專利名稱：一種水蛭多肽凍干粉針制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水蛭多肽凍干粉針制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
水蛭(學(xué)名)又名螞蟥，是一種生長(zhǎng)于沼澤、湖泊或水田中的環(huán)節(jié)動(dòng)物，以吸食人畜的血液為生。水蛭是較強(qiáng)的活血化瘀藥物，據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“水蛭味咸平，主逐惡血，月閉，破血瘕集聚，無(wú)子，利水道?！睔W洲的JohnHaycraft博士在1884年發(fā)現(xiàn)歐洲醫(yī)用水蛭會(huì)分泌出某種阻止血液凝結(jié)的物質(zhì)以利于水蛭吸食血液消化。在20世紀(jì)初人們發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，并命名為水蛭素(Chirudin)。它能阻止凝血酶對(duì)血小板的作用，抑制血小板受凝血酶的刺激而釋放，從而延緩或阻止血液的凝固。
當(dāng)今世界正步入老年社會(huì)，僅我國(guó)50歲以上的人口就有3億之多。血栓病是老年人的常見病，全世界有血栓栓塞性病人約1500萬(wàn)所需溶栓劑的潛在市場(chǎng)約20億美元。目前在臨床上還沒(méi)有治療血栓栓塞的特效藥，早期的抗(溶)血栓藥物有纖維蛋白原溶解酶、尿激酶、鏈激酶等，但它們的臨床應(yīng)用有幾個(gè)顯著的缺點(diǎn)，如凝血酶會(huì)高比例再生等。而小的合成抑制因子如三肽d-Phe-Pro-Arg雖然具有高選擇的抗凝血酶活性，但其半衰期僅有幾分鐘。
重組水蛭素已經(jīng)在臨床應(yīng)用，國(guó)內(nèi)已有多家獲新藥證書。但是，重組水蛭素與天然水蛭素相比，卻存在著天生性的缺陷。第一，由于重組水蛭素的二級(jí)結(jié)構(gòu)與凝血酶不具有互補(bǔ)性，其作用效果遠(yuǎn)不及天然水蛭素理想；第二，由于受發(fā)酵提取環(huán)節(jié)的的影響，批與批之間產(chǎn)品不一致，導(dǎo)致質(zhì)量、效果都難以保證；第三，重組水蛭素的抗凝血作用時(shí)間短，推測(cè)機(jī)制可能是由于重組水蛭素與凝血酶結(jié)合不完全，不能完全阻礙凝血酶活性中心。
天然水蛭素盡管目前研究不少，但至今為止還沒(méi)有天然水蛭素藥品應(yīng)用于臨床。其原因在于第一，天然水蛭素提取十分困難，而且受天然水蛭來(lái)源影響，提取過(guò)程中的工序復(fù)雜，提取過(guò)程中導(dǎo)致水蛭素失效等因素，導(dǎo)致獲得純化的水蛭素非常困難，不僅價(jià)格昂貴，而且沒(méi)有產(chǎn)品，甚至連標(biāo)準(zhǔn)品都沒(méi)有購(gòu)到。這種情況不僅在國(guó)內(nèi)如此，國(guó)外亦是如此。第二，目前文獻(xiàn)中所稱的天然水蛭素實(shí)際上絕大部分為水蛭多肽。第三，天然水蛭多肽純化后還有不穩(wěn)定現(xiàn)象。
申請(qǐng)?zhí)枮?5117701的專利公開了采用親合色譜法純化水蛭素，但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，只適用于實(shí)驗(yàn)室，不能進(jìn)一步中試放大和生產(chǎn)，不利于產(chǎn)業(yè)化推廣。專利申請(qǐng)?zhí)枮?3113566的專利公開了提取純化水蛭素的方法，但該方法在實(shí)際操作過(guò)程中因?yàn)檫\(yùn)用有機(jī)溶劑使得環(huán)境要求特別高，并且只應(yīng)用了陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF層析(凝膠過(guò)濾柱層析只是分子篩的作用)進(jìn)行純化，雜質(zhì)沒(méi)有分離完全，水蛭素的純度不高，也未見該專利關(guān)于水蛭素純度的報(bào)道。申請(qǐng)專利號(hào)200410037695.7的專利公開了一種水蛭素凍干粉針制劑及其制備方法，其特征在于從鮮水蛭提取水蛭素，純化后加或不加藥用輔料，制備成水蛭素凍干粉針制劑，此專利所述的水蛭素凍干粉針制劑實(shí)際上也是指水蛭多肽，該制備方法得到的水蛭多肽凝血酶比活為1∶16，影響凝血酶比活的原因可能是純化過(guò)程中使用的凝膠柱并沒(méi)有達(dá)到理想的分離純化效果，或者沒(méi)有找到真正適合該多肽提取純化的凝膠柱，所以提取純度的原因直接影響了藥理活性。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述原因，本發(fā)明在原有制備方法的基礎(chǔ)上，純化過(guò)程中經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)對(duì)陽(yáng)、陰離子凝膠色譜柱的型號(hào)及其填料進(jìn)行篩選，最終優(yōu)選使用兩組分離純化效果最佳的陽(yáng)離子交換葡聚糖凝膠色譜柱C-25、C-50和陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF、A-25。該制備方法簡(jiǎn)單，提取過(guò)程不使用任何有機(jī)試劑；操作過(guò)程無(wú)環(huán)境污染，省時(shí)節(jié)源，采用該純化方法得到的水蛭多肽不但分離純化效果好，同時(shí)收率也得到提高。采用該制備純化方法所得到的水蛭多肽的凝血酶比活為1∶32，比原制備方法作用效果大大加強(qiáng)。
一、工藝制法(1)水蛭多肽凍干粉針制劑的處方組成為處方1水蛭多肽2-4重量份。
處方2水蛭多肽2-4重量份，賦形劑為96-98重量份。
(2)提取物的制備1>稱取水蛭，加入純水，洗去雜質(zhì)，用電動(dòng)絞肉機(jī)充分?jǐn)囁槭钩纱种苿驖{。將粗制勻漿經(jīng)膠體磨勻漿，待勻漿呈粘稠狀態(tài)且無(wú)明顯可見粒狀物時(shí)，即停止研磨，將全部勻漿立即分裝于經(jīng)煮沸消毒的離心瓶中，于-20±5℃冰柜凍結(jié)24-36小時(shí)，再用水溫為25±5℃的振蕩水浴中解凍，反復(fù)凍、融5-7次，最后一次解凍后，用冷凍離心機(jī)離心沉淀，收集上清液；2>將上清液用截留分子量為8000-12000的中空纖維膜進(jìn)行超濾，壓力為0.1MPa，雙向流TWT式，外壓式分離，當(dāng)分離至截留液體積基本達(dá)到原溶液體積的1/4-1/3時(shí)，加入1/3截留液體積的注射用水，繼續(xù)超濾，直至超濾液體積基本達(dá)到上清液量時(shí)停止超濾，超濾結(jié)束后，將超濾液分裝到離心瓶中，凍存于-20±5℃冰柜中。
3>將超濾液用緩沖液調(diào)pH值為5.0-7.0后，分別經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換葡聚糖凝膠色譜柱C-25、C-50和陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF、A-25進(jìn)行分離純化陽(yáng)離子交換葡聚糖凝膠色譜柱C-25、C-50的流動(dòng)相用緩沖液調(diào)pH至6.0-7.0進(jìn)行洗脫，陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF、A-25的流動(dòng)相用緩沖液調(diào)pH至7.0-8.0進(jìn)行梯度洗脫；在紫外檢測(cè)下，自動(dòng)收集具有抗凝血酶活性部分的洗脫液，至紫外檢測(cè)器檢測(cè)不到吸收為止；將各個(gè)單一組分分別進(jìn)行抗凝血酶活性檢測(cè)，將有活性的單一組分合并后除菌過(guò)濾，濾液用反滲透膜機(jī)濃縮脫鹽，或用凝膠柱脫鹽并進(jìn)一步純化，并留樣檢測(cè)，得到水蛭多肽半成品。
(3)凍干粉針劑的制備將上述水蛭多肽半成品與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調(diào)pH值，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑。
用于本發(fā)明提取水蛭多肽的水蛭品種為螞蝗(Whitmania Pigra whitman)、亞洲水牛蛭(菲牛蛭)、日本醫(yī)蛭(Hirudo nipponica Whitman)、柳葉螞蝗(Wh.acranulatc Whitman)、歐洲醫(yī)用水蛭、印度水蛭、寬體金線蛭中的任何一種。
二、檢測(cè)分析采用高效液相色譜法對(duì)水蛭多肽進(jìn)行檢測(cè)。
1.實(shí)驗(yàn)儀器waters600E型高效液相色譜儀，996PDA檢測(cè)器；色譜柱日本TOSOH TSK2000SW 7.5×300；色譜條件工作站millennium chromatograph；波長(zhǎng)260nm；流動(dòng)相0.01mol/L、pH值6.68的磷酸緩沖溶液(配制方法按照中國(guó)生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)2000年版，中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)編，化學(xué)工業(yè)出版社，P13-14配制)。
2.實(shí)驗(yàn)藥物水蛭多肽樣品為本發(fā)明工藝制備的水蛭多肽(廣州天之驕藥物開發(fā)有限公司)。
3.樣品制備取樣品，用多肽純化離心管，進(jìn)行離心分離，取離心液體即為樣品。
4.上樣取上述處理的樣品用微量注射器吸取定量液體，注入進(jìn)樣器進(jìn)行檢測(cè)。
5.結(jié)果對(duì)五批樣品進(jìn)行測(cè)定，采用歸一化法計(jì)算水蛭多肽的純度為98.4％-99.9％。
三、藥理實(shí)施例實(shí)施例一水蛭多肽比活性的檢測(cè)1.實(shí)驗(yàn)原理天然水蛭多肽的活性檢測(cè)國(guó)家尚未公布標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法，根據(jù)凝血酶活性的檢測(cè)方法(中國(guó)生物制品規(guī)程2000年版附錄1)，依據(jù)水蛭多肽與凝血酶是1∶1的比例結(jié)合，消耗一個(gè)凝血酶單位，相等于一個(gè)抗凝血單位(ATU)的原則，采用試管法(連續(xù)稀釋法)檢測(cè)水蛭多肽的抗凝血單位的效價(jià)。
2.實(shí)驗(yàn)材料5g/L纖維蛋白原的生理鹽水溶液，注射用生理鹽水(廣州天之驕藥物開發(fā)有限公司)冷凍干燥凝血酶(安徽桑原生物技術(shù)研究所購(gòu)買，每瓶含量為500IU，用時(shí)用生理鹽水稀釋至每毫升含凝血酶0.5IU)3.待測(cè)樣品水蛭多肽樣品為本發(fā)明工藝制備的水蛭多肽(廣州天之驕藥物開發(fā)有限公司提供)4.檢測(cè)方法取10×80mm試管8支，在每支試管中加入生理鹽水0.2ml(第一管不加)，于第一管中加入待測(cè)樣品0.2ml；第二管中加入0.2ml，充分混勻后吸取0.2ml加入第三管，以次例推，直至加到第7管，將多余的0.2ml混合液廢棄，此時(shí)各試管都為0.2ml，其濃度稀釋比例依次為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，第8管因不含水蛭素，作為試驗(yàn)對(duì)照，加樣結(jié)束后，放到37℃水浴使樣品與凝血酶作用5-10min，再于各試管中加入5g/l纖維蛋白原溶液0.2ml，再放入37℃水浴，觀察記錄1-24小時(shí)結(jié)果，并進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算方法為發(fā)生凝固或沉淀的試管為無(wú)抗凝血酶活性(陰性)，不凝固或無(wú)沉淀產(chǎn)生的試管為具有抗凝血酶活性。
5.結(jié)果經(jīng)過(guò)計(jì)算本發(fā)明的水蛭多肽的效價(jià)比為1∶32。
6.說(shuō)明
(1)由于目前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)中對(duì)于水蛭多肽的效價(jià)大部分應(yīng)用檢測(cè)儀器進(jìn)行檢測(cè)，以5分鐘為判定終點(diǎn)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，5分鐘測(cè)定有抗凝活性，但30分鐘至4小時(shí)仍可能發(fā)生凝固，至24小時(shí)仍能保持抗凝血酶活性。因此本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果是以37℃、24小時(shí)結(jié)果為準(zhǔn)。
(2)研究表明24小時(shí)的檢測(cè)結(jié)果1IU/mg相當(dāng)于儀器檢測(cè)5分鐘檢測(cè)結(jié)果80IU/mg。
實(shí)施例二水蛭多肽制劑對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響。
1.實(shí)驗(yàn)藥物水蛭注射液(吉林省藥物研究所提供)；本發(fā)明水蛭多肽凍干粉針劑(廣州天之驕藥物開發(fā)有限公司提供)2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，體重18～22g，動(dòng)物雌雄兼用，隨機(jī)分為4組。
3.實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)用小鼠30只，動(dòng)物雌雄兼用，隨機(jī)分為3組；生理鹽水作為空白對(duì)照組，水蛭注射液作為陽(yáng)性對(duì)照組。于末次給藥后1h用玻璃毛細(xì)管插入小鼠眼內(nèi)球后靜脈叢，深約4～5mm輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)再縮回，自血液流入管內(nèi)開始計(jì)時(shí)，血液注滿后取出毛細(xì)管平放于桌面上，每隔30s折斷兩端毛細(xì)管約0.5cm，并緩慢向左右拉開。觀察折斷處是否有血凝絲，至血凝絲出現(xiàn)為止，所歷時(shí)間即為血凝時(shí)間，毛細(xì)管兩端數(shù)據(jù)的平均值即為該鼠的血凝時(shí)間，結(jié)果見表1。
表1 水蛭多肽凍干粉針劑對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響(x±s)

注與空白對(duì)照組比較*P＜005，與陽(yáng)性對(duì)照組比較**P＜001；結(jié)論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水蛭多肽制劑可延長(zhǎng)小鼠凝血酶時(shí)間，并且明顯優(yōu)于水蛭注射液陽(yáng)性對(duì)照組。提示水蛭多肽制劑具有較好抗凝血的作用，為其治療血栓性疾病提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
實(shí)施例三水蛭多肽制劑對(duì)大鼠靜脈血栓的影響1.實(shí)驗(yàn)藥物水蛭注射液(吉林省藥物研究所提供)；本發(fā)明水蛭多肽凍干粉針劑(廣州天之驕藥物開發(fā)有限公司提供)2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，體重200～300g，動(dòng)物雌雄兼用。
3.實(shí)驗(yàn)方法取大鼠30只，隨機(jī)分為3組，生理鹽水作為空白對(duì)照組，水蛭注射液為陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組連續(xù)ig給藥3d，于末次給藥后，立即麻醉大鼠，開腹分離下腔靜脈，在左腎靜脈下方用線結(jié)扎，2h后，于結(jié)扎處2cm處結(jié)扎血管，阻斷血流，取出血栓，稱濕重，結(jié)果見表2。
表2 水蛭多肽凍干粉針劑對(duì)大鼠靜脈曲栓的影響(x±s)

注與空白對(duì)照組比較*P＜005，與陽(yáng)性對(duì)照組比較**P＜001；結(jié)論通過(guò)以上藥理實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的水蛭多肽制劑可抑制大鼠靜脈血栓形成，具有很好的溶栓作用，對(duì)血栓具有較強(qiáng)溶解作用，與市售同類品種比較具有更強(qiáng)的藥理作用。
實(shí)施例四水蛭多肽制劑對(duì)家兔體外血栓長(zhǎng)度、干重的影響1.實(shí)驗(yàn)藥物水蛭注射液(吉林省藥物研究所提供)；本發(fā)明水蛭多肽凍干粉針劑(廣州天之驕藥物開發(fā)有限公司提供)2.實(shí)驗(yàn)儀器DS-87BChandler氏體外血栓形成儀(鎮(zhèn)江美達(dá)生物儀器有限公司產(chǎn)品)3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大耳白兔，雄性，2.0～2.5kg(廣州天之驕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)4.實(shí)驗(yàn)方法雄性大耳白兔10只，隨機(jī)均分組給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組(水蛭注射液)。家兔自耳緣靜脈注射給藥(0.5mg/kg)，給藥前及給藥后5、15、30、60及120min分別自心臟取血1.5mL，不加抗凝劑，棄去初始幾滴，迅速將1mL血注入已預(yù)溫(37℃)的塑料管中，管連成環(huán)狀，置Chandler氏體外血栓形成儀轉(zhuǎn)盤上，立即啟動(dòng)轉(zhuǎn)盤，以12r/min旋轉(zhuǎn)10min，儀器自動(dòng)停轉(zhuǎn)，立即取出塑料環(huán)，小心取出血栓，用濾紙吸去殘血，測(cè)量血栓長(zhǎng)度，64℃烘干30min后稱量其干重。以藥前為基準(zhǔn)，計(jì)算給藥后各時(shí)間點(diǎn)的栓長(zhǎng)和血栓干重的抑制百分率(％)，結(jié)果見表3，表4。
表3 水蛭多肽凍干粉針劑對(duì)家兔體外血栓長(zhǎng)度的影響(x±s，n＝5)

注與陽(yáng)性對(duì)照組比較*p＜0.05結(jié)論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的水蛭多肽制劑可抑制家兔靜脈血栓形成，具有很好的溶栓作用，與水蛭注射液比較有顯著性差異，對(duì)血栓具有較強(qiáng)溶解作用。
表4 水蛭多肽凍干粉針劑對(duì)家兔體外血栓干重的影響(x±s，n＝5)


注與陽(yáng)性對(duì)照組比較*p＜0.05結(jié)論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的水蛭多肽制劑可抑制家兔靜脈血栓形成，具有很好的溶栓作用，與水蛭注射液比較有顯著性差異，對(duì)血栓具有較強(qiáng)溶解作用。
四、制備實(shí)施例實(shí)施例1(1)取螞蝗(Whitmania Pigra whitman)5.0公斤，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動(dòng)絞肉機(jī)破碎，再用高速剪切機(jī)制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-25℃冰柜凍結(jié)30小時(shí)，再用水溫為30℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機(jī)離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為10000的中空纖維膜進(jìn)行超濾，超濾至原溶液體積的1/3時(shí)，加水至原體積，反復(fù)操作3次，合并透過(guò)液，濃縮至相對(duì)密度為1.05(20℃)的溶液；將濃縮的透過(guò)液用磷酸鹽緩沖液調(diào)PH值為6.8，離子強(qiáng)度為0.01mol/l，以10ml/min通過(guò)陽(yáng)離子葡聚糖凝膠色譜柱C-25，用緩沖液洗4倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為7.4，以10ml/min通過(guò)陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測(cè)器檢測(cè)不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用反滲透膜機(jī)濃縮脫鹽，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為372克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調(diào)pH值，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實(shí)施例2(1)取日本醫(yī)蛭(Hirudo nipponica Whitman)10.0公斤，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動(dòng)絞肉機(jī)破碎，再用高速剪切機(jī)制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-20℃冰柜凍結(jié)24小時(shí)，再用水溫為25℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融6次，最后一次解凍后，用冷凍離心機(jī)離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為8000的中空纖維膜進(jìn)行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時(shí)，加水至原體積，反復(fù)操作5次，合并透過(guò)液，濃縮至相對(duì)密度為1.10(20℃)的溶液；將濃縮的透過(guò)液磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值6.8，離子強(qiáng)度為0.01mol/l，以10ml/min通過(guò)陽(yáng)離子葡聚糖凝膠色譜柱C-50，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)pH值7.4，以10ml/min通過(guò)陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測(cè)器檢測(cè)不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用反滲透膜機(jī)濃縮脫鹽，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為712克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調(diào)pH值，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實(shí)施例3(1)取柳葉螞蝗(Wh.acranulatc Whitman)6.0公斤，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動(dòng)絞肉機(jī)破碎，再用高速剪切機(jī)制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-22℃冰柜凍結(jié)28小時(shí)，再用水溫為28℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結(jié)，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機(jī)離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為11000的中空纖維膜進(jìn)行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時(shí)，加水至原體積，反復(fù)操作5次，合并透過(guò)液，濃縮至相對(duì)密度為1.06(20℃)的溶液；將濃縮的透過(guò)液磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值6.8，離子強(qiáng)度為0.01mol/l，以10ml/min通過(guò)陽(yáng)離子葡聚糖凝膠色譜柱C-25，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)pH值7.4，以10ml/min通過(guò)陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱A-25，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測(cè)器檢測(cè)不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用反滲透膜機(jī)濃縮脫鹽，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為410克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調(diào)pH值，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實(shí)施例4(1)取歐洲醫(yī)用水蛭6.5公斤，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動(dòng)絞肉機(jī)破碎，再用高速剪切機(jī)制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-25℃冰柜凍結(jié)24小時(shí)，再用水溫為30℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結(jié)，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機(jī)離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為10000的中空纖維膜進(jìn)行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時(shí)，加水至原體積，反復(fù)操作4次，合并透過(guò)液，濃縮至相對(duì)密度為1.06(20℃)的溶液；將濃縮的透過(guò)液磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值6.8，離子強(qiáng)度為0.01mol/l，以10ml/min通過(guò)陽(yáng)離子葡聚糖凝膠色譜柱C-50，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)pH值7.4，以10ml/min通過(guò)陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱A-25，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測(cè)器檢測(cè)不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用反滲透膜機(jī)濃縮脫鹽，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為410克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調(diào)pH值，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實(shí)施例5
(1)取印度水蛭7.5公斤，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動(dòng)絞肉機(jī)破碎，再用高速剪切機(jī)制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-25℃冰柜凍結(jié)24小時(shí)，再用水溫為25℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結(jié)，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機(jī)離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為10000的中空纖維膜進(jìn)行超濾，超濾至原溶液體積的1/3時(shí)，加水至原體積，反復(fù)操作4次，合并透過(guò)液，濃縮至相對(duì)密度為1.0(20℃)的溶液；將濃縮的透過(guò)液磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值6.8，離子強(qiáng)度為0.01mol/l，以10ml/min通過(guò)陽(yáng)離子葡聚糖凝膠色譜柱C-25，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)pH值7.4，以10ml/min通過(guò)陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測(cè)器檢測(cè)不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用凝膠柱脫鹽并進(jìn)一步純化，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為486克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調(diào)pH值，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實(shí)施例6(1)取亞洲水牛蛭(菲牛蛭)10.0公斤，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動(dòng)絞肉機(jī)破碎，再用高速剪切機(jī)制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30℃冰柜凍結(jié)30小時(shí)，再用水溫為25℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結(jié)，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機(jī)離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為10000的中空纖維膜進(jìn)行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時(shí)，加水至原體積，反復(fù)操作4次，合并透過(guò)液，濃縮至相對(duì)密度為1.05(20℃)的溶液；將濃縮的透過(guò)液磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值6.8，離子強(qiáng)度為0.01mol/l，以10ml/min通過(guò)陽(yáng)離子葡聚糖凝膠色譜柱C-25，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)pH值7.4，以10ml/min通過(guò)陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測(cè)器檢測(cè)不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用凝膠柱脫鹽并進(jìn)一步純化，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為726克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調(diào)pH值，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實(shí)施例7(1)取螞蝗(Whitmania Pigra whitman)10.0公斤，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動(dòng)絞肉機(jī)破碎，再用高速剪切機(jī)制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-25℃冰柜凍結(jié)32小時(shí)，再用水溫為20℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結(jié)，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機(jī)離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為12000的中空纖維膜進(jìn)行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時(shí)，加水至原體積，反復(fù)操作4次，合并透過(guò)液，濃縮至相對(duì)密度為1.0(20℃)的溶液；將濃縮的透過(guò)液磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值6.8，離子強(qiáng)度為0.01mol/l，以10ml/min通過(guò)陽(yáng)離子葡聚糖凝膠色譜柱C-50，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)pH值7.4，以10ml/min通過(guò)陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測(cè)器檢測(cè)不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用凝膠柱脫鹽并進(jìn)一步純化，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為712克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調(diào)pH值，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實(shí)施例8(1)取螞蝗(Whitmania Pigra whitman)5.9公斤，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動(dòng)絞肉機(jī)破碎，再用高速剪切機(jī)制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-24℃冰柜凍結(jié)36小時(shí)，再用水溫為30℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結(jié)，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機(jī)離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為9000的中空纖維膜進(jìn)行超濾，超濾至原溶液體積的1/3時(shí)，加水至原體積，反復(fù)操作4次，合并透過(guò)液，濃縮至相對(duì)密度為1.06(20℃)的溶液；將濃縮的透過(guò)液磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值6.8，離子強(qiáng)度為0.01mol/l，以10ml/min通過(guò)陽(yáng)離子葡聚糖凝膠色譜柱C-25，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)pH值7.4，以10ml/min通過(guò)陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱A-25，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測(cè)器檢測(cè)不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用凝膠柱脫鹽并進(jìn)一步純化，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為398克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調(diào)pH值，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
權(quán)利要求
1.一種水蛭多肽凍干粉針制劑，其特征在于該制劑是以水蛭多肽2-4重量份為活性成分的注射制劑；其特征還在于水蛭多肽的凝血酶比活為1∶32。
2.權(quán)利要求1所述的水蛭多肽凍干粉針制劑，其特征在于提取過(guò)程不使用任何有機(jī)溶劑，純化過(guò)程中應(yīng)用的凝膠柱陽(yáng)離子交換葡聚糖凝膠色譜柱和陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱。
3.一種水蛭多肽凍干粉針制劑的制備方法，其特征包括以下步驟(1)提取物的制備1>稱取水蛭，加入純水，洗去雜質(zhì)，用電動(dòng)絞肉機(jī)充分?jǐn)囁槭钩纱种苿驖{。將粗制勻漿經(jīng)膠體磨勻漿，待勻漿呈粘稠狀態(tài)且無(wú)明顯可見粒狀物時(shí)，即停止研磨，將全部勻漿立即分裝于經(jīng)煮沸消毒的離心瓶中，于-25±5℃冰柜凍結(jié)24-36小時(shí)，再用水溫為25±5℃的振蕩水浴中解凍，反復(fù)凍、融5-7次，最后一次解凍后，用冷凍離心機(jī)離心沉淀，收集上清液；2>將上清液用截留分子量為8000-12000的中空纖維膜進(jìn)行超濾，壓力為0.1MPa，雙向流TWT式，外壓式分離，當(dāng)分離至截留液體積基本達(dá)到原溶液體積的1/4-1/3時(shí)，加入1/3截留液體積的注射用水，繼續(xù)超濾，直至超濾液體積基本達(dá)到上清液量時(shí)停止超濾，超濾結(jié)束后，將超濾液分裝到離心瓶中，凍存于-20±5℃冰柜中；3>將超濾液用緩沖液調(diào)pH值為5.0-7.0后，分別經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換葡聚糖凝膠色譜柱和陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱進(jìn)行分離純化陽(yáng)離子交換葡聚糖凝膠色譜柱的流動(dòng)相用緩沖液調(diào)pH至6.0-7.0進(jìn)行洗脫，陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱的流動(dòng)相用緩沖液調(diào)pH至7.0-8.0進(jìn)行梯度洗脫；在紫外檢測(cè)下，自動(dòng)收集具有抗凝血酶活性部分的洗脫液，至紫外檢測(cè)器檢測(cè)不到吸收為止；將各個(gè)單一組分分別進(jìn)行抗凝血酶活性檢測(cè)，將有活性的單一組分合并后除菌過(guò)濾，濾液用反滲透膜機(jī)濃縮脫鹽，或用凝膠柱脫鹽并進(jìn)一步純化，并留樣檢測(cè)，得到水蛭多肽半成品。(2)凍干粉針劑的制備將水蛭多肽半成品與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調(diào)pH值，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的水蛭多肽，其中水蛭品種為選自螞蝗、亞洲水牛蛭、日本醫(yī)蛭、柳葉螞蝗、歐洲醫(yī)用水蛭、印度水蛭、寬體金線蛭中的任何一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的一種水蛭多肽凍干粉針制劑的制備方法，所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液和三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的一種。
6.權(quán)利要求3的一種水蛭多肽凍干粉針制劑的制備方法，所述的陽(yáng)離子交換葡聚糖凝膠色譜柱是sephadexC-25、sephadexC-50中的一種。
7.權(quán)利要求3的一種水蛭多肽凍干粉針制劑的制備方法，所述的陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱是sepharoseF.F、sepharoseA-25中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水蛭多肽注射制劑及其制備方法，其特征在于水蛭多肽提取過(guò)程采用水為溶劑，純化過(guò)程單獨(dú)使用兩組效果最佳的陽(yáng)離子交換葡聚糖凝膠色譜柱和陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱。純化后加或不加藥用輔料，制備成水蛭多肽注射制劑；其特征還在于提取過(guò)程不使用任何有機(jī)試劑；該制備方法簡(jiǎn)單，操作過(guò)程無(wú)環(huán)境污染，省時(shí)節(jié)源并且使水蛭多肽的純度大大提高，同時(shí)抗凝血活性得到了顯著的提高，采用該純化方法得到的水蛭多肽的凝血酶比活為1∶32。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1891234SQ20051008031
公開日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2005年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月1日
發(fā)明者張晴龍 申請(qǐng)人:張晴龍