專利名稱：骨疾病的預(yù)防或治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及骨疾病的預(yù)防或治療方法以及這些方法中所用的化合物。更具體涉及以骨代謝改變?yōu)樘卣鞯墓羌膊〉念A(yù)防或治療方法，其中包括骨質(zhì)疏松如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、骨量減少、佩吉特病、癌癥患者的溶骨性轉(zhuǎn)移、肝病的骨營養(yǎng)不良(osteodistrophy)以及由腎衰竭或血液透析、骨折、骨手術(shù)、衰老、懷孕和營養(yǎng)不良導(dǎo)致的骨代謝改變。
背景技術(shù)：
本說明書所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括所有專利或?qū)＠暾垼家鸭{入本文作為參考，以便于全面地理解本發(fā)明。但是，引用這些參考文獻(xiàn)不能被認(rèn)為是承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)成為了本領(lǐng)域常識的一部分，無論是在澳大利亞還是在其他任何國家。參考文獻(xiàn)的討論部分陳述了文獻(xiàn)作者的意見，本發(fā)明的申請者有權(quán)質(zhì)疑被引用文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和適當(dāng)性。
骨是不斷更新的活組織。骨包含細(xì)胞和特異性的膠原纖維，外包晶體礦物質(zhì)。礦物質(zhì)、細(xì)胞和纖維一起形成有機(jī)基質(zhì)或“類骨質(zhì)”。
骨不斷地經(jīng)歷骨形成和骨吸收，前者由成骨細(xì)胞完成，后者由破骨細(xì)胞完成。如果血鈣水平降低，則骨吸收增加以滿足身體其他部位的鈣需求。
骨代謝改變的特征是骨形成和骨吸收之間的平衡被打破。其發(fā)生可能與幾類疾病有關(guān)。這類疾病的例子有骨質(zhì)疏松、骨量減少、佩吉特病、癌癥患者的溶骨性轉(zhuǎn)移、肝病的骨營養(yǎng)不良以及由腎衰竭或血液透析、骨折、骨手術(shù)、衰老、懷孕和營養(yǎng)不良導(dǎo)致的骨代謝改變。
骨丟失隨衰老過程而加速。老年人群中的主要骨疾病是骨質(zhì)疏松。這種疾病的特征是廣泛的骨丟失，導(dǎo)致骨的脆性增加，骨折的風(fēng)險(xiǎn)增大。這種疾病導(dǎo)致了相當(dāng)多的人出現(xiàn)疼痛、喪失勞動能力、損形和喪失獨(dú)立性，耗費(fèi)巨大，是醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的沉重負(fù)擔(dān)。在全球范圍內(nèi)，每年有超過150萬的人因骨質(zhì)疏松而骨折。
現(xiàn)在已知有兩種類型的骨質(zhì)疏松。第一類通常發(fā)生在50到75歲之間，女性(絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松)的發(fā)病率是男性的6倍。第二類被稱為老年性骨質(zhì)疏松，對75歲以上的男性和女性都有影響，與正常骨丟失加速無關(guān)。兩類骨質(zhì)疏松的危險(xiǎn)因素是高咖啡因攝入、喝酒、體重過低和鈣攝入少。
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松最主要的已知原因是雌激素缺乏。絕經(jīng)以后，卵巢停止分泌這種激素，這與骨礦物質(zhì)含量下降直接相關(guān)。大家所熟知的絕經(jīng)后癥狀，包括骨質(zhì)疏松，的治療方法是激素替代療法(HRT)，這種雌激素替代療法可有效地預(yù)防骨質(zhì)疏松。但是，HRT有嚴(yán)重的副作用，如，乳腺組織生長刺激，因此需要尋找其他的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松治療方法其他類型骨疾病的主要原因還有待確定，治療這類疾病的方法也是我們需要的。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式的目的在于提供預(yù)防或治療骨疾病的方法，以及這類方法中所用的組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了預(yù)防或治療哺乳動物骨疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物治療有效量的肽，所述的肽能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，對胰島素樣生長因子-1(IGF-1)卻沒有可評估的效應(yīng)。
在Monash University的澳大利亞專利No.693478中，我們描述了使用肽控制肥胖癥的方法，所述的肽來源于人生長激素的羧基端序列或其他哺乳動物生長激素的相應(yīng)區(qū)域。生長激素的這個(gè)區(qū)域能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。更特別的是，研究發(fā)現(xiàn)人生長激素氨基酸殘基177-191(在下文中稱之為hGH 177-191)相應(yīng)的合成肽能夠抑制肥胖癥模型系統(tǒng)C57B1/6J(Ob/Ob)小鼠的體重增加和脂肪組織增多。在在后申請，Metabolic Pharmaceuticals Ltd的PCT/AU98/00724中，公開了也有這種活性的hGH177-191肽的類似物。AU693478和PCT/AU98/00724的完整公開內(nèi)容已納入本文作為參考。
我們的申請PCT/AU00/01362(WO01/33977)公開了這類肽令人驚奇的口服活性。
利用絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的老化大鼠模型研究了AOD9604(Tyr-hGH 177-191)對骨骼的效應(yīng)。由于在我們較早的申請中所描述的人生長激素的C端片段相應(yīng)的肽沒有正常全長生長激素的正常生長效應(yīng)，對IGF-1(介導(dǎo)人生長激素的生長效應(yīng))也沒有效應(yīng)，因此我們估計(jì)這個(gè)肽對骨代謝也沒有效應(yīng)。但令人驚奇的是，我們在兩個(gè)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AOD9604對骨生長有效應(yīng)，并且其預(yù)防骨丟失的效應(yīng)比雌激素還要高。
因此，本發(fā)明的發(fā)明者認(rèn)識到人生長激素C端片段相應(yīng)的肽(AOD9604)對骨代謝有效應(yīng)。因而發(fā)明者提出，在以前的試驗(yàn)中顯示有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝能力的人生長激素的所有C端片段可能都和AOD9604具有一樣的骨代謝影響效應(yīng)。相應(yīng)的，發(fā)明者認(rèn)為在以前的試驗(yàn)中顯示有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝能力但不影響IGF-1的所有肽都可用于治療或預(yù)防骨代謝。
本發(fā)明的第二方面提供了有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的能力但對IGF-1沒有可評估的效應(yīng)的肽在制造用于治療或預(yù)防骨疾病的藥物中的應(yīng)用。
在第三方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療骨疾病的藥物制劑，所述制劑包含有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝能力但對IGF-1沒有可評估的效應(yīng)的肽以及藥用載體。
第三方面所述的制劑還包含一種或多種治療或預(yù)防骨疾病的藥物。
可用第一方面所述方法或第二方面所述藥物治療的骨疾病包括以骨代謝改變?yōu)樘卣鞯哪切┘膊　?br> 骨疾病可以包括骨質(zhì)疏松如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、骨量減少、佩吉特病、癌癥患者的溶骨性轉(zhuǎn)移、肝病的骨營養(yǎng)不良以及由腎衰竭或血液透析、骨折、骨手術(shù)、衰老、懷孕和營養(yǎng)不良導(dǎo)致的骨代謝改變。
本發(fā)明特別適用于治療或預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。


圖1成骨細(xì)胞增殖試驗(yàn)所得到的AOD9604濃度對原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中胸苷摻入量的柱狀圖。
圖2實(shí)施例2的試驗(yàn)設(shè)計(jì)概述和時(shí)間線。
圖3按照實(shí)施例2的描述進(jìn)行治療12周后所有治療組的骨礦物質(zhì)密度(BMD)，a)腰椎(L4+L5)，b)股骨。
圖4實(shí)驗(yàn)性卵巢切除模型a)腰椎(L4+L5)和b)股骨的骨礦物質(zhì)密度。(**顯著性設(shè)定在p＜0.05，***趨勢設(shè)定在p＜0.1)。
圖5比較OVX對照組和藥物治療組a)腰椎(L4+L5)(OVX到LAOD 0.075，0.05)和b)股骨(0.1，0.01)的BMD(*顯著性設(shè)定在p＜0.01，**顯著性設(shè)定在p＜0.05，***趨勢設(shè)定在p＜0.1)。
圖6比較各治療組所得到的右股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果。A)極限應(yīng)力，B)破壞應(yīng)變(*表示顯著性在p＜0.01。**表示顯著性在p＜0.05)。
圖7比較各治療組所得到的右股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果。A)標(biāo)準(zhǔn)化的破壞能量，B)彈性模量(*表示顯著性在p＜0.01。**表示顯著性在p＜0.05)。
圖8比較各治療組L5的脊椎壓縮試驗(yàn)結(jié)果。A)標(biāo)準(zhǔn)化的破壞能量，B)彈性模量(**表示顯著性在p＜0.05)。
圖9股骨頸的機(jī)械特性。A)極限載荷(N)，B)破壞形變(mm)。*代表顯著性在p＜0.01，**代表顯著性在p＜0.05，***代表趨勢在p＜0.1。
圖10股骨頸的機(jī)械特性。A)破壞能量(mJ)，B)剛性(MPa)。*代表顯著性在p＜0.01，**代表顯著性在p＜0.05，***代表趨勢在p＜0.1。
發(fā)明詳述有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝能力但對IGF-1沒有可評估的效應(yīng)的肽與生長激素的C端氨基酸序列尤其相似。這種肽被稱為“生長激素C端片段”。在本說明書中，術(shù)語“生長激素C端片段”應(yīng)被理解為哺乳動物生長激素氨基酸序列的羧基端區(qū)域來源的肽片段，該片段能夠降低脂肪生成(lipogenic)活性；和/或刺激脂解作用。
本文所用的術(shù)語“肽”是指長度為2到50個(gè)氨基酸殘基的任何氨基酸鏈，優(yōu)選的是長度為2到20個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選的是長度約為15個(gè)氨基酸殘基。因此，本文所用的術(shù)語“肽”也包括多肽，二者可交互使用。只有一個(gè)前提條件就是本發(fā)明所使用的所有肽都不包含全長序列的人生長激素或其來源于其他物種的類似物。全長的生長激素能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，并且也能調(diào)節(jié)IGF-1。因此，全長生長激素不包括在本發(fā)明所使用的肽的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明所使用的肽優(yōu)選能夠刺激激素敏感性脂肪酶的活性，該酶是脂解作用的關(guān)鍵酶，并且能夠抑制乙酰輔酶A羧化酶的活性，該酶是脂肪生成的關(guān)鍵酶。
本發(fā)明所使用的肽優(yōu)選至少包含哺乳動物生長激素的二硫鍵環(huán)。
術(shù)語“生長激素片段”還包括哺乳動物生長激素天然羧基端序列的功能性類似物，其中所述的類似肽能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝但對IGF-1沒有可評估的效應(yīng)。這種類似物可來源于天然來源、通過重組DNA技術(shù)制備、或者利用常規(guī)的肽合成方法合成。這些肽合成方法應(yīng)當(dāng)被理解為包括組合方法。優(yōu)選的這種類似物包含二硫鍵，二硫鍵可使肽具有環(huán)狀構(gòu)型。特別是AU 693478和PCT/AU98/00724所描述的肽都應(yīng)當(dāng)被理解為包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，例如參考編號 結(jié)構(gòu)9502 Leu Arg Ile Val Gln Pen Arg Ser Val Glu Gly Ser Pen Gly Phe SEQ ID NO19405 CH3CO-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ IDNO29410 H-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ IDNO39404 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe-CONH2 SEQ IDNO49407 Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO59408 Leu Arg Ile Val Gln CysLys Ser Val GluGly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO6(酰胺鍵)9604 Tyr Leu Arg Ile VAl Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO79605 Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO89618 Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ IDNO99607 Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO109606 Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO119608 Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO129403 Leu Arg Lys Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO139609 Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO149610 Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO159612 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO169613 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO179615 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO189616 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe SEQ ID NO199602 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe SEQ ID NO20950l Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu D-Ala Ser Cys D-Ala Phe SEQ IDNO219601 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala SEQ ID NO22其中的氨基酸殘基縮寫與標(biāo)準(zhǔn)的肽命名法一致Gly＝甘氨酸；Ile＝異亮氨酸；Glu＝谷氨酸；Phe＝苯丙氨酸；Cys＝半胱氨酸；Arg＝精氨酸；Gln＝谷氨酰胺；Leu＝亮氨酸；Ser＝絲氨酸；Val＝纈氨酸；Lys＝賴氨酸；Ala＝丙氨酸；Asp＝天冬氨酸；His＝組氨酸；
Orn＝鳥氨酸；Tyr＝酪氨酸；Pen＝青霉胺(p，p′-二甲基-半胱氨酸)。
除了甘氨酸以外，如果沒有說明是D-絕對構(gòu)型，所有的氨基酸都是L-絕對構(gòu)型。上述所有肽在Cys(182)和Cys(189)之間或Pen(182)和Pen(189)之間都有合適的環(huán)形二硫鍵。
優(yōu)選的肽包含人生長激素的氨基酸182-189(hGH 182-189)，更優(yōu)選的包含人生長激素的氨基酸177-191(hGH 177-191)。更優(yōu)選的是人生長激素類似物AOD9604(Tyr-hGH 177-191)。但是，應(yīng)當(dāng)清醒地認(rèn)識到本發(fā)明也適用于其他哺乳動物物種來源的生長激素的氨基酸序列相應(yīng)的肽，其中包括而不限于家畜如牛、羊、豬和馬的生長激素，寵物如貓和狗的生長激素，以及動物園動物包括貓科動物、犬科動物和非人靈長類動物的生長激素。生長激素這個(gè)區(qū)的序列在不同物種之間高度保守，如PCT/AU98/00724及其所引用的參考文獻(xiàn)所描述的。
肽還可以連接到融合伴侶上使其更容易生物合成和/或轉(zhuǎn)運(yùn)。還可以摻入到藥物組合物中，或者存在于基因修飾食品中，如WO 01/33997所描述。
肽可以和藥用載體混合形成藥物組合物來給藥。
肽可以通過任何合適的途徑給藥，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所要治療的疾病可以很容易地確定最合適的給藥途徑和給藥劑量。肽可以包含常規(guī)的非毒性藥用載體、佐劑和載體的劑量單位制劑形式通過口服、舌下含服、口腔含服、鼻內(nèi)、吸入、透皮、局部或胃腸外途徑給藥。本文所用的術(shù)語胃腸外途徑包括皮下、靜脈、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
給藥劑量可由巡診醫(yī)生或獸醫(yī)根據(jù)所治療疾病的性質(zhì)和狀況、患者的年齡及健康狀況、給藥途徑及以前采取的治療措施來判斷。給藥間隔時(shí)間可以是每周一次、每天一次或連續(xù)給藥。
優(yōu)選的治療對象是患有以骨代謝改變?yōu)樘卣鞯墓羌膊〉牟溉閯游铮绻琴|(zhì)疏松如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、骨量減少、佩吉特病、癌癥患者的溶骨性轉(zhuǎn)移、肝病的骨營養(yǎng)不良以及由腎衰竭或血液透析、骨折、骨手術(shù)、衰老、懷孕和營養(yǎng)不良導(dǎo)致的骨代謝改變。哺乳動物也可以是生長激素缺乏的哺乳動物。
哺乳動物可以是人，也可以是家畜或?qū)櫸?。雖然本發(fā)明特別適于治療人，但是也可用于獸疾治療，其中包括寵物如狗和貓的治療，家畜如馬、牛和羊的治療，或者動物園動物如非人靈長類動物、貓科動物、犬科動物、?？苿游锖陀刑銊游锏闹委?。
優(yōu)選的哺乳動物是人。人可以是兒童，也可以是成人。
用于制備藥物組合物的方法和藥用載體是本領(lǐng)域所熟知的，如教科書所描述，如Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明頓藥物科學(xué))，第20版，Williams andWilliams，Pennsylvania，USA(2000)。
本文所用的術(shù)語“藥用載體”是指用于將生長激素片段和/或藥物活性劑轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)的藥用溶劑、懸浮劑或載體。選擇何種載體或稀釋劑要根據(jù)給藥途徑而定，另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地確定每個(gè)特定病例最適合的制劑。
本文所描述的肽類似物包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，如果它們有功能活性的話。本文所用的術(shù)語“有功能活性的”和“功能活性”用于指類似物時(shí)表示類似物能夠(或者有能力)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝但對IGF-1沒有可評估的效應(yīng)。
本發(fā)明所使用的肽或類似肽預(yù)防或治療骨疾病的能力表現(xiàn)在實(shí)施例所描述的成骨細(xì)胞形成活性。
本文所用的類似肽包括所提供的肽氨基酸序列的氨基酸序列變體。序列變體包括上述生長激素片段的氨基酸序列內(nèi)氨基酸殘基的缺失、插入或替代。缺失、插入和替代的任意組合也可以形成生長激素片段的氨基酸序列變體，只要該變體具有本文所描述的我們所期望的功能特性；即，能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝但對IGF-1沒有可評估的效應(yīng)。
更具體地說，確定變體是否具有功能活性的一個(gè)試驗(yàn)是檢測變體刺激胸腺嘧啶摻入到原代大鼠胚胎成骨細(xì)胞內(nèi)是否能達(dá)到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的水平(參見實(shí)施例l的進(jìn)一步描述)。
如果這種替代不會導(dǎo)致功能活性的變化，那么就可以引入更多的實(shí)質(zhì)改變，如表l所列的典型替代或者參照氨基酸分類在下文進(jìn)一步描述的，然后分析所得到的生長激素片段變體的功能活性。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用常用的方法就可以確定一個(gè)肽是否能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝但對IGF-1沒有可評估的效應(yīng)。
本文所用的術(shù)語“沒有可評估的效應(yīng)”是指對IGF-1的效應(yīng)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著，以及即使在試驗(yàn)中記錄了肽的效應(yīng)，但是這種效應(yīng)被認(rèn)為可以忽略不計(jì)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定肽是否能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的一種方式是實(shí)施例A所描述的脂解試驗(yàn)。簡言之，大鼠在治療后處死，取治療大鼠和對照大鼠的脂肪組織，置于小瓶內(nèi)，加入間羥叔丁腎上腺素。小瓶在37℃孵育1小時(shí)，通以碳合氣(carbon)，然后利用標(biāo)準(zhǔn)的甘油試驗(yàn)進(jìn)行測定，例如，利用測定試劑盒，如Sigma GPO-337。
實(shí)施例B所描述的脂肪生成試驗(yàn)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定肽是否能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的另一種方法。
為了確定肽對IGF-1是否有可評估的效應(yīng)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以用血液樣品(例如小鼠的血液樣品)進(jìn)行IGF-1試驗(yàn)。R&D Systems，Inc.有一種適于做此試驗(yàn)的試劑盒，產(chǎn)品編號為DY791。這是一種夾心ELISA方法，以倉鼠抗小鼠IGF-A抗體作為捕獲抗體，以羊抗鼠IGF-A抗體作為檢測抗體。有關(guān)該試驗(yàn)的完整細(xì)節(jié)見實(shí)施例C。
表1

本文所用的術(shù)語“治療有效量”和“治療量”是同義詞，是指本發(fā)明的肽的量能夠有效地產(chǎn)生所期望的治療反應(yīng)。
顯然，特定的治療有效量隨某些因素的變化而變化，如所治療的特定疾病、所治療的哺乳動物的種類、哺乳動物的物理狀況和臨床治療史、治療持續(xù)時(shí)間、合并治療措施(如果有的話)、以及所使用的特定制劑及肽的結(jié)構(gòu)。
一般來說，“處理”、“治療”等術(shù)語用于本文中是指影響患者、組織或細(xì)胞來獲得所期望的藥理和/或生理效應(yīng)。效應(yīng)可以是預(yù)防性的，其形式為完全或部分防止骨丟失，和/或是治療性的，其形式為增加骨形成和/或骨沉積。
“治療”用于本文中可涵蓋治療或預(yù)防哺乳動物，特別是人，的疾病的任何方法，其中包括預(yù)防易患但經(jīng)診斷還未患上某疾病的患者患上該疾??；抑制疾病，即阻止疾病的發(fā)展；或者減輕或改善疾病的影響，即使疾病的影響減退。
本發(fā)明的第三方面包括用于改善骨疾病的各種藥物組合物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式所述的藥物組合物是利用載體、賦形劑和添加劑或輔助劑將生長激素C端片段、其類似物、變體或鹽相應(yīng)的肽與一種或多種抗骨疾病的活性劑混合在一起形成適于給予患者的形式而制備的。
抗骨疾病的其他活性劑包括鈣、骨礦物質(zhì)如鎂和硼、γ亞麻酸、維生素如維生素D和維生素K、雌激素或用于雌激素替代療法的一種或多種雌激素模擬化合物、磷酸氫鹽和異黃酮。
添加鈣可增加骨的鈣沉積。鈣可來源于任何適宜的含鈣有機(jī)或無機(jī)化合物。無機(jī)鈣鹽的例子包括，例如，氯化鈣、磷酸鈣、硫酸鈣、氧化鈣、氫氧化鈣或碳酸鈣。有機(jī)鈣化合物的例子有奶粉或酪朊酸鈣、檸檬酸鈣、蘋果酸鈣、檸檬酸蘋果酸鈣或乳酸鈣。鈣的量優(yōu)選每日劑量200-1500mg。
添加骨礦物質(zhì)可增加骨的強(qiáng)度。優(yōu)選的制劑為每日劑量含100-500mg鎂和2-6mg硼。
γ亞麻酸用于調(diào)節(jié)鈣代謝，優(yōu)選的量為每日劑量25-100mg。
添加的維生素可作為輔助因子優(yōu)化骨代謝。優(yōu)選的維生素K每日劑量為25pg到5mg。維生素D可提高鈣從腸道內(nèi)的攝取。優(yōu)選的制劑所含的每日劑量為200IU到800IU。
雌激素或模擬雌激素替代療法中所用化合物的一種或多種雌激素也可以包含在制劑中。雌激素模擬化合物的例子有植物性雌激素如染料木黃酮、木脂體或香豆?jié)M(coumerans)，或藥物制劑如17p-雌二醇、酯化的雌激素、硫酸雌酮、結(jié)合馬雌激素和乙炔雌二醇。對于植物性雌激素來說，這些化合物的量為每日劑量5-100mg。對于藥物制劑來說，活性組分的含量由廠家的說明書定義。
一種或多種磷酸氫鹽可用于抑制噬骨性骨吸收。這些化合物的例子有阿侖膦酸鹽和利塞膦酸鹽。這些化合物的優(yōu)選量為每日劑量5-50mg。
異黃酮可從大豆或黑升麻中獲得(分離)，也可以人工合成。異黃酮的添加量為每日劑量10-75mg。
本發(fā)明的第三方面所述的制劑還可以包含其他的能量來源如脂肪和碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、纖維、淀粉、防腐劑、著色劑、甜味劑等。
藥用活性劑的任何化學(xué)相容性組合都包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要這種組合不會降低本發(fā)明的生長激素片段的活性。
藥物組合物優(yōu)選以劑量單位的形式制備和給藥。固體劑量單位包括片劑、膠囊和栓劑。用于治療患者時(shí)，根據(jù)化合物的活性、給藥方式、疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、患者的年齡和體重不同可選擇不同的每日劑量。然而，在某些情況下，較高或較低的每日劑量是合適的。每日劑量的藥物可以通過單個(gè)劑量單位的形式或幾個(gè)較小劑量單位的形式一次給予，也可以通過亞劑量單位的形式以一定的時(shí)間間隔多次給予。
藥物組合物可以治療有效劑量的形式局部給藥或系統(tǒng)給藥。當(dāng)然，用于此目的的有效量要根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度和患者的體重及一般狀況而定。一般來說，體外使用劑型可為確定藥物組合物的原位給藥量提供指導(dǎo)，動物模型也可用于確定處理細(xì)胞毒性副作用的有效劑量。
例如，生長激素片段用于治療時(shí)的有效量要依據(jù)治療的目的、給藥途徑和患者的病情而定。相應(yīng)的，臨床醫(yī)學(xué)家需要確定給藥劑量及調(diào)整給藥途徑以獲得最佳的治療效果。根據(jù)給藥模式的不同，每日劑量可以從約1μg/kg到100mg/kg或更高。
生長激素片段的劑量水平一般為約0.5-20mg/公斤體重的次序，優(yōu)選的劑量范圍是約0.5-10mg/公斤體重/天(約0.5-3g/人/天)。與載體材料混合制成單次劑量的活性組分量因所治療的宿主和特定給藥模式的不同而不同。例如，人用口服制劑可以包含約5mg到lg的活性化合物加上適當(dāng)量的載體材料，后者可占組合物總量的約5-95％。一個(gè)劑量單位的制劑一般包含約5-500mg的活性組分。
但是，應(yīng)當(dāng)理解的是，對于任何一個(gè)特定患者來說，其特定的劑量水平要根據(jù)多種因素來確定，其中包括所使用的特定化合物的活性、年齡、體重、一般狀況、性別、飲食情況、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速度、合并用藥及正在治療的特定疾病的嚴(yán)重程度。
在本說明書中，應(yīng)當(dāng)清楚地了解名詞“包括”是指“包括但不需局限于”，名詞“包含”也有同樣的意思。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解，雖然為了澄清和便于理解本發(fā)明，在某些細(xì)節(jié)上對本發(fā)明作了描述，但是，只要不偏離本說明書所描述的概念的范圍，可以對本文所描述的實(shí)施方式和方法作出各種修改和改變。
現(xiàn)在僅僅是以參考下列非限定性實(shí)施例的方式對本發(fā)明進(jìn)行描述。
實(shí)施例大鼠處理方案大鼠16只雄性Wistar大鼠。
給瘦的Wistar大鼠喂29天的高脂飼料。每周稱一次大鼠體重(包括開始給藥時(shí)的第0天)。在給藥或給鹽水期間繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)大鼠。
以有效的給藥途徑用藥物(溶于鹽水中)處理8只雄性Wistar大鼠(瘦的，成年的)。用鹽水(等體積的)處理另外8只雄性Wistar大鼠(瘦的，成年的)29天。
在第0天稱體重，然后每周稱一次。動物必須在每天的相同時(shí)間(8:30-9:30am)給藥。
28天時(shí)，采集所有大鼠的血樣并以適當(dāng)方式保存。
給藥后的29天，在處死前不給動物禁食并讓動物自由進(jìn)食和飲水。
在最后一次給藥后讓動物休息2小時(shí)(自由進(jìn)食和飲水)。在此期間，配制緩沖液、藥物儲存液(來自于Sigma的鹽酸間羥叔丁腎上腺素)并準(zhǔn)備解剖設(shè)備和工作區(qū)。
在每個(gè)小瓶(每只大鼠的每個(gè)稀釋度準(zhǔn)備6個(gè)小瓶)中加入1.8ml KRB(見附件3)緩沖液(含2％BSA和1mM葡萄糖)，蓋上蓋子放置，直到組織剝離。間羥叔丁腎上腺素儲存液是10×濃縮的，在將組織放入小瓶后、開始孵育前加入到小瓶內(nèi)，每瓶200μl。間羥叔丁腎上腺素的終濃度為0μmol/L、0.1μmol/L和0.5μmol/L。蓋上蓋子并將間羥叔丁腎上腺素置于冰箱內(nèi)直到孵育開始(光敏感的??！)。
最后一次給藥后2小時(shí)通過立即斷頭處死大鼠。立刻取下附睪脂肪組織，用鹽水徹底沖洗(室溫)。
實(shí)施例A-測定肽調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝能力的脂解試驗(yàn)將一塊脂肪墊剪成均勻的18塊(每個(gè)間羥叔丁腎上腺處理鼠有8份)，立即放置到1.8ml KRB緩沖液中。記錄重量，通過先剪切所有的塊然后將其放入小瓶內(nèi)使各瓶的孵育時(shí)間差異減到最小。
在每個(gè)盛有組織的小瓶內(nèi)加入200μl間羥叔丁腎上腺素溶液，立即放入保溫箱內(nèi)。
在37℃、通碳合氣(carbogen，氧和5％二氧化碳的混合氣)的情況下孵育60分鐘。
孵育完以后，取出100μl孵育液加入到eppendorf管內(nèi)。取其中的10μl用標(biāo)準(zhǔn)甘油分析試劑盒(Sigma GPO-337)分析。將剩余的90μl混合物于-80℃保存。
實(shí)施例B-測定肽調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝能力的脂肪生成試驗(yàn)取每只大鼠的第二塊脂肪墊。將組織剪切成相同重量的塊(200mg)。每只大鼠取6塊組織。
將每塊組織放置到10ml三角瓶中，瓶中盛有2ml KRB緩沖液/2％BSA，其中含有[12C]-葡萄糖和[14C]-葡萄糖(最終的特異性活性為0.05μCi/μmol)以及人胰島素(100μU/ml)。在37℃水浴中孵育60分鐘，以100rpm的速度持續(xù)搖動，同時(shí)通以95％O2/5％CO2。
取出組織，用0.9％NaCl洗滌三次，吸干水分，放置到含5ml氯仿∶甲醇(2∶1v/v)的玻璃螺旋帽試管(或falcon)中，放入4℃冰箱過夜。
取出組織(留下溶液)，放入含2ml氯仿∶甲醇溶液(2∶1v/v)的10ml離心管中，振蕩，冷卻30分鐘。該步驟得到的提取溶液與步驟4得到的提取溶液混合。用玻璃棒碾壓組織提取其中剩余的脂質(zhì)。
然后使組織與2ml甲醇∶0.1％MgCl2溶液(1∶1v/v)在4℃混合15分鐘。
混合步驟5和6的提取物，在10℃以6000×g離心10分鐘。
吸出上層丟掉。將5ml下層溶液轉(zhuǎn)移到帶刻度的小瓶內(nèi)，在溫暖空氣流中蒸發(fā)過夜。
將已干燥的材料重懸于1ml氯仿，其中加入了l0ml閃爍液。
測定放射活性60秒，所得數(shù)據(jù)表示為dpm/mg組織。
實(shí)施例C-檢測對IGF-1的效應(yīng)R&D Research Systems，Inc.的DuoSet ELISA發(fā)育試劑盒(產(chǎn)品編號為DY791)用于分析對IGF-1的效應(yīng)。每個(gè)試劑盒內(nèi)都包含檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清和血清中IGF-1的夾心ELISA所需要的基本組分。IGF-1試劑盒DY791的使用說明書復(fù)制在附件1中。
實(shí)施例1材料所用的肽AOD 9604，純度95％生產(chǎn)廠家Metabolic Pharmaceutical Ltd儲存條件-20℃可溶性建議以1mg/ml的濃度溶于鹽水中；但是，這可能會形成混濁的溶液-離心取上清用于蛋白質(zhì)分析。如果溶液所含的藥物還低于1mg/ml，則認(rèn)為沉淀不是蛋白質(zhì)。
方法原代成骨細(xì)胞增殖試驗(yàn)按照如下步驟用原代大鼠胚胎成骨細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)分析AOD 9604肽。
原代大鼠成骨細(xì)胞來源于膠原酶連續(xù)消化的21-天大鼠胚胎顱蓋骨。收集消化物3-4并在T-75培養(yǎng)瓶內(nèi)用含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)。細(xì)胞生長到匯合以后用胰酶消化，接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)，用含5％FBS的極限必需培養(yǎng)基(MEM)培養(yǎng)24小時(shí)。然后細(xì)胞用不含血清的MEM/0.1％BSA培養(yǎng)24小時(shí)。換掉培養(yǎng)基，加入生長介質(zhì)后再孵育24小時(shí)。在孵育結(jié)束前4小時(shí)加入3H-胸苷。洗滌細(xì)胞，孔內(nèi)加入10％TCA，培養(yǎng)板在4℃過夜。然后測定培養(yǎng)板內(nèi)的胸苷摻入量。
結(jié)果AOD對原代成骨細(xì)胞合成代謝的影響濃度為10-10M和10-9M AOD能夠明顯地刺激胸苷摻入到原代大鼠胚胎成骨細(xì)胞內(nèi)(圖1a)。用斯氏t檢驗(yàn)評估顯著性。
結(jié)論AOD對原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物有明顯的促有絲分裂作用。因此，AOD對骨的合成代謝有影響，可能成為骨領(lǐng)域的潛在治療性化合物。
實(shí)施例2本試驗(yàn)觀察AOD9604對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松老化大鼠模型骨骼的效應(yīng)。預(yù)計(jì)AOD不能阻止大鼠因卵巢切除而發(fā)生的骨變化。
材料和方法(a)動物的飼養(yǎng)和安置本試驗(yàn)總共包括96只老化的雌性Sprague-Dawley大鼠(Rattus Norvegicus)，約9周齡，購自Harlan(Harlan Farms，Indiana)。大鼠隨機(jī)分成8組。在12周的試驗(yàn)期間，大鼠被安置在多倫多大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心(Division of Comparative Medicine at theUniversity of Toronto)的動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。大鼠成對安置在干凈塑料籠子內(nèi)，以玉米片為床，以塑料管為房子。所有大鼠都可以隨意地從水龍頭飲水，隨意進(jìn)食實(shí)驗(yàn)室食物。每日監(jiān)測其居室，保持20.5℃的恒定溫度和60％的濕度。
(b)藥物制備和給藥GH和AOD治療組大鼠每周注射5天，共12周。所有治療都是通過皮下注射。GH治療組注射人GH(rhGH)(BresaGen，Adelaide，Australia)。按照廠家的說明書重新溶解配制好，每目劑量分裝一管，冷凍到-70℃，可儲存4周。AOD治療組用AOD9406(Formatech Inc.，Andover MA，U.S.A)處理，AOD冷凍干燥后保存在4℃。按照藥廠的說明書配制。每天配制，在配制完后的4小時(shí)內(nèi)使用。在4、8和10周后根據(jù)所稱的大鼠體重重新計(jì)算藥物濃度以確保整個(gè)試驗(yàn)過程中的給藥劑量恒定。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)96天齡的Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分到8個(gè)組內(nèi)。前兩組做假處理。組1作為假處理(Sham)對照，組2用2.5mg/kg/天的重組人GH(rhGH)(BresaGen)處理。其余6組購自Harlan，是做過卵巢切除術(shù)(OVX)的。這種手術(shù)在治療前約8天進(jìn)行。組3作為OVX模型的對照。組4用2.5mg/kg/天的rhGH處理。組5用0.75mg/kg/天的低劑量AOD肽(LAOD)處理，組6用2.0mg/kg/天的高劑量AOD肽(GAOD)處理。最后兩組給予緩釋的17B-雌激素片(0.01mg/天，17B-雌二醇，Innovative Research ofAmerica，Sarasota FL，U.S.A)，該藥物被皮下植入到頸背部。組7作為雌激素對照，組8給予2.0mg/kg/天的高劑量AOD肽(HAOD，F(xiàn)ormatech Inc)。分組情況及各組的處理總結(jié)如下。
組 大鼠數(shù)量 模型 處理給藥劑量(mg/kg)112 假處理--------212 假處理RhGH2.5312 OVX ---412 OVX RhGH2.5512 OVX 低劑量AOD 0.75612 OVX 高劑量AOD 2.0712 OVX 雌激素(E) 0.01mg/天
812 OVX E+ 0.01mg/天HAOD2.0在開始處理前，稱重大鼠并采集1mL血液樣品。在4、8和12周后再采集血液樣品。血液樣品在血清分離管中以100×g離心10分鐘。吸出血清，分成4份進(jìn)行下一步的分析。血清保存在-20℃。在處死前的13和3天，所有大鼠都腹腔注射30mg/mL的土霉素(Tetraject LP，Bimeda-MTC Pharmaceuticals，Cambridge，ON，Canada)。所有的稀釋都使用無菌鹽水。
在12周的治療期結(jié)束時(shí)，麻醉大鼠并稱重。在麻醉狀態(tài)下通過放血處死大鼠。取出股骨、脛骨和脊柱，放到預(yù)先標(biāo)記的管內(nèi)。將骨立刻放置到干冰上，然后置于-70℃保存。圖2顯示的是試驗(yàn)設(shè)計(jì)概要和時(shí)間線。
雙能X射線吸收測定法(DEXA)雙能X射線吸收測定法(DEXA)用于測定骨礦物質(zhì)含量(BMC)和計(jì)算骨礦物質(zhì)密度(BMD)。DEXA用PIXImus Densitometer(Lunar GE Corp.，Madison，WI，U.S.A)進(jìn)行，該儀器是為測定小動物而專門設(shè)計(jì)的。通過將樣品暴露在高、低能量X射線的圓錐形射線下進(jìn)行測定。低能量射線可透過軟組織但不能透過骨，而高能量射線可透過所有材料。根據(jù)骨從高、低能量射線中所吸收的能量計(jì)算骨密度。在每次使用前都用放置在PIXImus掃描區(qū)后1cm的鋁/有機(jī)玻璃假人校正機(jī)器。
掃描切下并清洗干凈的股骨及腰椎4和5。樣品分別以半冷凍狀態(tài)放置到用聚苯乙烯制成的特殊板上，使骨上的軟組織厚度相同。在每次測量時(shí)樣品都以同一個(gè)方向放置。腰椎L4和L5的BMD合在一起作總體測量。
利用廠家提供的軟件根據(jù)BMC和面積計(jì)算BMD[BMD(g/cm2)＝BMC(g)/面積(cm2)]。通過在樣品上圍一個(gè)框來手工測量面積，術(shù)語稱之為目的區(qū)(ROI)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)都表示為平均值+/-平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS(10.0版本)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
包括兩組的比較用獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。對于多重比較來說，先進(jìn)行方差齊性的Levene檢驗(yàn)以判斷方差是否相等。如果數(shù)據(jù)的方差相等，則利用配對比較ProtectedFisher’s最小顯著差(LSD)事后檢驗(yàn)(pairwise comparison Protected Fisher’s LeastSignificant Difference(LSD)post hoc test)通過單向方差分析進(jìn)行多重比較。顯著性設(shè)定在p＜0.05，趨勢設(shè)定在p＜0.1。
雙能X射線吸收測定法(DEXA)DEXA用于計(jì)算骨礦物質(zhì)密度(BMD)。脊椎的BMD主要用于確定骨小梁骨量的變化，而切下的股骨主要用于確定骨皮質(zhì)骨量的變化。
卵巢切除術(shù)的效應(yīng)測定卵巢切除術(shù)對骨礦物質(zhì)密度的影響以確定雌激素缺乏模型是否可作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的模型。T檢驗(yàn)的分析結(jié)果表明OVX組與對照假處理組相比其脊椎的BMD明顯下降(p＝0.02)，如圖4a所示。這種效應(yīng)也發(fā)生在圖4b所示的股骨上，其中OVX組與假處理組相比BMD明顯下降(p＝0.046)。這些結(jié)果證實(shí)了OVX模型可用于本試驗(yàn)。
AOD治療的效應(yīng)AOD導(dǎo)致BMD的變化在脊椎和股骨之間是不同的。在脊椎中，方差分析結(jié)果表明，與OVX對照組相比，AOD的高(p＝0.05)、低劑量組(p＝0.076)都能使BMD顯著增加，如圖5a所示。BMD回到假處理對照組的水平。
低劑量的AOD處理后股骨BMD有增加的趨勢(p＝0.107)，但是高劑量的AOD卻沒有這種效應(yīng)，如圖5b所示。高劑量的AOD不會導(dǎo)致BMD的增加，其BMD與OVX對照組相似。高劑量AOD組的BMD明顯低于低劑量組的BMD(p＝0.013)。
總之，用AOD治療后脊椎和股骨的BMD都有增加，但是脊椎的BMD增加更明顯。
實(shí)施例3機(jī)械檢測方法我們完成了3個(gè)試驗(yàn)以確定骨皮質(zhì)和骨小梁的機(jī)械特性。三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)和扭轉(zhuǎn)試驗(yàn)用于檢驗(yàn)骨皮質(zhì)的機(jī)械特性和材料特性。脊椎壓縮試驗(yàn)用于分析骨小梁的機(jī)械特性和材料特性。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)都表示為平均值+/-平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS(11.0版本)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。包括兩組的比較用獨(dú)立的斯氏t檢驗(yàn)分析。利用配對比較Protected Fisher’s最小顯著差異(LSD)事后檢驗(yàn)通過單向方差分析進(jìn)行多重比較。顯著性設(shè)定在p＜0.05，趨勢設(shè)定在p＜0.1。
三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)右股骨用于三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。在試驗(yàn)前2天將待測骨從-70℃冰箱轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱。在試驗(yàn)前一夜，將樣品從-20℃冰箱中取出，分別用鹽水浸過的紗布包裹。然后將這些樣品放到約4℃過夜以確保樣品完全解凍。在試驗(yàn)開始前，測量骨以確定如何在夾具上放置骨。首先，用數(shù)字測徑器測量骨的長度。從股骨的遠(yuǎn)端開始，在占骨全長25％的地方放置一個(gè)標(biāo)記。在距第一點(diǎn)15.6mm處放置第二個(gè)標(biāo)記，設(shè)定標(biāo)距長度，在標(biāo)距長度的中間放置最后一個(gè)標(biāo)記。
試驗(yàn)在機(jī)械檢測儀(Instron 4465，Instron Canada Inc.，Toronto，ON，Canada)上進(jìn)行，使用的是1000牛頓的測力計(jì)。三點(diǎn)彎曲夾具安裝好以后校正和平衡測力計(jì)。用于檢測的不銹鋼夾具由帶兩個(gè)支架和一個(gè)鋸條的基座組成，連接到Instron的十字頭上。所有的樣品都以同一個(gè)方向放置，其前面朝上，以其最穩(wěn)定的位置放置到支架上。標(biāo)距長度標(biāo)記與夾具的兩個(gè)支架對齊，鋸條與標(biāo)距長度的中點(diǎn)對齊。在骨上預(yù)先加載約1.0N的力。試驗(yàn)以1mm/min的速度運(yùn)行直到骨折。通過LabView數(shù)據(jù)采集軟件(National Instruments Corp.；Austin，TX)從Instron采集載荷對時(shí)間的數(shù)據(jù)。采集股骨斷裂點(diǎn)截面的數(shù)字圖象(ImageJ 1.28u，National Institute of Health)用于確定骨的尺寸并計(jì)算慣性距。測定中-側(cè)向(M/L)和前/后向(A/P)上的直徑以及厚度。
將時(shí)間數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成形變數(shù)據(jù)，利用電子表格軟件(Excel 2000，Microsoft)作載荷-形變曲線。從該曲線中確定非標(biāo)準(zhǔn)化機(jī)械特性；其中包括極限載荷、形變破壞點(diǎn)、破壞能量(曲線下面積)和剛性(線性區(qū)斜率)。
利用直徑和慣性距將載荷-形變曲線轉(zhuǎn)換成應(yīng)力-應(yīng)變曲線。從應(yīng)力/應(yīng)變曲線中計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化的機(jī)械特性，其中包括極限應(yīng)力、破壞應(yīng)變、破壞彈性模量所需的標(biāo)準(zhǔn)化能量。
脊椎壓縮第五脊椎(L5)用于壓縮試驗(yàn)。修剪脊椎只留下椎體用于試驗(yàn)。在試驗(yàn)前至少1天將待測骨從-70℃冰箱轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱。在試驗(yàn)前2小時(shí)，將樣品從-20℃冰箱中取出以確保骨完全除霜。在除霜期間用鹽水浸過的紗布包裹脊椎。
采集數(shù)字圖象，利用圖象分析軟件(ImageJ 1.28u，NIH)確定椎體的高度和截面面積。壓縮試驗(yàn)在機(jī)械檢測儀(Instron 4465，Instron Canada)上進(jìn)行，使用的是1000牛頓的測力計(jì)。將椎體放置到夾具的淺凹處，尾端或平端朝下。樣品用3個(gè)螺絲固定，然后用PMMA包裹。脊椎覆蓋以鹽水浸過的紗布，同時(shí)使PMMA凝固至少10分鐘。少量的PMMA用于抹平脊椎的載荷面。預(yù)先在樣品上加載1.0N的力，保持約3分鐘使PMMA凝固。在樣品上預(yù)載荷時(shí)，用卡規(guī)測定兩個(gè)壓盤之間的距離。然后用夾具的高度減去壓盤之間的距離就得到了標(biāo)距長度。在骨上以1.0mm/min的速度加載載荷直到骨被破壞。脊椎壓縮失敗定義為力明顯減小，或者定義為例如力減小10％。
通過LabView數(shù)據(jù)采集軟件從Instron采集載荷對時(shí)間的數(shù)據(jù)。利用圖象分析軟件(ImageJ，NIH)采集數(shù)字圖象以確定高度和截面面積。
將時(shí)間數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成形變數(shù)據(jù)作載荷-形變曲線。從該曲線中確定非標(biāo)準(zhǔn)化機(jī)械特性，其中包括極限載荷、形變破壞點(diǎn)、破壞能量(曲線下面積)和剛性(線性區(qū)斜率)。從數(shù)字圖象采集的截面面積和標(biāo)距長度用于將載荷-形變曲線轉(zhuǎn)換成應(yīng)力-應(yīng)變曲線。從應(yīng)力/應(yīng)變曲線中計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化的機(jī)械特性，其中包括極限應(yīng)力、破壞應(yīng)變、標(biāo)準(zhǔn)化的破壞能量(曲線下面積)和彈性模量(斜率)。
股骨頸骨折右股骨近端用于股骨頸骨折試驗(yàn)。在試驗(yàn)開始前，利用X射線透視近端股骨以確保股骨頭平對著屏幕。將待測骨從-20℃冰箱中取出，分別包裹上用鹽水浸過的紗布。然后將樣品置于約21℃的室溫中放置2小時(shí)以確保樣品完全解凍。在試驗(yàn)開始前將股骨頸周圍的結(jié)締組織完全去除。
試驗(yàn)在Instron 4464上完成。用4個(gè)平頭螺絲將樣品固定到夾具上。根據(jù)目測放置樣品使其長軸與夾具淺凹垂直并且有約11mm的標(biāo)距長度(從骨的末端到夾具淺凹的頂部)。在夾具淺凹內(nèi)填滿PMMA并使其凝固10分鐘。在PMMA凝固時(shí)用鹽水浸過的紗布覆蓋樣品。在試驗(yàn)開始前，用數(shù)字卡規(guī)測量準(zhǔn)確的標(biāo)距長度和股骨頸在中-側(cè)向和前-后向的直徑。安置好樣品并且測量完以后，將樣品放到Instron儀上，股骨頸與底盤上的鉆孔邊對齊。預(yù)先加載約1.0N的力。試驗(yàn)以2.5mm/min的速度運(yùn)行直到股骨頸被破壞。
將時(shí)間數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成形變數(shù)據(jù)作載荷-形變曲線。從該曲線中確定非標(biāo)準(zhǔn)化機(jī)械特性，其中包括極限載荷、形變破壞點(diǎn)、破壞能量(曲線下面積)和剛性(線性區(qū)斜率)。這些機(jī)械特性不進(jìn)行任何標(biāo)準(zhǔn)化直接比較，因?yàn)楣晒穷i的幾何形狀復(fù)雜且加載到樣品上的是不同載荷的組合(壓縮力、切割力和彎曲力)。
機(jī)械試驗(yàn)結(jié)果非標(biāo)準(zhǔn)化的機(jī)械特性采集于三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)、扭轉(zhuǎn)試驗(yàn)和脊椎壓縮試驗(yàn)所得到的載荷移位(load displacement)曲線。利用幾何參數(shù)將這些數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。比較標(biāo)準(zhǔn)化參數(shù)的顯著性差異。如果在測定骨時(shí)發(fā)生了問題，則在分析時(shí)將這些試驗(yàn)排除。HAOD組的一個(gè)樣品在右股骨上有一個(gè)異常硬結(jié)，因此沒有測定。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)后認(rèn)為是遠(yuǎn)離中心的數(shù)據(jù)也被排除在下面的分析之外。
三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)用的是股骨，代表了骨皮質(zhì)的機(jī)械特性。圖6和圖7用圖的方式描述了各組的極限應(yīng)力、破壞應(yīng)變、破壞能量和彈性模量數(shù)據(jù)。
AOD治療的效應(yīng)低劑量AOD(LAOD)和高劑量AOD(HAOD)治療的結(jié)果表明在極限應(yīng)力上無顯著差異，雖然有趨勢表明，與OVX對照組相比，LAOD和HAOD組具有更高的極限應(yīng)力(p＝0.062，p＝0.076)。HAOD組和OVX組有相似的應(yīng)變和彈性模量，但是LAOD組具有更高的彈性模量(p＝0.014)和更低的破壞應(yīng)變(p＝0.005)。見圖6和圖7。
總結(jié)試驗(yàn)證明OVX模型是有功能的，因?yàn)榕c假處理相比其骨皮質(zhì)強(qiáng)度和剛性都降低。高、低劑量的AOD藥物治療出現(xiàn)了不同的效應(yīng)。與OVX相比，兩個(gè)劑量都可以使強(qiáng)度增加，但是低劑量更有效，并且可使剛性增加。
脊椎壓縮脊椎壓縮試驗(yàn)用的是第5脊椎椎體，代表了骨小梁的機(jī)械特性。有幾個(gè)脊椎在修剪時(shí)因太靠近椎體而損壞了皮質(zhì)外殼，因此被排除在分析之外。
AOD治療的效應(yīng)LAOD組所具有的彈性模量比OVX對照組高(p＝0.05)。見圖8。
總結(jié)低劑量的AOD治療結(jié)果表明，與OVX相比，其剛性有增加的趨勢，其表現(xiàn)為彈性模量升高。雌激素治療并不能防止由OVX引起的強(qiáng)度和剛性下降，盡管應(yīng)力和彈性模量值較高。總之，與骨皮質(zhì)相比，AOD對骨小梁的影響很小。這說明AOD對骨骼的效應(yīng)與完整的GH相似。已知GH可在骨膜表面增加骨皮質(zhì)的合成。
股骨頸骨折AOD的效應(yīng)AOD可影響股骨頸的形變和剛性。OVX大鼠股骨頸的形變明顯高于高、低劑量AOD組大鼠股骨頸的形變(0.017，0.009)。兩個(gè)AOD組的剛性都高于OVX(p＝0.092，p＝0.023)，但是只有HAOD組有顯著性差異。OVX組的破壞能量明顯升高，這是因?yàn)樗鼈冇懈叩捻g性(p＝0.013，p＝0.008)。AOD治療組的剛性增加，說明OVX大鼠所發(fā)生的骨質(zhì)量下降被遏制。見圖9和圖10。
總結(jié)卵巢切除術(shù)可導(dǎo)致股骨頸的強(qiáng)度和剛性下降。這主要是由于股骨頸的骨小梁丟失造成的。這也再次證明了OVX模型是有功能的。與OVX相比，用高、低劑量的AOD治療使剛性有增加的趨勢，但是其強(qiáng)度沒有差異。這可能是由材料變化如礦物質(zhì)或膠原的變化引起的。
討論我們猜測AOD不能預(yù)防因卵巢切除術(shù)而引起的骨骼變化，從而對骨代謝沒有影響。本研究的結(jié)果證明了我們的猜測是不正確的，AOD確實(shí)對骨骼有效應(yīng)。這一點(diǎn)可以從整個(gè)試驗(yàn)中看出，因卵巢切除術(shù)而引起的許多骨骼變化被阻止。我們認(rèn)為AOD9604肽可能只包含一個(gè)能刺激脂解作用但不能刺激骨代謝的區(qū)域。我們相信，由于完整的GH在體內(nèi)有幾種不同的靶細(xì)胞，因此，AOD與骨細(xì)胞相互作用似乎是合理的。
AOD對骨小梁和骨皮質(zhì)都有影響，但是主要影響骨皮質(zhì)。我們認(rèn)為，AOD對骨骼的效應(yīng)與完整GH分子是一樣的。AOD還可以防止骨皮質(zhì)BMD的下降，機(jī)械試驗(yàn)結(jié)果表明低劑量的AOD可防止骨皮質(zhì)軟化。而AOD對骨小梁的影響不大。
附件1小鼠IGF-I產(chǎn)品編號DY791這種DuoSet ELISA Development試劑盒包含進(jìn)行夾心ELISA以檢測細(xì)胞培養(yǎng)物上清和血清中重組鼠胰島素樣生長因子(IGF-I)所需的基本組分1。每個(gè)試劑盒所包含的材料足夠約15個(gè)96孔板完成ELISA檢測，如果能夠滿足下列條件2●按照通用ELISA操作方法所總結(jié)的進(jìn)行試驗(yàn)。
●使用推薦的微孔板、緩沖液、稀釋液、底物和溶液。
在使用本產(chǎn)品前必須完整閱讀本試劑盒的包裝說明書。
所提供的材料在使用前將所有試劑置于室溫下。
捕獲抗體(Part 841413，1瓶)-用1.0mL PBS重新溶解后倉鼠抗小鼠IGF-I抗體的濃度為720μg/mL。重新溶解后，在2-8℃下儲存可達(dá)60天，或者分裝后儲存在-20℃到-70℃的人工除霜冰箱內(nèi)可保存6個(gè)月3。用PBS稀釋到工作濃度4.0μg/mL，無載體蛋白。
檢測抗體(Part 841414，1瓶)-用1.0mL試劑稀釋液(見所需溶液部分)重新溶解后生物素化的羊抗小鼠IGF-I抗體的濃度為36μg/mL。重新溶解后，在2-8℃下儲存可達(dá)60天，或者分裝后儲存在-20℃到-70℃的人工除霜冰箱內(nèi)可保存6個(gè)月3。用試劑稀釋液稀釋到工作濃度200ng/mL4。
標(biāo)準(zhǔn)品(Part 841415，1瓶)-用0.5mL試劑稀釋液(見所需溶液部分)重新溶解后重組小鼠IGF-I的濃度為100ng/mL。在稀釋前放置標(biāo)準(zhǔn)品至少15分鐘，同時(shí)溫和攪拌。重新溶解的標(biāo)準(zhǔn)品在2-8℃下儲存可達(dá)60天，或者分裝后儲存在-70℃可保存6個(gè)月3。用試劑稀釋液進(jìn)行2倍稀釋，作7點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，推薦的標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度為2000pg/mL。
鏈親和素-HRP(Part 890803，1瓶)-1.0mL連接到辣根過氧化物酶上的鏈親和素。第一次使用以后，在2-8℃下儲存可達(dá)60天3。不要冷凍。利用試劑稀釋液(見所需溶液部分)按照小瓶標(biāo)簽的說明將其稀釋到工作濃度。)
所需溶液PBS-137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4，pH7.2-7.4，0.2μm濾膜過濾。
洗滌緩沖液-0.05％Tween20，溶于PBS中，pH 7.2-7.4(R&D System產(chǎn)品編號#WA126)。
封閉緩沖液-5％Tween 20，溶于PBS中，含0.05％NaN3。
試劑稀釋液1-5％Tween 20，溶于PBS中，pH 7.2-7.4，0.2μm濾膜過濾。
底物溶液-顯色劑A(H2O2)和顯色劑B(四甲基聯(lián)苯胺)(R&D System產(chǎn)品編號#DY999)的1∶1混合物。
終止液-2N H2SO4(R&D System產(chǎn)品編號#DY994)。
通用ELISA操作規(guī)程微孔板的準(zhǔn)備1.用無載體蛋白的PBS將捕獲抗體稀釋到工作濃度。馬上將稀釋的捕獲抗體加入到96孔微孔板5內(nèi)以包被微孔板，每孔加100μl。封上微孔板，在室溫下孵育過夜。
2.吸去孔內(nèi)的溶液，用洗滌緩沖液洗滌，共洗滌3次。用噴水瓶、多道加樣器或自動洗滌儀在每個(gè)孔中都加滿洗滌緩沖液(400μl)進(jìn)行洗滌。在每一步中將液體完全去掉是試驗(yàn)成功所必須的。在最后一次洗滌結(jié)束后，抽吸掉所有剩余的洗滌液，或者通過將微孔板倒扣在-疊干凈的紙上去掉所有剩余的洗滌液。
3.在每孔中加入300μl封閉緩沖液來封閉微孔板。在室溫下至少孵育1小時(shí)。
4.按照步驟2的方法重復(fù)抽吸/洗滌微孔板?，F(xiàn)在微孔板已準(zhǔn)備好，可以加樣了。
試驗(yàn)過程1.每孔中加入100μl試劑稀釋液溶解的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，或者合適的稀釋液。用膠帶覆蓋微孔板，在室溫下孵育2小時(shí)。
2.按照微孔板準(zhǔn)備中步驟2的方法重復(fù)抽吸/洗滌微孔板。
3.每孔中加入100μl試劑稀釋液溶解的檢測抗體。用膠帶覆蓋微孔板，在室溫下孵育2小時(shí)。
4.按照微孔板準(zhǔn)備中步驟2的方法重復(fù)抽吸/洗滌微孔板。
5.每孔中加入100μl鏈親和素-HRP的工作稀釋液。覆蓋微孔板，在室溫下孵育20分鐘。微孔板避免直接光照。
6.按照步驟2的方法重復(fù)抽吸/洗滌微孔板。
7.每孔中加入100μl底物溶液。在室溫下孵育20分鐘。微孔板避免直接光照。
8.每孔中加入50μl終止液。溫和扣打微孔板使溶液充分混合。
9.立刻利用微孔板讀數(shù)儀在450nm處測定每孔的光密度。如果可以校正波長，則設(shè)定到540nm或570nm。如果不能校正波長，則450nm處的讀數(shù)減去540nm或570nm處的讀數(shù)。減去這個(gè)讀數(shù)的目的在于校正微孔板的光學(xué)缺陷。在450nm處直接測定而不校正可能會導(dǎo)致數(shù)值偏高，準(zhǔn)確性下降。
技術(shù)提示和限制●本DuoSet試劑盒在超過標(biāo)簽上標(biāo)注的有效期時(shí)不應(yīng)該再使用。
●用于重新溶解試劑和稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液能夠反映待測樣品的環(huán)境是很重要的。本規(guī)程所推薦的稀釋液適用于大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物的上清樣品。在使用前應(yīng)當(dāng)確認(rèn)稀釋液是否適用于特定的樣品類型。
●本試驗(yàn)所使用的酶和底物的種類以及捕獲/檢測抗體的濃度可以改變以獲得具有不同敏感性和動力學(xué)范圍的免疫分析。要在免疫分析中成功地使用這些試劑需要對免疫分析方法有基本的理解。
●完全而均勻地洗滌技術(shù)是獲得正確試驗(yàn)結(jié)果所必須的。洗滌緩沖液應(yīng)當(dāng)分配均勻，并且應(yīng)當(dāng)通過抽吸或傾倒從孔中徹底去除。將微孔板倒扣在一疊干凈的紙上可去掉所有剩余的洗滌緩沖液。
●在每一步都要更換新的試劑容器和加樣頭。
●推薦所分析的所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都設(shè)雙復(fù)孔。
●避免試劑和緩沖液被微生物污染。微生物污染可影響試驗(yàn)的敏感性。含大量蛋白質(zhì)的緩沖液應(yīng)當(dāng)在無菌條件下配制，并儲存在2-8℃，或者每天配制新鮮的緩沖液。
警告本試劑盒推薦使用的終止液是酸溶液。在使用這個(gè)溶液時(shí)要穿戴眼睛、手、面部和衣服的保護(hù)裝置。
結(jié)果的計(jì)算計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、對照和樣品的雙復(fù)孔讀數(shù)的平均值，減去0標(biāo)準(zhǔn)品光密度的平均值。
利用能作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另外，也可以手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在y軸上點(diǎn)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的平均吸光度值，在x軸上點(diǎn)濃度，通過圖上的點(diǎn)畫一條最擬合的曲線。以IGF-I濃度的對數(shù)對O.D.的對數(shù)作圖則數(shù)據(jù)可能是線性的，通過回歸分析確定最擬合的曲線。這種方法可產(chǎn)生一條充分但精確度低的數(shù)據(jù)擬合曲線。如果樣品經(jīng)過稀釋，那么從曲線上讀出的濃度必須要乘以稀釋倍數(shù)。
典型數(shù)據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)曲線只是為了證明的目的。
每一組分析的樣品都會產(chǎn)生一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
下圖代表使用這種鼠IGF-I DuoSet試劑盒所得到的典型數(shù)據(jù)。利用能進(jìn)行4-PL曲線擬合的計(jì)算機(jī)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
鼠IGF-I DuoSet 特異性分析了含50ng/mL重組鼠IGF-II的樣品，結(jié)果顯示無交叉反應(yīng)或干擾。
含25ng/mL重組人IGF-I的樣品測定結(jié)果為63pg/mL(0.2％的交叉反應(yīng))。
校正
DuoSet試劑盒可用R&D Systems生產(chǎn)的大腸桿菌表達(dá)的高純度重組鼠IGF-I校正。
1用于分析血清樣品時(shí)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)定和確證自己的血清稀釋度。血清稀釋液不能用于稀釋檢測抗體或鏈親和素-HRP。
2由于技術(shù)方法、塑料器具及水源的不同每個(gè)結(jié)果可能會有變化。
3假設(shè)在試劑盒的有效期內(nèi)。
4重新溶解后所有組分最少放置15分鐘，同時(shí)溫和攪拌。工作稀釋液應(yīng)臨時(shí)配制和使用。
5推薦使用Costar EIA Plate(產(chǎn)品編號#2592)。
R&D System Inc. R&D System Europe，Ltd.
15614Mckinley Place NE 19 Barton LaneMinneapolis，MN 55413 Abingdon Science ParkUSAAbingdon.OX 143NB1-800-343-7475United KingdomTel(612)379-2956Tel+44(0)1235 529449Fax(612)656-4400Fax+44(0)1235 533420
序列表<110>新陳代謝制藥有限公司(Metabolic Pharmaceuticals Limited)<120>骨疾病的預(yù)防或治療方法<130>FP21647<150>2004902388<151>2004-05-04<160>22<170>Patentln version 3.3<210>1<211>15<212>PRT<213>人工的<220>
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<221>DISULFID<222>(6)..(13)<400>19Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe1 5 10 15<210>20<211>15<212>PRT<213>人工的<220>
<223>hGH 177-191，在190上是丙氨酸；環(huán)肽<220>
<221>DISULFID<222>(6)..(13)<400>20Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe1 5 10 15<210>21<211>15<212>PRT<213>人工的<220>
<223>hGH 177-191，在187和190上是D-丙氨酸；環(huán)肽<220>
<221>DISULFID<222>(6)..(13)
<220>
<221>Xaa<222>(11)..(11)<223>D-丙氨酸<220>
<221>Xaa<222>(14)..(14)<223>D-丙氨酸<400>21Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Xaa Ser Cys Xaa Phe1 5 10 15<210>22<211>15<212>PRT<213>人工的<220>
<223>hGH 177-191，在191上是丙氨酸；環(huán)肽<220>
<221>DISULFID<222>(6)..(13)<400>22Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療哺乳動物骨疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物治療有效量的能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝但對IGF-1沒有可評估的效應(yīng)的肽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽是人生長激素序列或其功能類似物或變體的氨基酸殘基177-191。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述肽能降低脂肪生成活性；和/或能夠刺激脂解作用。
4.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述肽至少包含哺乳動物生長激素的二硫鍵環(huán)。
5.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述肽選自以下序列參考編號 結(jié)構(gòu)9502 Leu Arg Ile Val Gln Pen Arg Ser Val Glu Gly Ser Pen Gly Phe9405 CH3CO-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9410 H-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9404 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe-CONH29407 Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9408 Leu Arg Ile Val Gln CysLys Ser Val GluGly Ser Cys Gly Phe(酰胺鍵)9604 Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9605 Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9618 Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9607 Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9606 Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9608 Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9403 Leu Arg Lys Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9609 Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9610 Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9612 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9613 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe9615 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe9616 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe9602 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe9501 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu D-Ala Ser Cys D-Ala Phe9601 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述肽包含人生長激素的氨基酸182-189(hGH 182-189)。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述肽包含人生長激素的氨基酸177-191(hGH 177-191)。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述肽是Tyr-hGH 177-191，并且含有序列Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe。
8.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述肽連接到融合伴侶上。
9.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述肽以藥物組合物的形式給藥。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述藥物組合物包含藥用載體。
11.如權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述藥物組合物還包含治療骨疾病的其他活性劑。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述其他活性劑選自以下一種或多種鈣、骨礦物質(zhì)、γ亞麻酸、維生素D、維生素K、雌激素、雌激素模擬化合物、磷酸氫鹽和異黃酮。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述藥物組合物還包含能源。
14.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述肽通過口服、舌下含服、口腔含服、鼻內(nèi)、吸入、透皮、局部或胃腸外途徑，通過皮下、靜脈、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)給藥。
15.如上述權(quán)利要求1到13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述肽以基因改造食品的形式口服給予。
16.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述骨疾病以骨代謝改變?yōu)樘卣鳌?br> 17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述骨疾病選自骨質(zhì)疏松如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、骨量減少、佩吉特病、癌癥患者的溶骨性轉(zhuǎn)移、肝病的骨營養(yǎng)不良以及由腎衰竭或血液透析、骨折、骨手術(shù)、衰老、懷孕和營養(yǎng)不良導(dǎo)致的骨代謝改變。
18.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物也是生長激素缺乏的。
19.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。
20.生長激素C端片段在制造用于治療或預(yù)防哺乳動物骨疾病的藥物中的應(yīng)用。
21.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物還包含治療骨疾病的其他活性劑。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述其他活性劑是選自以下一種或多種鈣、骨礦物質(zhì)、γ亞麻酸、維生素D、維生素K、雌激素、雌激素模擬化合物、磷酸氫鹽和異黃酮。
23.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含能源。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防或治療哺乳動物骨疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物治療有效量的肽，所述的肽能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，但對胰島素樣生長因子－1(IGF－1)卻沒有可評估的效應(yīng)。
文檔編號A61P19/08GK1950103SQ200580014411
公開日2007年4月18日 申請日期2005年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月4日
發(fā)明者E·沃斯 申請人:新陳代謝制藥有限公司