物中的用途，其中所述患者群的選擇基于已施用降鈣素的患者中的指示降鈣素功效的基因表達譜。在一個實施方案中，降鈣素是鮭魚降鈣素。本發(fā)明還提供甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物在制造用于在選定患者群中治療鈣代謝紊亂的藥物中的用途，其中所述患者群的選擇基于已施用甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物的患者中指示甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物功效的基因表達譜。在一個實施方案中，激素類似物是PTS893。在一個實施方案中，藥物在確定患者基因表達譜之前以治療劑量施用。在另一個實施方案中，藥物在確定患者基因表達譜之前以亞治療劑量施用。
本發(fā)明還提供治療受試者疾病的方法，其中疾病是需要施用降鈣素、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素類似物或其組合的一種疾病。該方法包括首先向受試者(例如靈長類動物受試者)施用目的化合物，然后獲得施用化合物后該受試者的基因表達譜。將該受試者的基因表達譜與生物標志基因表達譜比較。生物標志基因表達譜指示著降鈣素、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素類似物或其組合的治療功效。在一個實施方案中，生物標志基因表達譜是在施用化合物之前的受試者的基線基因表達譜。在另一個實施方案中，生物標志基因表達譜是已施用降鈣素(例如鮭魚降鈣素)或甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物(例如PTS893)的脊椎動物的基因表達譜或平均基因表達譜。已施用化合物的受試者的基因表達譜與生物標志基因表達譜的相似性指示該化合物的治療功效。
因此，本發(fā)明提供評估需要施用降鈣素、甲狀旁腺素或其組合的疾病的治療功效的生物標志。其中生物標志為Y-盒結(jié)合蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、α-2-HS糖蛋白(AHSG)、破骨細胞刺激因子(OSF)、核受體(類固醇/甲狀腺家族)基因以及其他基因的基因表達譜。
本發(fā)明提供確定受試者是否入選臨床試驗的方法，該方法基于對待治療受試者中表達的生物標志的分析。將待測試化合物施與受試者。在一個實施方案中，待測試化合物以亞治療劑量施用。然后獲得已施用化合物的受試者的基因表達譜。當已施用該化合物的受試者的基因表達譜類似于指示降鈣素、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素類似物或其組合的治療功效的生物標志基因表達譜時，該受試者可入選臨床試驗。當受試者的基因表達譜不同于指示治療功效的生物標志基因表達譜時，該受試者可排除于臨床試驗之外。此類相似性或相異性對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是可觀察到的。
本發(fā)明還提供用于測定需要施用降鈣素、甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物的疾病的治療功效的臨床測試法、試劑盒和試劑。在一個實施方案中，試劑盒包含用于通過雜交確定生物標志基因表達的試劑。在另一個實施方案中，試劑盒包含用于通過聚合酶鏈式反應(yīng)確定生物標志基因表達的試劑。
優(yōu)選實施方案描述
本發(fā)明基于對受試者施用降鈣素(例如鮭魚降鈣素；SEQ ID NO1)或甲狀旁腺素(SEQ ID NO2)或其類似物(例如PTS893；SEQ ID NO3)的效應(yīng)的理解。對施用鮭魚降鈣素或甲狀旁腺素類似物的受試者進行多器官基因譜分析的結(jié)果提供了降鈣素治療功效和甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物治療功效的生物標志。如此處所使用，受試者是脊椎動物。在一個實施方案中，脊椎動物是哺乳動物。在更特別的實施方案中，受試者是靈長類動物，例如食蟹猴或人。
這里提供的分析通過在靈長類動物中的多器官基因譜分析全面描述鮭魚降鈣素和PTS893在改變不同器官的核糖核酸(RNA)內(nèi)容中的分子作用機制。細胞的RNA內(nèi)容(即“轉(zhuǎn)錄組”)是細胞功能和狀態(tài)的反映。在單個細胞或器官內(nèi)，轉(zhuǎn)錄組中不同組分的表達并非獨立。表達水平的改變可啟動一系列事件，這將最終導(dǎo)致對該轉(zhuǎn)錄組的另一種改變。這些相互依賴的事件按照“途徑”來描述。因為細胞內(nèi)不同功能的改變相互緊密聯(lián)系，所以此類變化在生物的不同器官內(nèi)相互關(guān)聯(lián)。對接受相同處理的不同器官進行基因譜分析促進了對生理狀態(tài)影響和改變的了解。如此處所示，當對多效化合物如降鈣素的多器官基因譜進行分析時尤其如此。實際上，對于降鈣素所描述的綜合的標記特征不僅反映在主要靶器官(即骨)中而且還反映在此處分析的其它器官中。
在該多器官基因譜分析中，作為抗再吸收劑的降鈣素以及作為破骨細胞分化和活性的旁分泌激活物的甲狀旁腺素PTS893的已知作用機制可在分子水平重構(gòu)。降鈣素對破骨細胞的抑制效應(yīng)可重構(gòu)，除了其他變化外還伴有影響PU.1(SPI1；Spi B；SEQ ID NO4)、集落刺激因子(CSF-1(SEQID NO6)；分化和存活)、碳酸酐酶(SEQ ID NO8)、H+-ATP酶、組織蛋白酶K(再吸收活性)、微管蛋白、PAK4(運動性)基因的變化。還觀察到對連接骨重建活性(骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、細胞外基質(zhì)成分、類固醇激素、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和α-2-HS糖蛋白(AHSG))的效應(yīng)物和途徑的影響，其中所述影響在多數(shù)情況下為鮭魚降鈣素和PTS893共有。有趣的是，鮭魚降鈣素還調(diào)節(jié)編碼破骨細胞刺激因子(OSF)和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的基因的表達。更有趣的是，PTS893也調(diào)節(jié)參與破骨細胞分化和存活的基因(SPI1、CSF-1、單核細胞向巨噬細胞分化相關(guān)蛋白(MMD))。PTS893還引起核受體(類固醇/甲狀腺素家族)的強烈上調(diào)。因此，這些結(jié)果支持降鈣素作為合成代謝劑的功能。
目前降鈣素用于治療以高骨量為特征的全身性骨骼疾病，其中高骨量是骨形成(合成代謝)和骨再吸收之間不平衡(骨形成占優(yōu)勢)的結(jié)果。降鈣素促進合成骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)，已知該蛋白是強效合成代謝劑。骨細胞在接觸到降鈣素時通過增加BMP-2的產(chǎn)生而表現(xiàn)合成效應(yīng)的證據(jù)是確鑿的。因此降鈣素可用于處理個體以調(diào)節(jié)受試者骨礦物質(zhì)密度的方法。
這是首個在體內(nèi)模型中通過基因表達譜分析表征降鈣素影響骨代謝的方法?？芍貥?gòu)降鈣素對破骨細胞的抑制效應(yīng)，其中伴有影響碳酸酐酶，H+-ATP酶和組織蛋白酶K基因的改變。鮭魚降鈣素似乎還調(diào)節(jié)編碼抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的基因的表達，該效應(yīng)在這里首次描述。鮭魚降鈣素對影響間充質(zhì)細胞功能的直接調(diào)節(jié)、自分泌調(diào)節(jié)、旁分泌調(diào)節(jié)和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的基因如多效營養(yǎng)因子、periostin、成纖維細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、胰島素樣生長因子/結(jié)合蛋白(IGF/IGFBP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、神經(jīng)軟骨膠(neurochondrin)、卵泡抑素樣3(follistatin-like 3)或甲狀旁腺素受體基因具有調(diào)節(jié)效應(yīng)。鮭魚降鈣素還調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)成分(膠原、骨橋蛋白、骨鈣蛋白、皮膚橋蛋白(dermatopontin)、軟骨粘附素、磷脂酰肌醇聚糖或粘結(jié)蛋白聚糖)和酶的合成與降解。由于觀察到牙質(zhì)的變化，故鮭魚降鈣素還影響骨礦化作用的一些方面。
如此處所提供，降鈣素還可作為合成代謝劑用于治療其他的在治療中需要合成代謝或組織生長的疾病。此種疾病是動脈粥樣硬化，即一種動脈粥樣斑塊并發(fā)纖維化和鈣化的動脈粥樣疾病。
而且，本發(fā)明提供降鈣素或甲狀旁腺素治療功效的生物標志。如此處所使用，當施用化合物后增加或降低的基因表達是對于基線基因表達(即生物標志基因表達譜是受試者在施用化合物前的基線基因表達譜)的增加或降低(例如至少1.5倍差異)時，該基因表達譜可用于確定治療功效的判斷。備選地或者此外，當已受治療的受試者的基因表達譜與標準的生物標志基因表達譜可比時，與降鈣素(例如鮭魚降鈣素)或甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物(例如PTS893)治療相比，該基因表達譜可用于確定治療功效的判斷。在一個實施方案中，標準生物標志基因表達譜是已施用降鈣素、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素類似物或其組合的脊椎動物的基因表達譜或平均基因表達譜，該基因表達譜或基因表達譜成為與來自施用后受試者的結(jié)果相比的標準。本領(lǐng)域眾多技術(shù)人員稱此種包括了治療和診斷方面的方法為“診療(theranostic)”。
在一個實施方案中，受試者是脊椎動物。在一個特別的實施方案中，脊椎動物是哺乳動物。在一個更特別的實施方案中，哺乳動物是靈長類動物，如食蟹猴或人。如此處所使用，向受試者或患者施用藥劑或藥物包括自我施用或由他人施用。
如此處所使用，當施用降鈣素或者甲狀旁腺素或類似物后增加或降低的基因表達是對于基線基因表達的增加或降低(例如至少1.5倍差異)時，該基因表達譜用于判斷降鈣素或甲狀旁腺素的治療功效。如此處所使用，當與基線樣品相比基因表達(例如已治療受試者的樣品)在表達水平上顯示具有1.5倍差異(即更高)時，該基因表達模式“高于正常”。當與基線樣品相比基因表達(例如已治療受試者的樣品)在表達水平上顯示具有1.5倍差異(即更低)時，該基因表達模式“低于正?！?。
檢測本發(fā)明所述基因表達的技術(shù)包括但不限于Northern印跡、RT-PCT、實時PCR、引物延伸、RNA酶保護、RNA表達譜和相關(guān)技術(shù)。通過檢測本發(fā)明所述基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物來檢測基因表達的的技術(shù)包括但不限于識別蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體、Western印跡、免疫熒光、免疫沉淀、ELISA和相關(guān)技術(shù)。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。Sambrook J等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第3版(Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，2000)。在一個實施方案中，檢測基因表達的技術(shù)包括基因芯片的使用?；蛐酒臉?gòu)建和使用為本領(lǐng)域眾所周知。參見美國專利號5,202,231；5,445,934；5,525,464；5,695,940；5,744,305；5,795,716和5,800,992。也參見Johnston，M.，Curr Biol，8R171-174(1998)；Iyer VR等，Science，28383-87(1999)和Elias P，“New human genome‘chip’is a revolution in the offing”Los Angeles Daily News(2003年10月3日)。
所述的基因表達譜可包括選自下列的一種或多種基因酸性磷酸酶1同工型a；II型激活蛋白A受體樣1；IIB型激活蛋白A受體前體；激活蛋白βC鏈；α2 HS糖蛋白；琺瑯蛋白；膜聯(lián)蛋白V；芳基硫酸酯酶E前體；液泡H(+)ATP酶；液泡H(+)ATP酶亞基；溶酶體H+轉(zhuǎn)運ATP酶；溶酶體H+轉(zhuǎn)運ATP酶；溶酶體H+轉(zhuǎn)運ATP酶；雙糖鏈蛋白聚糖；骨形態(tài)發(fā)生蛋白1；骨形態(tài)發(fā)生蛋白10；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2A；骨形態(tài)發(fā)生蛋白5；骨形態(tài)發(fā)生蛋白6前體；鈣結(jié)合蛋白1(calbrain)；鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ；鈣網(wǎng)蛋白；cAMP應(yīng)答元件調(diào)節(jié)物(CREM)；碳酸酐酶I；碳酸酐酶II；軟骨寡聚基質(zhì)蛋白前體；組織蛋白酶K；組織蛋白酶W；CDC樣激酶1；CDC樣激酶2同工型hclk2/139；硫酸軟骨素蛋白聚糖2(多能聚糖)；硫酸軟骨素蛋白聚糖3(神經(jīng)聚糖)；絨膜生長催乳激素1；胰凝乳蛋白酶C(降鈣蛋白)；膠原I型與PDGFB融合轉(zhuǎn)錄物；膠原II型α1；膠原III型α1；膠原IV型α2；膠原IX型α1；膠原VI型α1；膠原VI型α2(AA 570 998)；膠原XI型α1；膠原XI型α2；膠原XI型α2；膠原，I型，α2；膠原，IV型，α1；膠原，IX型，α2；膠原，V型，α2；膠原，VI型，α1；膠原，VI型，α1前體；膠原，XVI型，α1；膠原，XVI型，α1；膠原酶3(基質(zhì)金屬蛋白酶13)；結(jié)締組織生長因子；細胞周期蛋白A2；細胞周期蛋白B1；細胞周期蛋白D2；細胞周期蛋白E2；細胞周期蛋白依賴性激酶5；細胞周期蛋白依賴性激酶5，調(diào)節(jié)亞基1(p35)；細胞周期蛋白依賴性激酶6；細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物1A(p21，Cip1)；抑半胱氨酸蛋白酶蛋白B(stefin B)；細胞因子誘導(dǎo)的激酶；死亡相關(guān)蛋白激酶1；死亡相關(guān)蛋白激酶3；牙質(zhì)基質(zhì)酸性磷蛋白1(DMP1)；雙特異性磷酸酶9；強直性肌營養(yǎng)不良蛋白激酶；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1；內(nèi)皮分化G蛋白偶聯(lián)受體6前體；雌激素受體；雌激素受體；雌激素受體相關(guān)蛋白；雌激素應(yīng)答B(yǎng)盒蛋白(EBBP)；成纖維細胞激活蛋白；成纖維細胞生長因子1(酸性)；成纖維細胞生長因子18；成纖維細胞生長因子4；成纖維細胞生長因子受體；卵泡抑素樣1；卵泡抑素樣1；代謝型谷氨酸受體1；GPI1 N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶組分Gpi1；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(CSF1)；生長停滯與DNA損傷誘導(dǎo)蛋白α；生長因子受體結(jié)合蛋白10；硫酸肝素蛋白聚糖2(基底膜聚糖)；肌醇1，4，5三磷酸受體，1型；肌醇1，4，5三磷酸受體，1型；肌醇1，4，5三磷酸受體，2型；肌醇1，4，5三磷酸3激酶同工酶；肌醇多磷酸4磷酸酶I型β；肌醇多磷酸5磷酸酶；肌醇(肌型)1(或4)單磷酸酶1；肌醇(肌型)1(或4)單磷酸酶2；胰島素樣生長因子(IGF II)；胰島素樣生長因子2(生長調(diào)節(jié)素A)；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2；胰島素樣生長因子II前體；胰島素樣生長因子II前體；整合素α10亞基；白細胞介素1受體相關(guān)激酶；Janus激酶3；LIM蛋白(類似于大鼠蛋白激酶C結(jié)合的enigma)；賴氨酰氧化酶樣蛋白；MAD，mothers againstdecapentaplegic同系物3；MAGUK(膜相關(guān)鳥苷酸激酶同系物)；MAP激酶激酶激酶(MTK1)；MAPK13促分裂原活化蛋白激酶13；MAPK8IP1促分裂原活化蛋白激酶8相互作用蛋白1；MEK激酶；金屬蛋白酶；促分裂原活化蛋白激酶1；促分裂原活化蛋白激酶8；促分裂原活化蛋白激酶激酶1；促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4；促分裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶2；促分裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶3；MMD單核細胞至巨噬細胞分化相關(guān)；神經(jīng)軟骨膠；胞質(zhì)中鈣依賴磷酸酶依賴性的活化T細胞的細胞核因子1；OS 4蛋白(OS 4)；OSF 2os成骨細胞特異性因子2(periostin)；破骨細胞刺激因子(OSF)；PAK4；PDGF相關(guān)蛋白；磷脂酰肌醇4激酶，催化性β多肽；磷脂酰肌醇聚糖，L類；磷脂酰肌醇多磷酸5磷酸酶，同工型b；磷脂酰肌醇4磷酸5激酶同工型C(1)；磷脂酰肌醇4磷酸5激酶，I型，β；磷脂酰肌醇4磷酸5激酶，II型，β；磷脂酰肌醇聚糖C類(PIG C)；cAMP特異性磷酸二酯酶4A；cAMP特異性磷酸二酯酶4D (dunce(果蠅)同系物磷酸二酯酶E3)；鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸二酯酶IB；磷酸肌醇3激酶；磷酸肌醇3激酶，催化性γ多肽；磷酸肌醇3激酶，3類；磷脂酶Cb3；磷脂酶C，β4；磷脂酶D；磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白；PKD2蛋白激酶D2；前原膠原I型α2；前原膠原I型α1；前膠原α1 II型；前膠原賴氨酸5雙加氧酶；前膠原脯氨酸，2酮戊二酸4雙加氧酶(脯氨酸4羥化酶)，α多肽I；孕酮相關(guān)子宮內(nèi)膜蛋白(胎盤蛋白14，妊娠相關(guān)子宮內(nèi)膜α2球蛋白，α子宮蛋白)；氨?；彼岫拿?亞氨二肽酶)PEPD；增殖細胞核抗原；脯氨酰4羥化酶β；絲氨酸蛋白酶11(IGF結(jié)合)；蛋白酶體(prosome，macropain)亞基，β型，10；活化STAT蛋白質(zhì)抑制物X；蛋白激酶1PCTAIRE；蛋白激酶C底物80K H；蛋白激酶C，α；cAMP依賴性蛋白激酶，催化亞基γ；cAMP依賴性蛋白激酶，調(diào)節(jié)亞基，I型，β；cAMP依賴性蛋白激酶，調(diào)節(jié)亞基，II型，α；G蛋白偶聯(lián)的嘌呤能受體P2Y，11；RAC2 Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物2(rho家族，小GTP結(jié)合蛋白Rac2)；受體酪氨酸激酶DDR；類視黃醇X受體γ；核糖體蛋白S6激酶；核糖體蛋白S6激酶，90kD，多肽3；SCAMP1分泌性載體膜蛋白1(囊泡運輸)；分泌磷蛋白1(骨橋蛋白，骨唾液酸蛋白I，早期T淋巴細胞激活因子1)；絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制物，進化枝H(熱休克蛋白47)，成員2；絲氨酸/蘇氨酸激酶38；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；SF1類固醇生成因子1；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白2，113kD；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5A；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5A；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6(STAT6)；Smad 3；Smad錨定受體激活物，同工型1；Smad5；SMAD6(抑制BMP/Smad1(MADH1))；SNF1相關(guān)激酶；Spi B轉(zhuǎn)錄因子(SPI 1/PU.1相關(guān))；Stat5b(stat5b)；Ste20相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶；TEIG；TGFB可誘導(dǎo)的早期生長應(yīng)答；TGFB可誘導(dǎo)的早期生長應(yīng)答；TIEG；TGFB1誘導(dǎo)的抗凋亡因子1；TGFβ誘導(dǎo)的凋亡蛋白12；TGFβ前體；TGFβ超家族蛋白；Tob；tousled樣激酶1；轉(zhuǎn)化生長因子，β受體III(β聚糖，300kD)；轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGFβ3)；TRIO三重功能結(jié)構(gòu)域(PTPRF相互作用)；微管蛋白α1；微管蛋白α3；微管蛋白α同種型H2α；微管蛋白β2；微管蛋白β3；微管蛋白β4；微管蛋白β，輔助因子D；VI型膠原α2鏈前體；遍在蛋白載體蛋白E2C；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子B和Y盒結(jié)合蛋白1。
如此處所使用，向受試者或患者施用藥劑或藥物包括自我施用和他人施用。
降鈣素
術(shù)語“降鈣素”不僅包括天然存在的降鈣素，還包括它們的藥用活性衍生物和類似物，例如其中在天然存在產(chǎn)物中出現(xiàn)的一個或多個肽殘基被替換或其中N-末端或C-末端被修飾。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選使用的降鈣素是鮭魚、人和豬降鈣素和依降鈣素。所有這些化合物均可商業(yè)性獲得，并且在文獻中充分描述了這些化合物及其藥用特性。見美國專利號第5,733,569和5,759,565，其內(nèi)容被引用作為參考。
根據(jù)本發(fā)明方法待施用的降鈣素的量及因此本發(fā)明組合物中的活性成分的量取決于所選擇的特定降鈣素、待治療疾病、所期望的施用頻率和所期望效果。
如經(jīng)過血漿濃度測定可見，鼻腔施用后降鈣素(具體而言為鮭魚降鈣素)的生物利用度通常高于肌內(nèi)注射所達到水平的約50％的數(shù)量級。因此，可以實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的適宜施用，以至于得到為壁內(nèi)如肌內(nèi)施用治療所達到的劑量率的兩倍或更多倍(例如2倍至4倍)級別的劑量率。關(guān)于施用Miacalcin(降鈣素-鮭魚)鼻腔噴霧劑的信息可在Miacalcin處方信息(Novartis，2002年11月)中獲得。
對于肌內(nèi)注射，以約每日一次至約每周三次的頻率使用約50至100MRC單位的個體劑量。對根據(jù)本發(fā)明的鼻腔施用，治療由此適宜地包括以每日大約一次至每周大約三次的頻率施用從大約50至大約400MRC單位、更優(yōu)選從大約100至大約200MRC單位的劑量。前述劑量將方便地在單次使用中施用，即治療將包含施用含有大約50至大約400MRC單位、優(yōu)選大約100至大約200MRC單位降鈣素的單一鼻腔劑量。備選地，該劑量可在一天內(nèi)分成一系列次數(shù)例如2-4次間隔施用，因此每次使用的劑量包含大約10至大約200MRC單位，優(yōu)選地是大約25至大約100MRC單位。
每次鼻腔施用的組合物總量適當包含大約0.05至0.15ml，一般大約0.1ml，例如0.09ml。因此，使用的組合物在每毫升中適當包含大約150至大約8,000、優(yōu)選大約500至大約4,000、更優(yōu)選大約500至大約2,500且最優(yōu)選大約1,000至大約2,000MRC單位降鈣素，如鮭魚降鈣素。
術(shù)語“降鈣素”還包括例如在美國專利號5,719,122、5,175,146和5,698,6721中描述的活性肽類似物和模擬物。見美國專利申請?zhí)?003015815?！敖碘}素超家族”由降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)和胰淀粉樣肽組成。降鈣素和CGRP來自人CT/CGRP基因。初級RNA轉(zhuǎn)錄物的可變剪接導(dǎo)致CGRP和CT肽以組織特異性方式翻譯。CGRP(37個氨基酸的神經(jīng)肽)及其受體在體內(nèi)廣泛分布。胰淀粉樣肽(37個氨基酸的肽)由位于第12號染色體(據(jù)認為該染色體是第11號染色體的演化性復(fù)制品)的基因產(chǎn)生并且與CGRP和人降鈣素分別具有46％和20％的氨基酸序列同源性。術(shù)語“降鈣素基因相關(guān)肽”或“CGRP”包括天然CGRP(優(yōu)選人CGRP)及其活性類似物。已知CGRP在骨形成中具有多種功能。術(shù)語“胰淀粉樣肽”包括天然胰淀粉樣肽(一般為人源)以及其藥用活性類似物。已知該激素通過多種機制誘導(dǎo)骨量形成。“降鈣素樣劑”包括“降鈣素”、“CGRP”和“胰淀粉樣肽”。見美國專利申請?zhí)?003015815。
甲狀旁腺素
術(shù)語“甲狀旁腺素”指甲狀旁腺素、可刺激骨形成和增加骨量的其片段或代謝物以及其結(jié)構(gòu)類似物。還包括甲狀旁腺素相關(guān)肽和甲狀旁腺素相關(guān)肽的活性片段及類似物。見美國專利號4,086,196、5,001,223、6,541,450和6,649,657以及公布的PCT專利申請WO 94/01460和WO 93/06845。本領(lǐng)技術(shù)員可根據(jù)標準測定法迅速確定甲狀旁腺素的功能性活性。眾多這些化合物如下描述并參考，然而，其他甲狀旁腺素將為本領(lǐng)技術(shù)人員所知。示范性甲狀旁腺素在美國專利號6,541,450和6,649,657所引用的參考文獻中公開，所述專利的完整內(nèi)容被引用作為參考。通過在常規(guī)測定法中測定的甲狀旁腺素的活性證明了甲狀旁腺素作為藥劑在治療哺乳動物的低骨量疾病(例如骨質(zhì)疏松癥)中的效用，其中常規(guī)測定法包括體內(nèi)測定法、受體結(jié)合測定法、環(huán)AMP測定法和骨折愈合測定法。
PTS893是內(nèi)源性甲狀旁腺素的類似物，其中在該類似物中通過在甲狀旁腺素片段N末端內(nèi)的特定殘基處進行適宜的氨基酸置換消除某些化學(xué)不穩(wěn)定位點，產(chǎn)生穩(wěn)定和具有生物學(xué)活性的人甲狀旁腺素片段。人甲狀旁腺素的N-末端片段包括hPTH(1-34)OH突變蛋白和hPTH(1-38)OH突變蛋白。PTS893包含甲狀旁腺素N-末端至少前27個氨基酸單位。優(yōu)選的甲狀旁腺素衍生物是那些在甲狀旁腺素序列如下位置中的一個或多個位置包含至少一個已替換氨基酸單位的衍生物8-11、13、16-19、21、22、29至34，尤其是8-11、16-19、33和/或34。這些化合物在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出所期望的骨形成特性，其中所述的骨形成特性等于或高于天然PTH或其N-末端片段的水平。見歐洲專利號EP 0 672 057；公布的PCT專利申請WO 94/02510；Kneissel M等，Bone，28237-50(2001年3月)；StewartAF等，J Bone Miner Res，15(8)1517-25(2000年8月)；Thomsen JS等，Bone，25(5)561-9(1999年11月).
試劑盒
本發(fā)明的試劑盒可含有在試劑盒容器表面或內(nèi)部的書面產(chǎn)品。該書面產(chǎn)品描述如何使用該試劑盒內(nèi)所包含的試劑以便例如測定患者是否對治療需要使用降鈣素、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素類似物或其組合的疾病的化合物有效應(yīng)答或能夠有效應(yīng)答。在幾個實施方案中，試劑的使用可按照本發(fā)明方法進行。在一個實施方案中，試劑是用于確定相關(guān)基因表達的基因芯片。
提供如下實施例以便更充分地闡明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。該實施例無論如何不得解釋為對如后附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的范圍的限制。
實施例
鮭魚降鈣素和PTS893，在猴子中進行的藥物基因組學(xué)探索性研究；微芯片基因表達分析
前言和簡述
本實施例的目的是評估以50μg/只動物/日的鮭魚降鈣素(sCT)和5μg/只動物/日的PTS893皮下治療兩周后食蟹猴的基因表達變化，以闡明介導(dǎo)其效應(yīng)的作用機制以及鑒定具有治療性指示作用的生物標志。相信本實施例是首個通過在靈長類動物中進行多器官基因譜分析全面描述鮭魚降鈣素和甲狀旁腺素類似物的分子作用機制的分析。還相信本實施例是首個描述由鮭魚降鈣素和PTS893所致的激素介性導(dǎo)骨重建的分子作用機制的基因譜分析。
在本實施例中，發(fā)現(xiàn)鮭魚降鈣素和PTS893均對影響間充質(zhì)細胞功能的直接、自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌性調(diào)節(jié)的基因如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因具有調(diào)節(jié)效應(yīng)。兩種化合物還調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)成分的合成和降解。鮭魚降鈣素還調(diào)節(jié)雌激素受體和類固醇生成因子，而PTS893引起類固醇/甲狀腺受體家族的核受體強烈上調(diào)。因此這些數(shù)據(jù)支持降鈣素作為合成代謝劑的功能。
此外，由于觀察到琺瑯蛋白、牙質(zhì)和外核苷酸焦磷酸酶的變化，故鮭魚降鈣素和PTS893還影響細胞外基質(zhì)礦化的某些方面。
此外，PTS893通過細胞因子和RANK配體影響對破骨細胞分化和活性的旁分泌性激活的介導(dǎo)。
至于單一治療，基因表達譜中的非顯著性差異歸因于組合施用了鮭魚降鈣素和PTS893這一事實。
因此，本實施例中的基因譜分析允許對涉及降鈣素和甲狀旁腺素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(由G蛋白偶聯(lián)受體刺激所啟動)的途徑以及它們對細胞周期的影響(如通過觀察到的細胞周期蛋白變化所示)進行重建。
動物
用鮭魚降鈣素(sCT)、PTS893或兩者的組合皮下治療兩周，其中鮭魚降鈣素和PTS893均溶于含9％自體血清的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。溶劑用作對照組的媒介物。
本分析中所用動物是食蟹猴(Macaca fascicularis)，由靈長目動物動物研究中心(Centre de Recherches Primatologiques，Port Louis，毛里求斯)提供。每組和每一性別使用兩只動物。治療期開始時，動物至少24月齡，體重約3千克。將動物在符合動物福利的標準條件下飼養(yǎng)。每日檢查動物死亡率、食物消耗和臨床觀察。每周記錄體重一次。劑量為0μg/只動物/日(作為對照)、50μg/只動物/日的鮭魚降鈣素和5μg/只動物/日的PTS893。
如下所示，在本實施例中開展的臨床觀察和分析以及組織病理學(xué)檢查顯示食蟹猴對50μg/只動物/日劑量的鮭魚降鈣素皮下施用良好耐受。
體內(nèi)檢查
未見顯著的組織病理學(xué)變化。除了在鮭魚降鈣素組中觀察到8至12％的體重下降以外，未見相關(guān)變化。還觀察到食物消耗下降，雖然其并非總與體重下降一致。
表1
施用鮭魚降鈣素的動物體重下降8％至12％，這可歸因于食物消耗下降。以前曾描述鮭魚降鈣素通過作用胰淀粉樣肽受體引起厭食效應(yīng)。EidenS等，J.Physiol.，541(pt3)1041-1048(2002)；Lutz TA等，Peptides，21(2)233-8(2000)。然而，在這里未見中毒跡象。本實施例中所觀察到的激素和脂類變化最有可能與隨之發(fā)生的代謝適應(yīng)有關(guān)。
未見心電圖或血壓的相關(guān)變化。
表2
血液采樣
將動物在收集血液前禁食過夜但可自由飲水。從外周靜脈獲得血樣。在預(yù)測試期間和治療期結(jié)束時各開展一次標準血液學(xué)和臨床化學(xué)分析。以所述的相同間隔從每一動物中收集血樣用于臨床化學(xué)檢查。將血清樣品深度冷凍(約-80℃)直至用于激素測定分析。
臨床化學(xué)和激素測定
在所研究的所有動物內(nèi)(包括對照組)均見輕微貧血。這歸因于反復(fù)的血液采樣并且被認為是不相關(guān)的。
表3
d-6、d7和d13指相對于給藥開始日的第-6日、第7日和第13日
表3
d-6、d7和d13指相對于給藥開始日的第-6日、第7日和第13日
表4
d-8、d7和d13指相對于給藥開始日的第-8日、第7日和第13日
表4
d-8、d7和d13指相對于給藥開始日的第-8日、第7日和第13日
所開展的標準臨床化學(xué)測試中，在已施用鮭魚降鈣素和PTS893的組內(nèi)可見到磷和/或鎂的輕微至中度下降和三酰甘油的中度至顯著下降。
表5
d-6、d7和d13指相對于給藥開始日的第-6日、第7日和第13日
表5
d-6、d7和d13指相對于給藥開始日的第-6日、第7日和第13日
表5
d-6、d7和d13指相對于給藥開始日的第-6日、第7日和第13日
表6
d-8、d7和d13指相對于給藥開始日的第-8日、第7日和第13日
表6
d-8、d7和d13指相對于給藥開始日的第-8日、第7日和第13日
表6
d-8、d7和d13指相對于給藥開始日的第-8日、第7日和第13日
表7
d-6、d-5和d13指相對于給藥開始日的第-6日、第-5日和第13日
表7
d-6、d-5和d13指相對于給藥開始日的第-6日、第-5日和第13日
表7
d-6、d-5和d13指相對于給藥開始日的第-6日、第-5日和第13日
表8
d-8、d-7和d13指相對于給藥開始日的第-8日、第-7日和第13日
表8
d-8、d-7和d13指相對于給藥開始日的第-8日、第-7日和第13日
表8
d-8、d-7和d13指相對于給藥開始日的第-8日、第-7日和第13日
鮭魚降鈣素組表現(xiàn)為血清生長調(diào)節(jié)素中度下降(S.MED，見表9和10)。
表9
d-6、d7和d13指相對于給藥開始日的第-6日、第7日和第13日
表9
d-6、d7和d13指相對于給藥開始日的第-6日、第7日和第13日
表9
d-6、d7和d13指相對于給藥開始日的第-6日、第7日和第13日
表10
d-8、d7和d13指相對于給藥開始日的第-8日、第7日和第13日
表10
d-8、d7和d13指相對于給藥開始日的第-8日、第7日和第13日
表10
d-8、d7和d13指相對于給藥開始日的第-8日、第7日和第13日
組織采樣
通過靜脈內(nèi)注射Pentothal引起的深度麻醉處死動物，然后放血。采集所有相關(guān)組織用于組織病理學(xué)和基因表達譜分析。將如下織樣品進行加工以便分析肝、腎、垂體、肌肉、骨、十二指腸、脾和氣管。用于組織病理學(xué)的樣品在經(jīng)磷酸鹽緩沖的10％福爾馬林中固定。骨的脫礦化在10％甲酸中進行。組織樣品在Paraplast中包埋并切成4微米切片用于蘇木精和伊紅染色。用于基因表達譜分析的樣品在切下后立即在液氮中迅速冷凍，在干冰上保存隨即在約-80℃的深冷冰箱內(nèi)保存直至使用。選擇用于基因表達譜分析的所有樣品均經(jīng)組織病理學(xué)檢查。
組織病理學(xué)
對選擇用于基因表達譜分析的組織樣品進行的組織病理學(xué)檢查表現(xiàn)出正常范圍的偶然性損害，就嚴重程度和分布而言，其與所有治療組中的對照無差異。
觀察到炎性變化和再生性變化的發(fā)生率在已施用鮭魚降鈣素的雌性腎內(nèi)略微較高。因為在治療性使用降鈣素40年后未見腎毒性記載，故并不認為這些變化是相關(guān)的。
對骨切片做骨粘連蛋白、骨橋蛋白和骨鈣蛋白染色并且做組織病理學(xué)評估。對骨組織的組織形態(tài)學(xué)作骨再吸收和合成(類骨質(zhì)形成)參數(shù)測量。
脛骨的骨粘連蛋白、骨橋蛋白和骨鈣蛋白染色顯示組一(對照)和組二(鮭魚降鈣素)之間的無差異。對骨粘連蛋白的染色顯示，編號2553動物由于處于重度非治療相關(guān)病理學(xué)狀態(tài)(重度、亞急性骺脫離)而導(dǎo)致骺生長板嚴重增大和退化。
對骨組織進行組織形態(tài)計量以便確定與骨再吸收和合成(類骨質(zhì)形成)有關(guān)的參數(shù)。
結(jié)果(見表11和12)顯示鮭魚降鈣素提高脛骨內(nèi)的小梁體積和厚度約17％，但是在脊椎中未見提高。PTS893降低脛骨內(nèi)(T)的皮質(zhì)厚度(18％)并且提高皮質(zhì)孔隙率(54％)，但是在脊椎(V)內(nèi)未見變化。與此相反，PTS893分別誘導(dǎo)脛骨和脊椎中類骨質(zhì)體積(37％T，213％V)和表面(49％T，37％V)以及成骨細胞表面(40％T，24％V)的增加。
表11
sCT鮭魚降鈣素；SD標準差
BV/TV小梁骨體積；Tb.Th.小梁厚度；Tb.N.小梁數(shù)量；Tb.Sp.小梁分離度；Ct.
Por.皮質(zhì)孔隙率；Ct，Th.皮質(zhì)厚度；OS/BS類骨質(zhì)表面；OV/BV類骨質(zhì)體積；
ES/BS侵蝕表面；Obs/BS成骨細胞表面。
表12
sCT鮭魚降鈣素；SD標準差
BV/TV小梁骨體積；Tb.Th.小梁厚度；Tb.N.小梁數(shù)量；Tb.Sp.小梁分離度；Ct.Por.
皮質(zhì)孔隙率；Ct，Th.皮質(zhì)厚度；OS/BS類骨質(zhì)表面；OV/BV類骨質(zhì)體積；ES/BS侵蝕
表面；Obs/BS成骨細胞表面。
組織形態(tài)計量顯示除PTS893誘導(dǎo)類骨質(zhì)合成增加以外，脛骨和脊椎骨間的結(jié)果不一致。對于不連續(xù)方式施用的甲狀旁腺素已經(jīng)很好地證明了該效應(yīng)。
RNA提取和純化
選擇一套組織用于基因表達譜分析。這些組織包括來自腎、骨、肌肉、十二指腸、垂體和肝的樣品。尤其將來自股骨和脛骨的骨干骨進行處理用于基因表達譜分析。簡而言之，通過酸性硫氰酸胍-酚-氯仿抽提(Trizol，Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，Calif.，美國)從每份冷凍組織切片獲得總RNA，然后使用親和樹脂(RNeasy，Qiagen)并根據(jù)制造商的說明書純化總RNA。經(jīng)λ＝260nm吸光度(A260nm)定量總RNA，并以A260nm/A280nm比率推測純度。通過非變性瓊脂糖凝膠電泳證實RNA分子的完整性。將RNA儲存于約-80℃直至分析。將每種單獨RNA樣品的一部分保存用于通過實時PCR方法分析關(guān)鍵基因。
雜交測定法
按照GeneChip系統(tǒng)(GeneChip Expression Analysis TechnicalManual，Affymetrix Inc.，Santa Clara，Calif.，美國)制造商推薦，在Genomics Factory EU實驗室通過GeneChip表達探針芯片進行轉(zhuǎn)錄譜分析。使用HG-U95Av2 GeneChip表達探針芯片(Affymetrix，Santa ClaraCalif.，美國)。以大約5μg全長總RNA為起始量，使用Superscript Choice系統(tǒng)(Invitrogen Life Technologies)和T7-(dT)24 DNA寡核苷酸引物合成雙鏈cDNA。合成后，通過酚/氯仿/異戊醇抽提及乙醇沉淀純化cDNA。然后使用BioArray高效RNA轉(zhuǎn)錄物標記試劑盒(ENZO)在生物素化核糖核苷酸存在下將純化的cDNA體外轉(zhuǎn)錄形成生物素標記的cRNA。將標記的cRNA在親和樹脂(Rneasy，Qiagen)上純化、定量和分裝。將大約10μg量的標記cRNA與表達探針芯片在45℃雜交約16小時。然后使用GeneChip Fluidics Workstation 400(Affymetrix)洗滌芯片并用鏈霉抗生物素-藻紅蛋白(Molecular Probes)染色兩次。然后用共聚焦激光掃描器(GeneArrayScanner，Agilent)掃描芯片兩次，產(chǎn)生一幅掃描圖像。使用微芯片分析程序包第4版(MAS4)程序(Affymetrix)將得到的“.data-file”處理成“.cel-file”。將“.cel file”保存并加載至Affymetrix GeneChip實驗室信息管理系統(tǒng)(LIMS)。LIMS數(shù)據(jù)庫通過網(wǎng)絡(luò)文件系統(tǒng)與UNIX SunSolaris服務(wù)器連接，從而允許將所有探針單元的平均強度(CEL file)下載至Oracle數(shù)據(jù)庫。將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成使用150的“目標密度”的表達水平。所顯示數(shù)值是對于特定轉(zhuǎn)錄物序列的探針集合內(nèi)所包含探針對的信號強度的加權(quán)平均值(AvgDiff值)。檢查數(shù)據(jù)質(zhì)量并加載至GeneSpring軟件4.2.4和5版(Silicon Genetics，Calif.，美國)用于分析。
數(shù)據(jù)分析
用Silicon Genetics軟件包GeneSpring 4.2.4和5版開展數(shù)據(jù)分析。將低于20的平均差異值設(shè)置為20。使用這些程序中的多種過濾和聚類工具探索數(shù)據(jù)集合，并鑒定出揭示改變的細胞和組織功能以及可用于建立化合物作用模式工作假設(shè)的轉(zhuǎn)錄物水平變化。
在本實施例的生物學(xué)解釋的上下文中確定認為是上調(diào)或下調(diào)的閾值范圍。
這些數(shù)據(jù)集合的信息內(nèi)容是數(shù)值變化和生物學(xué)信息的結(jié)合。基于通過比較性和統(tǒng)計學(xué)算法所鑒定的數(shù)值變化和與其他被調(diào)節(jié)的基因(指向共同生物學(xué)主題)的相互關(guān)系的聯(lián)合作出認為是特異性基因相關(guān)的決定。所述聯(lián)系的重要性通過分析人員回顧相關(guān)科學(xué)文獻來評估。
除非特別聲明，這里所報告的提高和降低指轉(zhuǎn)錄物豐度。
基因表達譜分析
在已施用50μg/只動物/日的降鈣素的組中開展多器官比較性基因譜分析。所選則用于分析的器官是肝、腎、垂體、骨骼肌、骨、十二指腸、脾和氣管。
表13
表13
表13
表13
表13
表13
表13
表13
此外，評估了PTS893在骨內(nèi)的效應(yīng)。
表14
表14
表14
表14
表14
表14
表14
表14
-數(shù)字＝下調(diào)倍數(shù)
+數(shù)字＝上調(diào)倍數(shù)
實時PCR
基于DNA微芯片信息，選擇一套轉(zhuǎn)錄物用于通過實時PCR(RT-PCT)定量分析。
簡而言之，該方法利用嵌入雙鏈DNA的SyBr綠色染料。通過監(jiān)測SyBr綠色染料熒光的增加直接檢測PCR產(chǎn)物的積累。反應(yīng)以循環(huán)期間首先檢測到PCR產(chǎn)物擴增的時間點為特征，而不是以經(jīng)過固定輪次循環(huán)后積累的PCR產(chǎn)物量為特征。核酸靶標的最初拷貝數(shù)越高，觀察到熒光顯著性增加的時間越短。
使用Applied Biosystem試劑盒(Applied Biosystems#N808-0234)按照制造商推薦從每份RNA樣品產(chǎn)生cDNA。如下使用SyBr GreenUniversal PCR Master混合物(Applied Biosystems#4309155)制備PCR混合物5μl cDNA模板、400nM每種引物、0.2mM脫氧核苷酸三磷酸、1mM MgCl2和0.5U Taq DNA聚合酶、5μl SyBr Green PCR緩沖液和無RNA酶水至終體積50μl。使用ABI Prism 7700序列檢測系統(tǒng)進行進行PCR，在95℃、10分鐘的步驟后，如下進行40個循環(huán)95℃，30秒；60℃，1分鐘。同時進行陰性對照即在PCR反應(yīng)混合物中以水替代cDNA樣品。
基于循環(huán)閾值決定起始模板濃度。循環(huán)閾值是最初探測到高于背景的熒光的PCR循環(huán)，并且已經(jīng)證實其與樣品中存在的目標拷貝數(shù)成反比。通過計算未知靶標相對于絕對標準物的濃度并通過針對有效內(nèi)源性對照如看家基因(β-肌動蛋白)進行歸一化進行定量。因為已經(jīng)計算出目的基因的分子數(shù)除以β-肌動蛋白基因分子數(shù)的比率，所以結(jié)果表示為對照的百分數(shù)。
基于DNA微芯片數(shù)據(jù)，選擇如下轉(zhuǎn)錄物集合用于通過RT-PCR進行定量分析粘附受體CD44、血管生成素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白5、碳酸酐酶II、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白、組織蛋白酶K、骨橋蛋白、α-2I前原型膠原、Spi-B和Y-盒結(jié)合蛋白。
表15
n.a.不可用
在大多數(shù)情況下RT-PCR證實了在基因譜分析中所觀察到的變化，如在骨形態(tài)發(fā)生蛋白5、碳酸酐酶II、組織蛋白酶K、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白、α-2I型前原膠原、Spi-B和Y盒結(jié)合蛋白的例子中即如此。然而未檢測到粘附受體CD44、血管生成素-1和骨橋蛋白表達水平的變化。
分析
已知降鈣素影響破骨細胞的分化、存活和再吸收活性，引起破骨細胞活性的下降。Pondel M，Intl.J.Exp.Pathol.，81(6)405-22(2000)。這些效應(yīng)可通過多器官基因譜分析重構(gòu)(表16)。
表16
經(jīng)鮭魚降鈣素治療動物內(nèi)的多器官基因表達譜分析。顯示了表達變化可見的器官。B＝骨；K＝腎；M＝肌肉；P＝垂體；L＝肝；T＝氣管。
鮭魚降鈣素似乎通過調(diào)節(jié)成骨細胞中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白表達而旁分泌性地調(diào)節(jié)破骨細胞再吸收活性，如表17所示。
表17
PU.1參與破骨細胞生成起始階段。Tondravi MM等，Nature，386(6620)81-4(1997)。CSF-1對巨噬細胞成熟為必需；CSF-1與早期破骨細胞前體的其受體c-fms結(jié)合，提供早期破骨細胞前體存活和增殖所必需的信號。Teitelbaum SL，Science，289(5484)1504-1508(2000)。
有趣的是，PTS893還調(diào)節(jié)參與破骨細胞分化和存活的基因SPI1，CSF-1和MMD。此前未見此種破骨細胞的調(diào)節(jié)。
鮭魚降鈣素顯示可調(diào)節(jié)編碼破骨細胞刺激因子(OSF)的基因的表達，其中破骨細胞刺激因子是由破骨細胞產(chǎn)生的間接誘導(dǎo)破骨細胞形成和骨再吸收的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。Reddy S等，J.Cell Physiol.，177(4)636-45(1998)。這可能提示鮭魚降鈣素在調(diào)節(jié)破骨細胞功能中的自分泌效應(yīng)，在這里其為首次描述。
此外，鮭魚降鈣素似乎通過調(diào)節(jié)成骨細胞中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的表達對破骨細胞再吸收活性進行旁分泌性調(diào)節(jié)。碳酸酐酶I，II，H+-ATP酶和組織蛋白酶K是主要的溶解骨礦質(zhì)和基質(zhì)降解的效應(yīng)物。Blair HC等，Biochem.，(2002)。微管蛋白和PAK4基因的調(diào)節(jié)可能與降鈣素對破骨細胞運動性PAK 4有關(guān)。Zaidi M等，Bone，30(5)655-63(2002)；Jaffer ZM和Chernoff J，Intl.J.Biochem.Cell Biol.，34(7)713-7(2002)。
這些結(jié)果顯示了降鈣素對影響成骨細胞功能直接、自分泌性、旁分泌性和內(nèi)分泌性調(diào)節(jié)的基因的調(diào)節(jié)效應(yīng)(表18)。這些數(shù)據(jù)支持骨合成代謝效應(yīng)歸因于降鈣素的假說。
表18
經(jīng)鮭魚降鈣素治療動物內(nèi)的多器官基因表達譜分析。顯示了表達變化可見的器官。B＝骨；K＝腎；M＝肌肉；P＝垂體；L＝肝；T＝氣管。
本實施例的結(jié)果顯示，降鈣素對影響成骨細胞功能直接、自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌性調(diào)節(jié)的基因具有調(diào)節(jié)效應(yīng)。這些數(shù)據(jù)支持骨合成代謝效應(yīng)歸因于降鈣素的假說。
據(jù)認為，生長因子的三個家族即轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是骨發(fā)生的主要局部調(diào)節(jié)物。骨形態(tài)發(fā)生蛋白被認為是主要影響早期前體骨細胞復(fù)制和成骨細胞定型。相反，TGB-β被認為是定型的骨細胞復(fù)制和成骨細胞基質(zhì)產(chǎn)生的最有效誘導(dǎo)物，而IGF似乎整合和擴展了這兩種因子的效應(yīng)。McCarthy TL等，Crit.Rev.Oral Biol.Med.，11(4)409-22(2000)。這些結(jié)果支持如此事實，即鮭魚降鈣素和PTS893均能夠調(diào)節(jié)參與骨代謝的這些局部性和全身性因子。
鮭魚降鈣素調(diào)節(jié)α2-HS糖蛋白(AHSG)(阻斷成骨細胞中的TGF-β依賴性信號)的事實也支持這種作用。缺乏AHSG的小鼠顯示生長板缺陷、隨年齡增長而增加的骨形成和增加的細胞因子依賴性骨發(fā)生。Szweras M等，J.Biol.Chem.，277(22)19991-19997(2002)。
鮭魚降鈣素和PTS893還顯示可調(diào)節(jié)編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的基因的表達。已知VEGF在正常和病理性血管生成中具有關(guān)鍵作用。血管形成對于軟骨內(nèi)成骨過程中成功骨發(fā)生的關(guān)鍵作用已詳細記載。VEGF通過刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生骨合成代謝生長因子而間接地誘導(dǎo)成骨細胞的增殖和分化。Wang DS等，Endocrinology，138(7)2953-62(1997)。此外，VEGF刺激初級的人成骨細胞趨化性遷移，提示其在骨形成和重建中的功能性作用。Mayr-Wohlfahrt U等，Bone，30(3)472-7(2002)。
甲狀旁腺素介導(dǎo)成骨細胞骨再吸收和形成的效應(yīng)已經(jīng)廣泛描述。Swarthout JT等，Gene，282(1-2)1-17(2002)。在這里可以證實PTS893對介導(dǎo)破骨細胞分化和活性的旁分泌性活化的細胞因子如白介素6(IL-6)的效應(yīng)。Greenfield EM等，Life Sci.，651087-102(1999)。PTS893還使核受體(類固醇/甲狀腺素家族)強烈上調(diào)。
表19
降鈣素和甲狀旁腺素受體均屬于G蛋白受體超家族。在受體刺激后，在降鈣素的情況下信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過腺苷酸環(huán)化酶/cAMP/蛋白激酶、磷脂酶C、磷脂酶D和MAPK(作為晚期效應(yīng)者)途徑介導(dǎo)，而在甲狀旁腺素的情況下信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過腺苷酸環(huán)化酶和磷脂酶C介導(dǎo)?；蜃V分析允許重構(gòu)這些途徑，顯示了通過治療所調(diào)節(jié)的并且位于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同水平的基因。
表20
經(jīng)鮭魚降鈣素治療動物內(nèi)的多器官基因表達譜分析。顯示了表達變化可見的器官B＝骨；K＝腎；M＝肌肉；P＝垂體；L＝肝；T＝氣管。
因為還觀察到細胞周期蛋白和細胞周期蛋白相關(guān)蛋白的變化，故鮭魚降鈣素似乎還直接影響細胞周期，如表21中所示。
表21
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)通過Smad蛋白控制成骨細胞增殖和分化。新出現(xiàn)的抗增殖蛋白家族中的成員Tob是成骨細胞中BMP/Smad信號的負調(diào)節(jié)物。經(jīng)鑒定，Smad途徑和作為其調(diào)節(jié)物之一的Tob也是受sCT和PTS893治療所調(diào)節(jié)的基因，與這兩種化合物對骨重建的BMP調(diào)節(jié)的假設(shè)效應(yīng)吻合。因為還觀察到細胞周期蛋白和細胞周期蛋白相關(guān)蛋白的變化，故在本文中兩種化合物似乎直接影響細胞周期。
兩種化合物還調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)成分的合成和降解(表22)。
表22
經(jīng)鮭魚降鈣素治療動物內(nèi)的多器官基因表達譜分析。顯示了表達變化可見的器官。B＝骨；K＝腎；M＝肌肉；P＝垂體；L＝肝；T＝氣管
鮭魚降鈣素還調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)成分的合成和降解，如表23所示。
表23
特別有趣的是對Y-盒結(jié)合蛋白(YB-1)的調(diào)節(jié)，在所分析的兩種治療和在鮭魚降鈣素組內(nèi)的6個器官中的4個器官內(nèi)出現(xiàn)這種調(diào)節(jié)。YB-1是與膠
表20
經(jīng)鮭魚降鈣素治療動物內(nèi)的多器官基因表達譜分析。顯示了表達變化可見的器官。B＝骨；K＝腎；M＝肌肉；P＝垂體；L＝肝；T＝氣管
文中引用的所有參考文獻在文中整體引用作為參考，并且為了全部目的以這樣一種程度引用作為參考，即如同將每個單獨的公開或?qū)＠驅(qū)＠暾埍惶貏e地和單獨地指明為了全部目的整體引用作為參考。此外，文中引用的所有GenBank登錄號、Unigene Cluster編號和蛋白質(zhì)登錄號在文中整體引用作為參考，并且為了全部目的以這樣一種程度引用作為參考，即如同將每一個此種編號被特別地和單獨地指明為了全部目的整體引用作為參考。
本發(fā)明將不受該申請中特定實施方案的限制，其中特定實施方案旨在作為本發(fā)明的單個方面的獨立說明。對于本領(lǐng)技術(shù)人員而言顯而易見，可在不脫離本發(fā)明思路和范圍的情況下對本發(fā)明進行眾多修改和變化。處于本發(fā)明范圍內(nèi)的功能等同的方法和裝置，以及文中所列舉的那些對于本領(lǐng)技術(shù)人員而言從前面的描述和附圖
中顯而易見。此類修改和變化將處于所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明將僅僅受到所述附加權(quán)利要求書以及由該權(quán)利要求書授權(quán)的等同物的全部范圍的限制。
權(quán)利要求
1.降鈣素在制造用于治療需要合成代謝劑治療的疾病的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中疾病是動脈粥樣硬化。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中降鈣素是鮭魚降鈣素。
4.降鈣素在制造用于治療選定患者群體中鈣代謝紊亂的藥物中的用途，其中對患者群體的選擇是基于在施用降鈣素的患者中的指示降鈣素功效的基因表達譜。
5.權(quán)利要求4的用途，其中降鈣素是鮭魚降鈣素。
6.權(quán)利要求4或5的用途，其中在確定患者基因表達譜之前將降鈣素以治療劑量施用。
7.權(quán)利要求4或5的用途，其中在確定患者基因表達譜之前將降鈣素以亞治療劑量施用。
8.甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物在制造用于治療選定患者群體中鈣代謝紊亂的藥物中的用途，其中對患者群體的選擇是基于在施用甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物的患者中的指示甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物功效的基因表達譜。
9.權(quán)利要求8的用途，其中甲狀旁腺素類似物是PTS893。
10.權(quán)利要求8或9的用途，其中在確定患者的基因表達譜之前將甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物以治療劑量施用。
11.權(quán)利要求8或9的用途，其中在確定患者的基因表達譜之前將甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物以亞治療劑量施用。
12.治療受試者中疾病的方法，其中疾病是需要施用降鈣素、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素類似物或其組合的一種疾病，所述方法包括如下步驟
(a)向受試者施用化合物；
(b)獲得受試者的基因表達譜，其中基因表達譜包含一個或多個基因的基因表達模式，其中一個或多個基因的基因表達模式是施用化合物的結(jié)果；
(c)將已施用化合物的受試者的基因表達譜與指示降鈣素、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素類似物或其組合治療功效的生物標志的基因表達譜進行比較；其中已施用化合物的受試者的基因表達譜與生物標志基因表達譜的相似性指示著用化合物治療的功效。
13.權(quán)利要求12的方法，其中疾病是需要鮭魚降鈣素治療的一種疾病。
14.權(quán)利要求12的方法，其中疾病是需要PTS893治療的一種疾病。
15.權(quán)利要求12至14中任意一項所述的方法，其中所施用的化合物是降鈣素、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素類似物或其組合。
16.權(quán)利要求15的方法，其中降鈣素是鮭魚降鈣素。
17.權(quán)利要求15的方法，其中甲狀旁腺素類似物是PTS893。
18.權(quán)利要求12至17中任意一項所述的方法，其中受試者是哺乳動物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中哺乳動物是靈長類動物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中靈長類動物是食蟹猴或人。
21.權(quán)利要求12至20中任意一項所述的方法，其中生物標志基因表達譜是施用化合物之前受試者的基線基因表達譜。
22.權(quán)利要求12至20中任意一項所述的方法，其中生物標志基因表達譜是已施用降鈣素、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素類似物或其組合的脊椎動物的基因表達譜或平均基因表達譜。
23.權(quán)利要求12至22中任意一項所述的方法，其中基因表達譜包含選自下列的一個或多個基因酸性磷酸酶1同工型a；II型激活蛋白A受體樣1；IIB型激活蛋白A受體前體；激活蛋白βC鏈；α2HS糖蛋白；琺瑯蛋白；膜聯(lián)蛋白V；芳基硫酸酯酶E前體；液泡H(+)ATP酶；液泡H(+)ATP酶亞基；ATP酶，H+轉(zhuǎn)運，溶酶體；ATP酶，H+轉(zhuǎn)運，溶酶體；ATP酶，H+轉(zhuǎn)運，溶酶體；雙糖鏈蛋白聚糖；骨形態(tài)發(fā)生蛋白1；骨形態(tài)發(fā)生蛋白10；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2A；骨形態(tài)發(fā)生蛋白5；骨形態(tài)發(fā)生蛋白6前體；鈣結(jié)合蛋白1(calbrain)；鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ；鈣網(wǎng)蛋白；cAMP應(yīng)答元件調(diào)節(jié)物(CREM)；碳酸酐酶I；碳酸酐酶II；軟骨寡聚基質(zhì)蛋白前體；組織蛋白酶K；組織蛋白酶W；CDC樣激酶1；CDC樣激酶2同工型hclk2/139；硫酸軟骨素蛋白聚糖2(多能聚糖)；硫酸軟骨素蛋白聚糖3(神經(jīng)聚糖)；絨膜生長催乳激素1；胰凝乳蛋白酶C(降鈣蛋白)；膠原I型與PDGFB融合轉(zhuǎn)錄物；膠原II型α1；膠原III型α1；膠原IV型α2；膠原IX型α1；膠原VI型α1；膠原VI型α2(AA 570998)；膠原XI型α1；膠原XI型α2；膠原XI型α2；膠原I型α2；膠原IV型α1；膠原IX型α2；膠原V型α2；膠原VI型α1；膠原VI型α1前體；膠原XVI型α1；膠原XVI型α1；膠原酶3(基質(zhì)金屬蛋白酶13)；結(jié)締組織生長因子；細胞周期蛋白A2；細胞周期蛋白B1；細胞周期蛋白D2；細胞周期蛋白E2；細胞周期蛋白依賴性激酶5；細胞周期蛋白依賴性激酶5，調(diào)節(jié)亞基1(p35)；細胞周期蛋白依賴性激酶6；細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物1A(p21，Cip1)；抑半胱氨酸蛋白酶蛋白B(stefin B)；細胞因子誘導(dǎo)的激酶；死亡相關(guān)蛋白激酶1；死亡相關(guān)蛋白激酶3；牙質(zhì)基質(zhì)酸性磷蛋白1(DMP1)；雙特異性磷酸酶9；強直性肌營養(yǎng)不良蛋白激酶；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1；內(nèi)皮分化G蛋白偶聯(lián)受體6前體；雌激素受體；雌激素受體；雌激素受體相關(guān)蛋白；雌激素應(yīng)答B(yǎng)盒蛋白(EBBP)；成纖維細胞激活蛋白；成纖維細胞生長因子1(酸性)；成纖維細胞生長因子18；成纖維細胞生長因子4；成纖維細胞生長因子受體；卵泡抑素樣1；卵泡抑素樣1；代謝型谷氨酸受體1；GPI1 N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶組分Gpi1；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(CSF1)；生長停滯與DNA損傷誘導(dǎo)蛋白α；生長因子受體結(jié)合蛋白10；硫酸肝素蛋白聚糖2(基底膜聚糖)；肌醇1，4，5三磷酸受體，1型；肌醇1，4，5三磷酸受體，1型；肌醇1，4，5三磷酸受體，2型；肌醇1，4，5三磷酸3激酶同工酶；肌醇多磷酸4磷酸酶I型β；肌醇多磷酸5磷酸酶；肌醇(肌型)1(或4)單磷酸酶1；肌醇(肌型)1(或4)單磷酸酶2；胰島素樣生長因子(IGF II)；胰島素樣生長因子2(生長調(diào)節(jié)素A)；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2；胰島素樣生長因子II前體；胰島素樣生長因子II前體；整合素α10亞基；白細胞介素1受體相關(guān)激酶；Janus激酶3；LIM蛋白(類似于大鼠蛋白激酶C結(jié)合的enigma)；賴氨酰氧化酶樣蛋白；MAD，mothers against decapentaplegic同系物3；MAGUK(膜相關(guān)鳥苷酸激酶同系物)；MAP激酶激酶激酶(MTK1)；MAPK13促分裂原活化蛋白激酶13；MAPK8IP1促分裂原活化蛋白激酶8相互作用蛋白1；MEK激酶；金屬蛋白酶；促分裂原活化蛋白激酶1；促分裂原活化蛋白激酶8；促分裂原活化蛋白激酶激酶1；促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4；促分裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶2；促分裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶3；MMD單核細胞至巨噬細胞分化相關(guān)；神經(jīng)軟骨膠；胞質(zhì)中鈣依賴磷酸酶依賴性的活化T細胞的細胞核因子1；OS 4蛋白(OS4)；OSF 2os成骨細胞特異性因子2(periostin)；破骨細胞刺激因子(OSF)；PAK4；PDGF相關(guān)蛋白；磷脂酰肌醇4激酶，催化性β多肽；磷脂酰肌醇聚糖，L類；磷脂酰肌醇多磷酸5磷酸酶，同工型b；磷脂酰肌醇4磷酸5激酶同工型C(1)；磷脂酰肌醇4磷酸5激酶，I型，β；磷脂酰肌醇4磷酸5激酶，II型，β；磷脂酰肌醇聚糖C類(PIG C)；cAMP特異性磷酸二酯酶4A；cAMP特異性磷酸二酯酶4D(dunce(果蠅)同系物磷酸二酯酶E3)；鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸二酯酶IB；磷酸肌醇3激酶；磷酸肌醇3激酶，催化性γ多肽；磷酸肌醇3激酶，3類；磷脂酶Cb3；磷脂酶C，β4；磷脂酶D；磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白；PKD2蛋白激酶D2；前原膠原I型α2；前原膠原I型α1；前膠原α1 II型；前膠原賴氨酸5雙加氧酶；前膠原脯氨酸，2酮戊二酸4雙加氧酶(脯氨酸4羥化酶)，α多肽I；孕酮相關(guān)子宮內(nèi)膜蛋白(胎盤蛋白14，妊娠相關(guān)子宮內(nèi)膜α2球蛋白，α子宮蛋白)；氨?；彼岫拿?亞氨二肽酶)PEPD；增殖細胞核抗原；脯氨酰4羥化酶β；絲氨酸蛋白酶11(IGF結(jié)合)；蛋白酶體(prosome，macropain)亞基，β型，10；活化STAT蛋白質(zhì)抑制物X；蛋白激酶1PCTAIRE；蛋白激酶C底物80K H；蛋白激酶C，α；cAMP依賴性蛋白激酶，催化亞基γ；cAMP依賴性蛋白激酶，調(diào)節(jié)亞基，I型，β；cAMP依賴性蛋白激酶，調(diào)節(jié)亞基，II型，α；G蛋白偶聯(lián)的嘌呤能受體P2Y，11；RAC2Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物2(rho家族，小GTP結(jié)合蛋白Rac2)；受體酪氨酸激酶DDR；類視黃醇X受體γ；核糖體蛋白S6激酶；核糖體蛋白S6激酶，90kD，多肽3；SCAMP1分泌性載體膜蛋白1(囊泡運輸)；分泌磷蛋白1(骨橋蛋白，骨唾液酸蛋白I，早期T淋巴細胞激活因子1)；絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制物，進化枝H(熱休克蛋白47)，成員2；絲氨酸/蘇氨酸激酶38；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；SF1類固醇生成因子1；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白2，113kD；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5A；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5A；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6(STAT6)；Smad 3；Smad錨定受體激活物，同工型1；Smad5；SMAD6(抑制BMP/Smad1(MADH1))；SNF1相關(guān)激酶；Spi B轉(zhuǎn)錄因子(Spi 1/PU.1相關(guān))；Stat5b(stat5b)；Ste20相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶；TEIG；TGFB可誘導(dǎo)的早期生長應(yīng)答；TGFB可誘導(dǎo)的早期生長應(yīng)答；TIEG；TGFB1誘導(dǎo)的抗凋亡因子1；TGFβ誘導(dǎo)的凋亡蛋白12；TGFβ前體；TGFβ超家族蛋白；Tob；tousled樣激酶1；轉(zhuǎn)化生長因子，β受體III(β聚糖，300kD)；轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGFβ3)；TRIO三重功能結(jié)構(gòu)域(PTPRF相互作用)；微管蛋白α1；微管蛋白α3；微管蛋白α同種型H2α；微管蛋白β2；微管蛋白β3；微管蛋白β4；微管蛋白β，輔助因子D；VI型膠原α2鏈前體；遍在蛋白載體蛋白E2C；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子B和Y盒結(jié)合蛋白1。
24.權(quán)利要求23的方法，其中基因表達譜包含選自下列的一個或多個基因表達的增加骨形態(tài)發(fā)生蛋白5；軟骨寡聚基質(zhì)蛋白；組織蛋白酶K；α-2I型前原膠原和Y盒結(jié)合蛋白(骨和腎)。
25.權(quán)利要求23的方法，其中骨內(nèi)基因表達譜包含選自下列的一個或多個基因表達的降低碳酸酐酶II；Spi-B和Y盒結(jié)合蛋白(肌肉)。
26.權(quán)利要求23的方法，其中骨內(nèi)基因表達譜包含選自下列的一個或多個基因PU.1(SPI1；Spi-B)；粒細胞至巨噬細胞集落刺激因子(CSF1)和單核細胞至巨噬細胞分化相關(guān)蛋白(MMD)。
27.權(quán)利要求23的方法，其中骨內(nèi)基因表達譜包含破骨細胞刺激因子(OSF)表達的變化。
28.權(quán)利要求23的方法，其中骨內(nèi)基因表達譜包含血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的變化。
29.權(quán)利要求23的方法，其中骨內(nèi)基因表達譜包含選自下列的基因表達的變化整合素；膠原酶；基質(zhì)金屬蛋白酶I和II；前膠原內(nèi)肽酶/蛋白酶；賴氨酰羥化酶；聚集蛋白聚糖；軟骨寡聚基質(zhì)蛋白前體；膠原I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、IX型、X型、XI型、XIII型、XIV型、XV型和XVI型；硫酸軟骨素蛋白聚糖；皮膚橋蛋白；硫酸肝素蛋白聚糖和粘結(jié)蛋白聚糖。
30.權(quán)利要求23的方法，其中骨內(nèi)基因表達譜包含選自下列的基因的表達變化琺瑯蛋白；牙質(zhì)；外核苷酸焦磷酸酶和VEGF。
31.選擇受試者入選臨床試驗的方法，該臨床試驗用于確定化合物在治療需要施用降鈣素、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素類似物或其組合的疾病中的功效，所述方法包括如下步驟
(a)向受試者施用化合物；
(b)獲得受試者的基因表達譜，其中基因表達譜包含一個或多個基因的基因表達模式，其中一個或多個基因的基因表達模式是施用化合物的結(jié)果；
(c)將已施用化合物的受試者的基因表達譜與生物標志基因表達譜比較；以及
(d)然后
(i)當已施用化合物的受試者的基因表達譜類似于指示降鈣素、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素類似物或其組合治療功效的生物標志基因表達譜時，該受試者被入選進入臨床試驗；或
(ii)當已施用化合物的受試者的基因表達譜不同于指示降鈣素、甲狀旁腺素、甲狀旁腺素類似物或其組合治療功效的生物標志基因表達譜時，該受試者被排除于臨床試驗之外。
32.權(quán)利要求31的方法，其中化合物以亞治療劑量向受試者施用。
33.用于確定化合物是否具有類似于降鈣素治療功效的治療功效的方法，其包括如下步驟
(a)向受試者施用化合物；
(b)獲得受試者的基因表達譜，其中基因表達譜包含一個或多個基因的基因表達模式，其中一個或多個基因的基因表達模式是施用化合物的結(jié)果。
(c)將已施用化合物的受試者的基因表達譜與指示降鈣素治療功效的生物標志基因表達譜比較；以及
(d)然后
(i)當已施用化合物的受試者的基因表達譜類似于已施用降鈣素的受試者的生物標志基因表達譜時，則確定化合物具有類似于降鈣素治療功效的治療功效；或
(ii)當已施用化合物的受試者的基因表達譜不同于已施用降鈣素的受試者的生物標志基因表達譜時，則確定化合物具有不同于降鈣素治療功效的治療功效。
34.權(quán)利要求33的方法，其中降鈣素是鮭魚降鈣素。
35.權(quán)利要求33或34的方法，其中受試者是哺乳動物。
36.權(quán)利要求35的方法，其中哺乳動物是靈長類動物。
37.權(quán)利要求36的方法，其中靈長類動物是食蟹猴或人。
38.權(quán)利要求33至37中任一項所述的方法，其中化合物以亞治療劑量向受試者施用。
39.用于確定化合物是否具有類似于甲狀旁腺素類似物治療功效的治療功效的方法，其包括如下步驟
(a)向受試者施用化合物；
(b)獲得受試者的基因表達譜，其中基因表達譜包含一個或多個基因的基因表達模式，其中一個或多個基因的基因表達模式是施用化合物的結(jié)果。
(c)將已施用化合物的受試者的基因表達譜與指示甲狀旁腺素類似物治療功效的生物標志基因表達譜比較；以及
(d)然后
(i)當已施用化合物的受試者的基因表達譜類似于已施用甲狀旁腺素類似物的受試者的生物標志基因表達譜時，則確定化合物具有類似于甲狀旁腺素類似物治療功效的治療功效；或
(ii)當已施用化合物的受試者的基因表達譜不同于已施用甲狀旁腺素類似物的受試者的生物標志基因表達譜時，則確定化合物具有不同于甲狀旁腺素類似物的治療功效的治療功效。
40.權(quán)利要求39的方法，其中甲狀旁腺素類似物是PTS893。
41.權(quán)利要求39或40的方法，其中受試者是哺乳動物。
42.權(quán)利要求41的方法，其中哺乳動物是靈長類動物。
43.權(quán)利要求42的方法，其中靈長類動物是食蟹猴或人。
44.權(quán)利要求39的方法，其中化合物以亞治療劑量向受試者施用。
45.用于確定需要施用降鈣素、甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物的疾病的治療功效的試劑盒，其包含
(a)檢測需要施用降鈣素、甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物的疾病的治療功效生物標志的試劑；
(b)盛放試劑的容器；以及
(c)在容器表面或內(nèi)部的書面產(chǎn)品，其描述生物標志在確定疾病治療策略中的用途。
46.權(quán)利要求45的試劑盒，其中試劑是基因芯片。
47.權(quán)利要求45的試劑盒，其中試劑是雜交探針。
48.權(quán)利要求45的試劑盒，其中試劑是基因擴增試劑。
49.權(quán)利要求45至48中任一項所述的試劑盒，其中生物標志包含選自下列的一個或多個基因酸性磷酸酶1同工型a；II型激活蛋白A受體樣1；IIB型激活蛋白A受體前體；激活蛋白βC鏈；α2HS糖蛋白；琺瑯蛋白；膜聯(lián)蛋白V；芳基硫酸酯酶E前體；液泡H(+)ATP酶；液泡H(+)ATP酶亞基；ATP酶，H+轉(zhuǎn)運，溶酶體；ATP酶，H+轉(zhuǎn)運，溶酶體；ATP酶，H+轉(zhuǎn)運，溶酶體；雙糖鏈蛋白聚糖；骨形態(tài)發(fā)生蛋白1；骨形態(tài)發(fā)生蛋白10；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2A；骨形態(tài)發(fā)生蛋白5；骨形態(tài)發(fā)生蛋白6前體；鈣結(jié)合蛋白1(calbrain)；鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ；鈣網(wǎng)蛋白；cAMP應(yīng)答元件調(diào)節(jié)物(CREM)；碳酸酐酶I；碳酸酐酶II；軟骨寡聚基質(zhì)蛋白前體；組織蛋白酶K；組織蛋白酶W；CDC樣激酶1；CDC樣激酶2同工型hclk2/139；硫酸軟骨素蛋白聚糖2(多能聚糖)；硫酸軟骨素蛋白聚糖3(神經(jīng)聚糖)；絨膜生長催乳激素1；胰凝乳蛋白酶C(降鈣蛋白)；膠原I型與PDGFB融合轉(zhuǎn)錄物；膠原II型α1；膠原III型α1；膠原IV型α2；膠原IX型α1；膠原VI型α1；膠原VI型α2(AA 570998)；膠原XI型α1；膠原XI型α2；膠原XI型α2；膠原，I型，α2；膠原，IV型，α1；膠原，IX型，α2；膠原，V型，α2；膠原，VI型，α1；膠原，VI型，α1前體；膠原，XVI型，α1；膠原，XVI型，α1；膠原酶3(基質(zhì)金屬蛋白酶13)；結(jié)締組織生長因子；細胞周期蛋白A2；細胞周期蛋白B1；細胞周期蛋白D2；細胞周期蛋白E2；細胞周期蛋白依賴性激酶5；細胞周期蛋白依賴性激酶5，調(diào)節(jié)亞基1(p35)；細胞周期蛋白依賴性激酶6；細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物1A(p21，Cip1)；抑半胱氨酸蛋白酶蛋白B(stefin B)；細胞因子誘導(dǎo)的激酶；死亡相關(guān)蛋白激酶1；死亡相關(guān)蛋白激酶3；牙質(zhì)基質(zhì)酸性磷蛋白1(DMP1)；雙特異性磷酸酶9；強直性肌營養(yǎng)不良蛋白激酶；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1；內(nèi)皮分化G蛋白偶聯(lián)受體6前體；雌激素受體；雌激素受體；雌激素受體相關(guān)蛋白；雌激素應(yīng)答B(yǎng)盒蛋白(EBBP)；成纖維細胞激活蛋白；成纖維細胞生長因子1(酸性)；成纖維細胞生長因子18；成纖維細胞生長因子4；成纖維細胞生長因子受體；卵泡抑素樣1；卵泡抑素樣1；代謝型谷氨酸受體1；GPI1 N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶組分Gpi1；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(CSF1)；生長停滯與DNA損傷誘導(dǎo)蛋白α；生長因子受體結(jié)合蛋白10；硫酸肝素蛋白聚糖2(基底膜聚糖)；肌醇1，4，5三磷酸受體，1型；肌醇1，4，5三磷酸受體，1型；肌醇1，4，5三磷酸受體，2型；肌醇1，4，5三磷酸3激酶同工酶；肌醇多磷酸4磷酸酶I型β；肌醇多磷酸5磷酸酶；肌醇(肌型)1(或4)單磷酸酶1；肌醇(肌型)1(或4)單磷酸酶2；胰島素樣生長因子(IGF II)；胰島素樣生長因子2(生長調(diào)節(jié)素A)；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2；胰島素樣生長因子II前體；胰島素樣生長因子II前體；整合素α10亞基；白細胞介素1受體相關(guān)激酶；Janus激酶3；LIM蛋白(類似于大鼠蛋白激酶C結(jié)合的enigma)；賴氨酰氧化酶樣蛋白；MAD，mothers against decapentaplegic同系物3；MAGUK(膜相關(guān)鳥苷酸激酶同系物)；MAP激酶激酶激酶(MTK1)；MAPK13促分裂原活化蛋白激酶13；MAPK8IP1促分裂原活化蛋白激酶8相互作用蛋白1；MEK激酶；金屬蛋白酶；促分裂原活化蛋白激酶1；促分裂原活化蛋白激酶8；促分裂原活化蛋白激酶激酶1；促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4；促分裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶2；促分裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶3；MMD單核細胞至巨噬細胞分化相關(guān)；神經(jīng)軟骨膠；胞質(zhì)中鈣依賴磷酸酶依賴性的活化T細胞的細胞核因子1；OS 4蛋白(OS 4)；OSF 2os成骨細胞特異性因子2(periostin)；破骨細胞刺激因子(OSF)；PAK4；PDGF相關(guān)蛋白；磷脂酰肌醇4激酶，催化性β多肽；磷脂酰肌醇聚糖，L類；磷脂酰肌醇多磷酸5磷酸酶，同工型b；磷脂酰肌醇4磷酸5激酶同工型C(1)；磷脂酰肌醇4磷酸5激酶，I型，β；磷脂酰肌醇4磷酸5激酶，II型，β；磷脂酰肌醇聚糖C類(PIG C)；cAMP特異性磷酸二酯酶4A；cAMP特異性磷酸二酯酶4D(dunce(果蠅)同系物磷酸二酯酶E3)；鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸二酯酶IB；磷酸肌醇3激酶；磷酸肌醇3激酶，催化性γ多肽；磷酸肌醇3激酶，3類；磷脂酶Cb3；磷脂酶C，β4；磷脂酶D；磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白；PKD2蛋白激酶D2；前原膠原I型α2；前原膠原I型α1；前膠原α1 II型；前膠原賴氨酸5雙加氧酶；前膠原脯氨酸，2酮戊二酸4雙加氧酶(脯氨酸4羥化酶)，α多肽I；孕酮相關(guān)子宮內(nèi)膜蛋白(胎盤蛋白14，妊娠相關(guān)子宮內(nèi)膜α2球蛋白，α子宮蛋白)；氨?；彼岫拿?亞氨二肽酶)PEPD；增殖細胞核抗原；脯氨酰4羥化酶β；絲氨酸蛋白酶11(IGF結(jié)合)；蛋白酶體(prosome，macropain)亞基，β型，10；活化STAT蛋白質(zhì)抑制物X；蛋白激酶1PCTAIRE；蛋白激酶C底物80K H；蛋白激酶C，α；cAMP依賴性蛋白激酶，催化亞基γ；cAMP依賴性蛋白激酶，調(diào)節(jié)亞基，I型，β；cAMP依賴性蛋白激酶，調(diào)節(jié)亞基，II型，α；G蛋白偶聯(lián)的嘌呤能受體P2Y，11；RAC2 Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物2(rho家族，小GTP結(jié)合蛋白Rac2)；受體酪氨酸激酶DDR；類視黃醇X受體γ；核糖體蛋白S6激酶；核糖體蛋白S6激酶，90kD，多肽3；SCAMP1分泌性載體膜蛋白1(囊泡運輸)；分泌磷蛋白1(骨橋蛋白，骨唾液酸蛋白I，早期T淋巴細胞激活因子1)；絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制物，進化枝H(熱休克蛋白47)，成員2；絲氨酸/蘇氨酸激酶38；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；SF1類固醇生成因子1；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白2，113kD；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5A；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5A；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6(STAT6)；Smad 3；Smad錨定受體激活物，同工型1；Smad5；SMAD6(抑制BMP/Smad1(MADH1))；SNF1相關(guān)激酶；Spi B轉(zhuǎn)錄因子(Spi 1/PU.1相關(guān))；Stat5b(stat5b)；Ste20相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶；TEIG；TGFB可誘導(dǎo)的早期生長應(yīng)答；TGFB可誘導(dǎo)的早期生長應(yīng)答；TIEG；TGFB1誘導(dǎo)的抗凋亡因子1；TGFβ誘導(dǎo)的凋亡蛋白12；TGFβ前體；TGFβ超家族蛋白；Tob；tousled樣激酶1；轉(zhuǎn)化生長因子，β受體III(β聚糖，300kD)；轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGFβ3)；TRIO三重功能結(jié)構(gòu)域(PTPRF相互作用)；微管蛋白α1；微管蛋白α3；微管蛋白α同種型H2α；微管蛋白β2；微管蛋白β3；微管蛋白β4；微管蛋白β，輔助因子D；VI型膠原α2鏈前體；遍在蛋白載體蛋白E2C；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子B和Y盒結(jié)合蛋白1。
全文摘要
對施用鮭魚降鈣素或甲狀旁腺素類似物的受試者進行的多器官基因譜分析結(jié)果提供了降鈣素治療功效以及甲狀旁腺素或甲狀旁腺素類似物治療功效的生物標志。其中生物標志是Y－盒結(jié)合蛋白、BMP、FGF、IGF、VEGF、α－2－HS糖蛋白(AHSG)、OSF核受體(類固醇/甲狀腺素家族)基因和其它基因的表達譜。所得到的結(jié)果支持鮭魚降鈣素對骨代謝的合成代謝效應(yīng)。
文檔編號A61P19/08GK1905894SQ20048004091
公開日2007年1月31日 申請日期2004年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月25日
發(fā)明者M·博巴迪拉 申請人:諾瓦提斯公司