專利名稱：：白藜蘆醇的衍生物在制備治療與免疫相關疾病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及白藜蘆醇的衍生物作為藥物，尤其是作為治療與免疫相關的關節(jié)炎，特別是類風濕關節(jié)炎、脊柱關節(jié)病(尤其是強直性脊柱炎)、骨性關節(jié)炎，的藥物的用途。
背景技術：
：與免疫相關的關節(jié)炎人群患病率約為15%[1]。由于其病因至今尚未完全闡明，其發(fā)病與遺傳、免疫、內(nèi)分泌諸多因素相關，其臨床表現(xiàn)具有明顯的異質(zhì)性，有易侵犯多系統(tǒng)、多器官的特點，是一種可治但又十分難治的一類疾病。每年一個病人的醫(yī)藥費從數(shù)千元到數(shù)萬元不等，對于我們這樣13億人口的大國，需要的花費就是天文數(shù)字了。治療免疫相關的關節(jié)炎主要使用改善病情抗風濕藥[2]，如甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、羥氯喹、金諾芬、青霉胺、來氟米特、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A、霉酚酸酯、"锝亞甲基磷酸鹽等，雖然療效肯定，但毒性較大，起效比較慢，其中毒性相對較低的霉酚酸酯為進口藥物類風濕關節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是一種以慢性進行性關節(jié)病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖卟?，其特征是對稱性多關節(jié)炎，以雙手、腕、肘、膝、踝和足關節(jié)受累最為常見，但是全身其他關節(jié)亦可受累，有的還伴有內(nèi)臟受累，其發(fā)病率約為0.3%，我國約有患者400萬。若不早期有效醫(yī)治，是公共衛(wèi)生的大問題[4]?，F(xiàn)代研究認為，RA的發(fā)病特點為關節(jié)滑膜增生、炎癥細胞浸潤和血管翳形成，進而形成"血管翳一軟骨結合區(qū)"，局部基質(zhì)金屬蛋白酶增加，蛋白多糖減少及細胞因子分泌增加，炎性細胞因子(如TNF-(x、IL-1、IL-6、IL-8等)分泌增加，引起軟骨破壞進而形成"血管翳一骨結合區(qū)"，引起骨的侵蝕和破壞，致關節(jié)融合、毀損、功能喪失。所謂"血管翳"是一種以血管增生和炎性細胞浸潤為特征的肉芽腫組織。有人將它比喻為類腫瘤樣病變[21。目前國際上針對上述發(fā)病機制正在研制各種阻滯炎性細胞因子的制劑，如抗腫瘤壞死因子受體一抗體融合蛋白；Toyama公司的NF-K卩抑制劑(T-614);Angtiotech公司的阻斷蛋白復合物激素蛋白制劑(paclifaxel);先靈一普芳公司的金屬蛋白酶(MMP)抑制劑等。有的已獲得良好的臨床療效。惡性腫瘤是眾所周知的人類殺手，是致人類死亡的首要原因[3]。各國用于惡性腫瘤的防治的花費也是十分驚人的。研發(fā)治療腫瘤的藥物是全球科學家共同努力的方向，科研目標。隨著移植手術的廣泛開展，腔鏡檢查的普及，老年以及慢性肺部疾病大量抗生素治療，全身真菌感染也成為臨床常見病[4]。婦科生殖道真菌感染亦十分常見。研發(fā)作用強、毒性小的抗真菌藥物也是創(chuàng)新的重點和難點。白藜蘆醇(結構式I)存在與多種植物中，特別在葡萄皮和虎杖等含量比較豐富。它是一種植物抗毒、抗菌素[5]。廣泛的研究發(fā)現(xiàn)，其體外試驗具有抑制細胞DNA合成，抑制細胞增殖作用[6~9；抑制氧應激轉錄因子，抑制細胞增殖功能[1(M5];誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖活性[16~19];誘導細胞周期阻滯、控制細胞增殖[2<>~21];抑制環(huán)氧合酶一2(COX—2)[22]，抗自由基損傷，抑制血小板凝聚和20垸合成，減少脂質(zhì)過氧化物，顯著地改善微循環(huán)，防治組織缺血缺氧一再灌注損傷，具有鎮(zhèn)痛抗炎作用。2006年美國芝加哥JohnMPezzuto教授已肯定了白藜盧醇對癌癥的化療作用[23]。國內(nèi)高潔生教授已肯定其抗免疫性相關的關節(jié)炎的作用(其專利申請?zhí)?200510031435.3)。白藜蘆醇的一類衍生物，它具有如下通式(II)其中，&、R2、Rs均選自氫、烷基、烷?；煌瑫r為氫。參考現(xiàn)有技術文獻，其中公開了上述通式白藜蘆醇衍生物的制備方法。本發(fā)明的目的是提供一種白藜蘆醇的衍生物在制備治療與免疫相關疾病的藥物中的用途。本發(fā)明所涉及的白藜蘆醇衍生物較白藜蘆醇有更高的藥效作用，而不良反應
發(fā)明內(nèi)容并不增加。本發(fā)明的技術方案是將式(II)的化合物用于制備治療與免疫相關疾病的藥物中的用途。其中R,、R2、Rs均選自氫、垸基、垸?；煌瑫r為氫。特別是在制備治療類風濕關節(jié)炎、脊柱關節(jié)病、強直性脊柱炎、未分化型脊柱關節(jié)病、銀屑病關節(jié)炎、反應性關節(jié)炎、腸病性關節(jié)炎、骨性關節(jié)炎的藥物中的應用。還特別是在制備治療惡性腫瘤、乳腺小葉增生、真菌病，包括皮膚、泌尿生殖道和全身真菌病的藥物中的應用?；衔锇邹继J醇半衰期短，僅為15分鐘，生物利用度低，而根據(jù)本發(fā)明的實施例白藜蘆醇甲基衍生物(BTM)、乙?；苌?BTY)，不僅較白藜蘆醇(BT)生物利用度提高2倍，半衰期延長4倍，具有更優(yōu)良的生物藥劑學特征，更適合長期口服給藥，治療腫瘤、骨關節(jié)炎、真菌感染等慢性疾病。本發(fā)明公開了白藜盧醇衍生物進一步增強對淋巴細胞的親和性，使其抑制單核細胞、滑膜細胞產(chǎn)生TNF-a能力比白藜蘆醇提高100倍，是一種高效、低毒的免疫抑制劑，動物實驗顯示，其抗炎作用比白藜蘆醇強50倍；白藜蘆醇衍生物抑制COX-2的能力比目前一線治療藥物美洛昔康強50倍，抑制軟骨細胞產(chǎn)生IL-ip的能力比目前療效公認的雙醋瑞因強10倍。兔實驗性關節(jié)炎動物實驗表明，其抗炎能力顯著優(yōu)于雙醋瑞因。白藜盧醇甲基化衍生物(BTM)經(jīng)免疫熒光檢測法和微管蛋白聚合測定法證實具有破壞微管和顯著抑制微管蛋白聚合的作用。白藜蘆醇乙?；苌?BTY)、白藜蘆醇甲基化衍生物(BTM)體外試驗表明對白色念珠菌具有抑制和殺菌作用。白藜蘆醇衍生物，尤其是白藜蘆醇乙?；苌?BTY)、白藜蘆醇甲基化衍生物(BTM)安全性極高，無毒性，測不到LD50。本發(fā)明公開的白藜蘆醇的衍生物在制備治療與免疫相關疾病的藥物中的用途，不但與現(xiàn)有的其他藥物相比具有強的藥效作用，而且比該衍生物的先導物白藜蘆醇也有更強的作用。具體實施方式實施例1白藜蘆醇甲基化衍生物(BTM)的制備可以按
背景技術：
中公開的方法制備，也可以用下列方法制備。白藜戸醇50g攪拌溶于350mL丙酮中，加入70mL硫酸二甲酯和85g無水碳酸鉀，30-40。C下靜置24小時，間歇攪拌。反應完成后傾入水中，以乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮至干，得粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物40g溶于氯仿中，與硅膠拌和待干后，填裝于硅膠柱頂進行柱層析，以體積比為8:2的石油醚-氯仿洗脫。收集合并白藜蘆醇甲基化衍生物部分，減壓蒸餾除去溶劑，所得物用無水乙醇重結晶，得白藜蘆醇甲基化衍生物32g。實施例2白藜蘆醇乙?；苌?BTY)的制備?？梢园?br>背景技術：
中公開的方法制備，也可以用下列方法制備。白藜蘆醇60g攪拌溶于180mL無水吡啶中，加入225mL乙酸酐，35-45。C下靜置24小時，間歇攪拌。反應完成后傾入水中，以乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮至干，得粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物56g溶于氯仿中，與硅膠拌和待干后，填裝于硅膠柱頂進行柱層析，以體積比為8:3的石油醚-氯仿洗脫。收集合并白藜戸醇乙?；苌锊糠?，減壓蒸餾除去溶劑，所得物用95%乙醇重結晶，得白藜蘆醇乙?；苌?2g。實施例3.白藜蘆醇乙?；苌?簡稱BTY)對兔實驗性骨關節(jié)炎的影響材料與方法實驗動物實驗動物健康新西蘭兔(中南大學湘雅二院實驗動物室提供)36只，雌雄各半，體重1.5-2kg。合格證SCXK(湘)2003—0003實驗藥物BTY(中南大學自制，純度98.5%)，硫酸氨基葡萄糖(陽性藥物，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，0504081)。試劑根據(jù)成人用藥量與實驗動物用藥的換算公式，計算出每只兔子每天用BTY高劑量120mg/kg，中劑量60mg/kg,低劑量30mg/kg，含計算出每只兔子每天用硫酸氨基葡萄糖35mg/kg配成濃度35mg/mL的溶液。實驗儀器BECKMAN分光光度計，NiKonYS700型顯微鏡，LEICARM2135切片機，YT-6C生物組織攤片機，LEICATP1020全自動脫水機。實驗試劑盒一氧化氮試劑盒(晶美生物工程有限公司，20060418);—氧化氮合酶試劑盒(南京建成生物工程研究所，20060718);谷丙轉氨酶試劑盒日本第一化學藥品株式會社制造號068RBD;尿素氮試劑盒日本第一化學藥品株式會社制造號068RBD;肌肝試劑盒日本第一化學藥品株式會社制造號068RBD實驗方法(1)骨關節(jié)炎模型的建立36只新西蘭兔隨機分為四組正常組(A組)，模型組(B組)，硫酸氨基葡萄糖(C組)，BTY組(D高組)(D中組)(D低組)(分別為高、中、低劑量)。共6組，每組6只。同等條件下正常飼養(yǎng)1周后BCD組造模，參考Hulth造模方法，用3%戊巴比妥鈉從兔耳緣靜脈麻醉后，將兔仰臥捆綁于手術臺上。取右膝關節(jié)內(nèi)側副韌帶、前交叉韌帶，完整切除內(nèi)側半月板，逐層縫合傷口，無菌敷料及繃帶包扎固定。術后應用抗生素5天，分籠喂養(yǎng)。(2)樣本與取材手術8周后兔膝攝關節(jié)前后位CR片，觀察膝關節(jié)X線表現(xiàn)。手術8周后開始按體重灌胃，模型組灌喂生理鹽水，5mL/天。C組灌硫酸氨基葡萄糖、D組按高、中、低劑量灌BTY。給藥6周后再攝膝關節(jié)前后位CR片，觀察膝關節(jié)X線表現(xiàn)。灌胃6周后取標本自兔耳緣靜脈取血10mL，取血清。將兔麻醉，造模膝關節(jié)剪毛，消毒，用lmL生理鹽水沖洗關節(jié)腔，抽出沖洗液，3000r/min離心10min，取上清液，待測NO。再將兔稱重處死取其心、肝、腎、脾，用精密天平稱重。兔處死后立即切開膝關節(jié)，做大體觀察，量造模膝關節(jié)周徑，后以銳利刀片切取膝關節(jié)前正中部分的滑膜組織，經(jīng)石蠟包埋后做HE染色觀察；再切取股骨內(nèi)髁軟骨，修成lmmxlmmxlmm的全軟骨層標本置于10%甲醛固定，系列脫水、10。/。EDTA脫鈣IO天，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，以備光鏡觀察。(3)統(tǒng)計學處理方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件處理。各組數(shù)據(jù)采用均值士標準差表示，組間差異采用雙側t檢驗，P〉0.05為無顯著性差異，PO.05為有顯著性差異，P〈0.01差異極顯著。實驗結果X線觀察正常組膝關節(jié)內(nèi)外側間隙均勻一致,股骨髁、脛骨平臺關節(jié)面輪廓清晰、光整；模型組膝關節(jié)內(nèi)側間隙明顯變窄，外側間隙增大，膝關節(jié)失穩(wěn)，股骨髁、脛骨平臺關節(jié)面不光整；藥物組膝關節(jié)內(nèi)側間隙變窄，外側間隙增大稍寬，，但與模型組相比，股骨髁、脛骨平臺關節(jié)面尚光整。肉眼觀察正常組兔膝關節(jié)軟骨外觀呈藍灰色，色澤明亮，無裂紋及及軟化，觸之較硬；模型組兔關節(jié)軟骨明顯失去原有光澤、發(fā)黃，色澤變暗淡，軟骨觸之較軟，尤以股骨內(nèi)髁較明顯，滑膜存在不同程度增生、粘連，關節(jié)液量增多，且呈泡沫狀、渾濁，未見明顯骨贅形成；藥物組可見關節(jié)軟骨外觀呈白色，欠光滑，股骨內(nèi)髁觸之變軟，滑膜輕度增生，炎性表現(xiàn)也較模型組輕。CD組差異不明顯。光鏡觀察原則評分標準0分關節(jié)面光整，色澤如常；1分關節(jié)面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗；2分關節(jié)面糜爛，軟骨缺損深達軟骨表中層；3分關節(jié)面潰瘍形成，缺損深達軟骨深層；4分軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露。解剖顯微鏡下軟骨OA評分見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>6個樣本均數(shù)兩兩比較的q檢驗正常組與模型組比較PO.01有顯著性差異模型組與陽性組比較PX).05無顯著性差異模型組與藥物組比較PO.01有顯著性差異陽性組與藥物組(高劑量，低劑量)比較PO.01有顯著性差異陽性組與藥物組(中劑量)比較PX).05無顯著性差異(1)A組(正常組)軟骨表面光滑，由淺入深可分為表淺層、移行層、放射層、l丐化層。軟骨細胞排列成柱狀，未見軟骨細胞簇，潮標線完整。(2)B組(造模組)軟骨表面不光滑，出現(xiàn)多個裂隙，部分軟骨剝脫，形成缺損區(qū)。表面出現(xiàn)多個空隙窩，軟骨細胞消失，部分軟骨細胞固縮，偏于一側。關節(jié)面有壓痕。深層出現(xiàn)軟骨細胞簇積現(xiàn)象，軟骨下骨板增厚。(3)C組(陽性組)軟骨表面較光滑，軟骨增生，表面出現(xiàn)部分空隙窩，柱狀排列較明顯。(4)D組(藥物組)軟骨表面有表淺裂隙，尚光滑，軟骨細胞柱狀排列整齊，軟骨數(shù)目多，關節(jié)面整齊。肝、腎功能結果共計36份肝、腎功能結果，統(tǒng)計如下ALT(谷丙轉氨酶)組例數(shù)平均數(shù)A(正常組)664.20±25.45B(模型組)680.92±30.43C(陽性組)685.卯±31.38Dl(高劑量)657.03±24.34D2(中劑量)666.43士38.82D3(低劑量)645.07±12.48各組資料服從正態(tài)分布結論經(jīng)過方差分析，得P-0.1644組間比較P>0.05無顯著性差異BUN(尿素氮)組例數(shù)平均數(shù)A(正常組)67.90±2.21B(模型組)612.95±1.71C(陽性組)67.589±0.77Dl(高劑量)69.05±1.34D2(中劑量)68.49±1.91D3(低劑量)69.40±1.75各組資料服從正態(tài)分布結論經(jīng)過方差分析，得P-0.3638正常組與模型組比較PO.01有顯著性差異正常組與藥物組比較P>0.05無顯著性差異模型組與其它各組比較PO.01有顯著性差異CREA(肌肝)組例數(shù)平均數(shù)A(正常組)677.5833±31.40B(模型組)663.0000±10.58C(陽性組)676.0000土9.37Dl(高劑量)683.5000±7.93D2(中劑量)665.3333±14.31D3(低劑量)670.7667±23.96各組資料服從正態(tài)分布組間比較P>0.05無顯著性差異TP(總蛋白)組例數(shù)平均數(shù)A(正常組)652.83±2,70B(模型組)642.03±24.28<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>各組資料服從正態(tài)分布正常組與其它各組比較P>0.05無顯著性差異模型組與藥物組(高劑量)、藥物組(低劑量)相比PO.05有顯著性差異GLO(球蛋白)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>各組資料服從正態(tài)分布正常組與其它各組比較P>0.05無顯著性差異模型組與藥物組(高劑量)、藥物組(低劑量)相比PO.05有顯著性差異血液生化指標的檢測結果，正常組與藥物灌胃組相比，無顯著性差異，說明白藜蘆醇對骨關節(jié)炎模型兔血生化指標無明顯影響。WBC(白細胞計數(shù))<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>各組資料服從正態(tài)分布P=0.2706組間比較P〉0.05無顯著性差異HGB(血紅蛋白)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>各組資料服從正態(tài)分布經(jīng)方差分析，得P^.1966，組間比較P>0.05無顯著性差異周徑組例數(shù)平均數(shù)A(正常組)611.82±0.52B(模型組)614.32±0.80C(陽性組)613.55±1.18Dl(高劑量)612.82±1.52D2(中劑量)613.00±0.71D3(低劑量)612.43士0.65各組資料服從正態(tài)分布經(jīng)過方差分析，得P:0.0021正常組與模型組比較PO.05正常組與各藥物組比較P>0.05有顯著性差異無顯著性差異血清中NOS(—氧化氮合酶)組例數(shù)平均數(shù)A(正常組)611.44±0.90B(模型組)614.45±3.75C(陽性組)619.03±2.56Dl(高劑量)614.89±3.59D2(中劑量)614.18士2.95D3(低劑量)613.68±3.33各組資料服從正態(tài)分布P=0.1464正常組與模型組相比P>0.05無顯著性差異正常組與陽性組相比PO.05有顯著性差異正常組與藥物組相比P>0.05無顯著性差異血清中NO(—氧化氮)組例數(shù)平均數(shù)A(正常組)656.49±16.28B(模型組)669.50±15.34C(陽性組)622.22±13.36Dl(高劑量)617.37±11.18D2(中劑量)624.85±20,82D3(低劑量)622.83±14.08各組資料服從正態(tài)分布P=0.1420正常組與模型組、陽性組相比:P>0.05無顯著性差異正常組與藥物組相比P<0.05有顯著性差異模型組與藥物組相比P<0.01有顯著性差異陽性組與藥物組相比P>0.05無顯著性差異關節(jié)液中NO(—氧化氮)組例數(shù)NOPA(正常組)614.75±3.66B(模型組)639.76±4.27O.01C(陽性組)69.59±5.07>0.05Dh(高劑量)610.87±8,90>0.05<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>_卡方值=9.8822，P=0.0786按3=0.0500水準，可以認為該資料方差齊正常組與模型組比較PO.01有顯著性差異正常組與藥物組比較P>0.05無顯著性差異模型組與其它各組比較PO.01有顯著性差異陽性組與藥物組比較P>0.05無顯著性差異結論白藜蘆醇衍生物，特別是乙?；苌飳ν脤嶒炐怨顷P節(jié)炎有明顯治療作用。且沒有明顯的不良反應，安全性好。實施例4白藜蘆醇甲基化衍生物(BTM)治療兔實驗性骨關節(jié)炎的療效研究材料與方法實驗動物實驗動物健康新西蘭兔(中南大學湘雅二院實驗動物室提供)36只，雌雄各半，體重1.5-2kg。合格證SCXK(湘)2006—0001實驗藥物白藜，醇(BT)、白藜^醇乙酰化衍生物(BTY)、白藜盧醇甲基化衍生物(BTM)(中南大學自制，純度98.5%，061124)，雙醋瑞因膠囊(安必丁，陽性藥物，TRBPHARMAS.A.20050515)。試劑根據(jù)成人用藥量與實驗動物用藥的換算公式，計算出每只兔子每天用BT、BTY、BTM120mg/kg，配成濃度60mg/mL的溶液。每只兔子每天用安必丁4.6mg/kg，配成濃度4.6mg/mL的溶液。實驗儀器BECKMAN分光光度計，NiKonYS700型顯微鏡，LEICARM2135切片機，YT-6C生物組織攤片機，LEICATP1020全自動脫水機。實驗試劑盒谷丙轉氨酶試劑盒日本第一化學藥品株式會社制造號068RBD;尿素氮試劑盒日本第一化學藥品株式會社制造號068RBD;肌肝試劑盒日本第一化學藥品株式會社制造號068RBD實驗方法(1)骨關節(jié)炎模型的建立將30只新西蘭兔同等條件下正常飼養(yǎng)1周后造模，參考Hulth造模方法，用3%戊巴比妥鈉從兔耳緣靜脈麻醉后，將兔仰臥捆綁于手術臺上。取右膝關節(jié)內(nèi)側副韌帶、前交叉韌帶，完整切除內(nèi)側半月板，逐層縫合傷口，無菌敷料及繃帶包扎固定。術后應用抗生素5天，分籠喂養(yǎng)。手術8周后兔膝攝關節(jié)前后位X片，觀察膝關節(jié)X線表現(xiàn)，造模成功后隨機分為五組模型組(B組)，安必丁組(C組)，BT組(D組)，BTY組(E組)，BTM組(F組)，共5組，每組6只。另選6只正常兔同等條件下正常飼養(yǎng)，作為正常組(A組)。(2)樣本與取材手術8周后開始按體重灌胃，灌胃前攝膝關節(jié)前后位X片。正常組、模型組灌喂生理鹽水，5ml/天。C組灌安必丁4.6mg/kg/d、D組灌BT120mg/kg/d、E組灌BTY120mg/kg/d、F組灌BTM120mg/kg/d。給藥6周后再攝膝關節(jié)前后位X片，觀察膝關節(jié)X線表現(xiàn)。灌胃期間C組因腹瀉死亡1只。灌胃6周后取標本自兔耳緣靜脈取血10mL，取血清；將兔麻醉，造模膝關節(jié)剪毛，消毒，用lmL生理鹽水沖洗關節(jié)腔，抽出沖洗液；再將兔稱重處死取其心、肝、腎、脾，用精密天平稱重，兔處死后立即切開膝關節(jié)，做大體觀察，量兩側(手術側與正常側)膝關節(jié)周徑，后以銳利刀片切取手術側膝關節(jié)前正中部分的滑膜組織；再切取股骨內(nèi)髁軟骨，修成lmmXlmmXlmm的全軟骨層標本置于10%甲醛固定，系列脫水、10。/。EDTA脫鈣IO天，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，以備光鏡觀察。另取滑膜組織與軟骨標本放液氮中保存。(3)統(tǒng)計學處理方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件處理。各組數(shù)據(jù)采用^土S)表示，組間差異采用雙側^檢驗。實驗結果X線觀察正常組膝關節(jié)內(nèi)外側間隙均勻一致,股骨髁、脛骨平臺關節(jié)面輪廓清晰、光整；模型組膝關節(jié)內(nèi)側間隙明顯變窄，外側間隙增大，膝關節(jié)失穩(wěn)，股骨髁、脛骨平臺關節(jié)面不光整；藥物組膝關節(jié)內(nèi)側間隙變窄，外側間隙增大稍寬，，但與模型組相比，股骨髁、脛骨平臺關節(jié)面尚光整。肉眼觀察正常組兔膝關節(jié)軟骨外觀呈藍灰色，色澤明亮，無裂紋及及軟化，觸之較硬；模型組兔關節(jié)軟骨明顯失去原有光澤、發(fā)黃，色澤變暗淡，軟骨觸之較軟，尤以股骨內(nèi)髁較明顯，滑膜存在不同程度增生、粘連，關節(jié)液量增多，且呈泡沫狀、渾濁，未見明顯骨贅形成；藥物組可見關節(jié)軟骨外觀呈白色，欠光滑，股骨內(nèi)髁觸之變軟，滑膜輕度增生，炎性表現(xiàn)也較模型組輕。藥物組膝關節(jié)腔手術側與正常側差異明顯低于模型組膝關節(jié)腔兩側的差異。光鏡觀察(1)A組(正常組)軟骨表面光滑，由淺入深可分為表淺層、移行層、放射層、鈣化層。軟骨細胞排列成柱狀，未見軟骨細胞簇，潮標線完整。(2)B組(造模組)軟骨表面不光滑，出現(xiàn)多個裂隙，部分軟骨剝脫，形成缺損區(qū)。表面出現(xiàn)多個空隙窩，軟骨細胞消失，部分軟骨細胞固縮，偏于一側。關節(jié)面有壓痕。深層出現(xiàn)軟骨細胞簇積現(xiàn)象，軟骨下骨板增厚。(3)C組(安必丁組)軟骨表面較光滑，軟骨增生，表面出現(xiàn)部分空隙窩，柱狀排列較明顯，關節(jié)面整齊。(4)D組(BT組)軟骨表面有表淺裂隙，尚光滑，軟骨細胞柱狀排列較整齊，軟骨數(shù)目較多，關節(jié)面整齊。(5)E組(BTY組)軟骨表面有表淺裂隙，尚光滑，軟骨細胞柱狀排列較整齊，軟骨數(shù)目較多，關節(jié)面整齊。(6)F組(BTM組)軟骨表面較光滑。軟骨細胞柱狀排列整齊，軟骨數(shù)目較多，關節(jié)面整齊。肝、腎功能結果:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>血常規(guī)結果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>膝關節(jié)周徑結果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結論模型組與藥物組比較，藥物對軟骨的退變有較好的延緩作用。組織學觀察發(fā)現(xiàn)，藥物組的軟骨細胞增生明顯活躍，說明該藥物可增強軟骨的修復作用。血液生化指標的檢測結果顯示谷丙轉氨酶ALT、總蛋白TP、白蛋白ALB、尿素氮BUN值藥物組與正常組相比，無顯著性差異。藥物組紅細胞計數(shù)、血小扳計數(shù)低于正常組；藥物組白細胞值較正常組稍高，血紅蛋白值正常。藥物組兔肝、腎功能基本正常。說明各組實驗藥物安全性高。模型組手術側兔膝關節(jié)較正常側膝關節(jié)明顯腫脹，藥物組兩側關節(jié)周徑差異明顯低于模型組，表明該藥物具有消腫作用。實施例5抗腫瘤作用白藜蘆醇(BT)、白藜蘆醇乙酰化衍生物(BTY)、白藜戸醇甲基化衍生物(BTM)對小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子-a的抑制作用目的腫瘤壞死因子-ct(TNF-(X)是與免疫相關的關節(jié)炎發(fā)病機制中的關鍵致病的炎性細胞因子。目前市場上治療類風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎作用強，起效快的藥物首選TNF-a抑制劑，如注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體一抗體融合蛋白(商品名益賽普)。研究白藜蘆醇(BT)、白藜蘆醇乙?；苌?BTY)、白藜蘆醇甲基化衍生物(BTM)對巨噬細胞產(chǎn)生的TNF-ot的抑制作用，將為其潛在的治療與免疫相關的關節(jié)炎提供初步的實驗依據(jù)。方法(1)小鼠腹腔巨噬細胞的制備，給藥及培養(yǎng)小鼠(C57BL/6，雄性，6-8周齡)，i.p.3X巰基乙醇酸鈉培養(yǎng)液lmL，4d后斷頭處死，用磷酸緩沖液OBS)無菌洗出腹腔巨噬細胞，用BPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞兩次，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為lxl()S個/mL,加入24孔板，每孔lmL，于37"，5%C02。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，用PBS洗去末粘附細胞，每孔再分別加人含白藜蘆醇(BT)、白藜蘆醇乙?；苌?BTY)、白藜蘆醇甲基化衍生物(BTM)各5個不同濃度的RPMI1640培養(yǎng)液lmL，或不含樣品的陰性對照，培養(yǎng)0.5小時后，分別加入脂多糖(LPS，10mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，分別收集上清液，用LPS透析12小時，再用RPMI1640培養(yǎng)液平衡12小時，-20'C凍存?zhèn)溆谩?2)L929細胞結晶紫染色法測樣品TNF-cx活性和抑制率，L929細胞長滿單層后用0.025%胰酶消化，重懸細胞于含10%NBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，調(diào)細胞濃度為3Xl()5個/mL，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100ul，力口2ul/mL放射菌素D液100ul，RPMI-1640液或待測樣品100ul，37°C，5%0)2下培養(yǎng)2011，去上清液，每孔加0.5%結晶紫液200ul，染色IOmin，流水洗去細胞外結晶紫，常溫干燥加10%SDS100ul，測吸收度A570值，以RPMI-1640液孔為對照，細胞毒百分率表示樣品所含TNF-a活性，抑制百分率表示化合物對小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNF-a的抑制程度，以抑制百分率表不樣品A值細胞毒百分率(％)=(1_-)X100對照A值樣品細胞毒百分率抑制百分率(％)=(l—-)X100陰性對照細胞毒百分率數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以X土s表示，顯著性測定用Z檢驗。實驗結果白藜蘆醇(BT)、白藜蘆醇乙酰化衍生物(BTY)、白藜聲醇甲基化衍生物(BTM)分別在100uM、30uM、l.OuM的濃度以上經(jīng)LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生的TNF-a有明顯的抑制作用，抑制率分別為46.3%、59.6%禾卩76.9%，P值均小于O.Ol。結果見下白藜蘆醇(BT)、白藜蘆醇乙酰化衍生物(BTY)、白藜盧醇甲基化衍生物(BTM)對ConA刺激的小鼠腹腔巨噬細胞TNF-a生成的抑制作用樣品濃度(uM)對TNF—a生成抑制率％白藜盧醇10046.3白藜盧醇乙?；苌?059.6白藜盧醇甲基化衍生物1.076.9實施例6抗腫瘤作用[白藜蘆醇(BT)、白藜蘆醇乙?；苌?BTY)、白藜蘆醇甲基化衍生物(BTM)對食管癌細胞EC109生長抑制測定]目的對細胞生長抑制作用是反應干擾因素在細胞生長、發(fā)育周期的第一環(huán)節(jié)或者幾個環(huán)節(jié)受到影響客觀指標。測試白藜蘆醇(BT)、白藜蘆醇乙?；苌?BTY)、白藜蘆醇甲基化衍生物(BTM)對食管癌細胞EC109生長抑制，將顯示對生長活躍細胞具有治療作用方法將EC109細胞接種在96孔板上(2X1()S個細胞)，置37。C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后更換含不同濃度的樣品的DMEM培養(yǎng)液，隨后每48小時更換1次新鮮含樣品或不含樣品(空白對照)的培養(yǎng)液分別于36小時、120小時、168小時、216小時、264小時加入50ul50X三氯乙酸終止生長，然后加入8ulforhodamineB染色，于490nm波長測吸光度，通過每孔所含蛋白濃度反映細胞的生長率。結果白藜蘆醇、白藜蘆醇乙?；苌?、白藜蘆醇甲基化衍生物對EC109細胞生長抑制情況見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>結論32uM的白藜盧醇、8uM的白藜盧醇乙?；苌铩?.5uM的白藜戸醇甲基化衍生物可以顯示對EC109細胞有生長抑制作用。實施例7抗腫瘤作用(白藜蘆醇甲基化衍生物對EC109細胞微管損害的免疫熒光檢測)目的通過檢測樣品對細胞微管的損害，將顯示樣品可能專針對微管為作用靶點的抗癌藥。方法(1)A549細胞傳代培養(yǎng)5天，使細胞呈單層，共17瓶，然后分別更換新鮮含待測3個不同濃度的白藜蘆醇甲基化衍生物(BTM)(5uM、10uM、50uM)和陽性對照藥物紫杉醇(8uM)、不含任何藥物DMEM培養(yǎng)液，37°C，培養(yǎng)2小時，然后各瓶細胞倒去培養(yǎng)液，用0.5%TritonX-100MTBS緩沖液處理5min，隨后用100%乙醇-20。C固定5min，再用1%TritonX-100PBS緩沖液處理15min，用PBS緩沖液沖洗。(2)經(jīng)上述處理好的細胞加入含5%羊血清的PBS緩沖液在室溫孵育40min，倒去上述緩沖液，加入鼠抗兔B—型微管球蛋白單克隆抗體4。C孵育過夜，用PBS緩沖液洗3次。G)經(jīng)上述處理好的細胞加入熒光素標記的羊抗鼠IgG抗體在孵育45min，用PBS緩沖液沖洗3次，封片，待熒光顯微鏡觀察。結果(1)經(jīng)陽性對照藥物處理的細胞漿中的微管蛋白網(wǎng)絡被破壞，呈短片段熒光圖象；而不含藥物處理的細胞漿中微管蛋白致密，呈規(guī)則的熒光圖象。(2)5uM白藜蘆醇甲基化衍生物處理的細胞漿中呈現(xiàn)短片段微管熒光圖像，類似于8uM紫杉醇處理的細胞漿熒光圖像。結論-白藜蘆醇甲基化衍生物對細胞微管有破壞作用，且其強度與劑量呈依賴性。實施例8抗腫瘤作用(白藜蘆醇甲基化衍生物對微管蛋白聚合作用的測定)目的通過檢測樣品對微管蛋白的聚合作用的抑制，將從另一個角度反映樣品可能針對微管為靶點的抗癌藥。方法(1)每毫升含2.5mg的純微管蛋白用含不同濃度的白藜盧醇甲基化衍生物(5uM、10uM、50uM)和不含樣品的G-PEN緩沖液稀釋。(2)上述稀釋好的微管蛋白置培養(yǎng)小瓶中37'C培養(yǎng)。(3)每5min分別取樣在340um分光光度測定結果(1)不含藥物處理的微管蛋白的吸光度隨時間而增加(2)白藜蘆醇甲基化衍生物處理的微管蛋白的吸光度呈藥物劑量和時間相關的降低，表示它們能阻止微管蛋白聚合；白藜蘆醇甲基化衍生物(BTM)IC50為5uM。結論白藜蘆醇乙?；苌?、白藜蘆醇甲基化衍生物能呈劑量和時間相關的方式抑制微管蛋白聚合，具有破壞微管作用的抗癌藥物效應。實施例9抗真菌作用[白藜蘆醇乙?；苌?BTY)、白藜盧醇甲基化衍生物(BTM)對白色念珠菌的抑菌和殺菌作用]目的通過檢測BTY、BTM樣品對白色念珠菌的抑菌和殺菌作用，將顯示起潛在的抗真菌病的藥理作用。方法(1)最小抑菌濃度(MIC)的測定將待測樣品分別用二甲苯配成0.1%的溶液，將大扶康注射液配成0.2%的溶液，并以二倍稀釋法分別制成10個不同濃度梯度的沙氏培養(yǎng)基，放入平皿內(nèi)制成平板，另設0.9%氯化鈉注射液為對照。用0.9%氯化鈉注射液調(diào)整白色念珠菌菌液濃度為lXl()Scfu/Ml，以劃線法將菌液接種于上述培養(yǎng)基中，置28'C孵箱中培養(yǎng)，于不同時間觀察結果。以未生長菌的最低藥物濃度為最小抑菌濃度(MIC)。(2)最小殺菌濃度(MBC)的測定將0.1%的待測樣品溶液和0.2%的大扶康溶液以二倍稀釋法分別制成10個不同濃度梯度的沙氏液體培養(yǎng)基,并分別取出5mL移入試管內(nèi)，另設O.9%氯化鈉注射液為對照。用O.9%氯化鈉注射液調(diào)整白色念珠菌菌液濃度為lX10、fu/mL。分別取0.05mL菌液接種于試管中，置28'C孵箱中培養(yǎng)，于不同時間觀察結果。在此基礎上,用無生長菌的試管溶液，經(jīng)充分搖勻后，取O.lmL接種于沙氏培養(yǎng)基中，于28'C孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察結果。以無真菌生長的最低藥物濃度為最小殺菌濃度(MBC)。結果(1)MIC:對白色念珠菌大扶康溶液的MIC為0.78iig/mL,白藜蘆醇乙?；苌锶芤旱腗IC為6.25ug/mL，白藜蘆醇甲基化衍生物溶液的MIC為0.39ug〃mL，各藥對白色念珠菌有較好的抑制作用，白藜蘆醇甲基化衍生物溶液的MIC明顯小于大蒜油注射液，結果見下表。(2)MBC:大扶康溶液未測出MBC值。白藜蘆醇乙?；苌?、白藜蘆醇甲基化衍生物可測出MBC值，對白色念珠菌有殺滅作用，MBC分別為12.5ug/mL，白藜蘆醇甲基化衍生物為0.78ixg/mL結果見下表。BTY、BTM和大扶康溶液對白色念珠菌的MIC、MBC結果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>結論從抑菌(MIC)試驗結果看，不同培養(yǎng)時間對大扶康、待測樣品的MIC有影響，為確定MIC值，對白色念珠菌的培養(yǎng)時間不得少于48h。白藜蘆醇乙酰化衍生物、白藜蘆醇甲基化衍生物的MIC分別為6.25、0.39ug/mL;白藜蘆醇乙?；苌铩邹继J醇甲基化衍生物的MBC分別為12.5、0.78ug/mL。實驗顯示白藜蘆醇乙?；苌飳Π咨钪榫囊种谱饔煤痛蠓隹等芤合喈?，并且還具有殺菌作用；白藜盧醇甲基化衍生物對白色念珠菌的抑菌作用比大扶康溶液強，而且還具有殺菌作用。實施例10.白藜蘆醇甲基化衍生物(BTM)的急性毒性實驗目的觀察BTM對小鼠的急性毒性反應，為臨床用藥提供科學依據(jù)。實驗材料-(1)藥物BTM(070108)，中南大學湘雅二醫(yī)院自制，純度98.5%，配成濃度60mg/mL溶液，CMCNa(10%)為溶劑。(2)動物健康昆明小白鼠21只，雌雄各半，體重20±0.5克，中南大學湘雅二醫(yī)院動物實驗室提供，合格證SCXK(湘)2006-0001實驗方法(1)計算公式小鼠劑量二KX兔劑量，查資料K=2.7，兔劑量為120mg/kg，換算為小鼠劑量為324mg/kg，20克小鼠灌胃6.5mg，約O.llmL。(2)取健康昆明小鼠21只(l只正常對照，20只灌胃)，20只小鼠禁食12h，分為A、B二組，每組10只，A組鼠灌胃O.llmL/只，含藥6.5mgB組鼠灌胃0.22mL/只，含藥13mg。給藥后連續(xù)觀察一周，自由飲水和進食，記錄各組動物給藥后的癥狀、體征及其死亡數(shù)目和時間。一周后解剖動物肉眼觀察主要臟器，觀察有無出現(xiàn)異常改變。實驗結果A組、B組均無動物死亡。第一天灌胃四小時內(nèi)A組小鼠精神萎靡，活動減少，毛蓬松無光澤；B組小鼠精神萎靡，活動減少，毛蓬松無光澤，少數(shù)有嘔吐及呼吸急促現(xiàn)象。第二天小鼠活動開始增多，食欲普遍降低，體重均減輕。結論上述實驗證實BTM超大劑量下(劑量324mg/kg、648mg/kg對小鼠的神態(tài)、活動、毛發(fā)和食欲有一定影響，但其LD50測不到。實施例11BTM藥動學研究結果1)大鼠體內(nèi)血藥濃度及藥動學參數(shù)測定取雄性SD-大鼠(250350g),按高，中,低三個劑量組(11=5),單劑量灌胃給予BTM-0512(齊!J量28mg/kg、56mg/kg、112.8mg/kg)后，分另U于0,0.5，1，1.5，2,2.5,3,4，6,8，10，12，14，16,24h，采集血漿，用HPLC-UV法測定血漿中BTM-0512濃度，所測數(shù)據(jù)用DASver2.0藥學與統(tǒng)計程序(孫瑞元等編)的藥動學模塊處理，結果多數(shù)大鼠的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)用一室模型權重取l時擬合較好。藥動學參數(shù)為V/F分別為10.48±7.18L、22.23±6.3L和14.4±7.6L;L^分別為2.2土0.27h、2.5±0.5h禾口3.4±1.64h，說明本品口服達峰較快；C,分別為1.63±0.63嗎/L、1.93±0.27|ag/L和4.5±2.33嗎/L，AUC。~24分別為8.54±2.72叫/L*h、11.30±3.18叫/L*h和32.27±13.5嗎/L*h，AUC?！謩e為8.72±2.75嗎/L*h、11.70嗎±3.20/L*h和33.17±13.4)ug/L*h，說明BTM-0512體內(nèi)吸收程度(C鵬"AUC?！?4、AUC)有劑量依賴性，CL/F分別為3.62±1.65L/h、5.04±1.16L/h和3.81±1.30L/h，低、中、高三種劑量的清除率相近；t^分別為1.88±0.36h、3.04±0.56h和2.48±0.61h，低、中、高三種劑量的消除半衰期相近，與給藥量無關；MRT。~72分別為5.03±0.86h、6.57土0.23h和5.98士1.46h,低、中、高三種劑量的體內(nèi)平均滯留時間相近。2)大鼠體內(nèi)分布測定取雄性SD-大鼠(250350g)25只,分為5組(r^5),單劑量灌胃給予BTM-0512(劑量:112.8mg/kg)后，于1，2，4,6，8，12h，處死動物，分別取血及心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、腦、肌肉、脂肪，睪丸等十一個臟器，制備勻漿后，用HPLC-UV法測定組織及血槳中BTM-0512濃度，計算含量(ug/g)。結果表明，BTM-0512在大鼠組織及血漿中的平均分布量順序依次為(ug/g):肝〉脂肪〉胃〉腦〉心〉小腸>肺腎>脾〉肌肉〉睪丸>血漿。權利要求1.將下式(II)的化合物用于制備治療與免疫相關疾病的藥物中的用途，id="icf0001"file="A2007100345340002C1.gif"wi="51"he="34"top="36"left="68"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中R1、R2、R3均選自氫、烷基、烷?；?，但不同時為氫。2、根據(jù)權利要求1所述的用途，其特征在于Ri、R2、R3選自甲基、乙?；?。3、根據(jù)權利要求2所述的用途，其特征在于Ri、R2、R3同時為甲基或乙酰基。4、根據(jù)權利要求1至3之一所述的用途，其特征在于所說的與免疫相關疾病是指類風濕關節(jié)炎、脊柱關節(jié)病、強直性脊柱炎、未分化型脊柱關節(jié)病、銀屑病關節(jié)炎、反應性關節(jié)炎、腸病性關節(jié)炎或骨性關節(jié)炎。5、根據(jù)權利要求4所述的用途，其特征在于所說的與免疫相關疾病特別是指類風濕關節(jié)炎。6、根據(jù)權利要求1至3之一所述的用途，其特征在于所說的與免疫相關疾病是指惡性腫瘤、乳腺小葉增生、真菌病，包括皮膚、泌尿生殖道或全身真菌病。7、根據(jù)權利要求1至3之一所述的用途，其特征在于所說藥物的劑型為口服劑。8、根據(jù)權利要求1至3之一所述的用途，其特征在于所說藥物的劑型也可以為注射劑。9、根據(jù)權利要求1至3之一所述的用途，其特征在于所說藥物的劑型可以為外用制劑。全文摘要本發(fā)明涉及白藜蘆醇的衍生物作為藥物，尤其是作為治療與免疫相關的關節(jié)炎，特別是類風濕關節(jié)炎、脊柱關節(jié)病(尤其是強直性脊柱炎)、骨性關節(jié)炎，的藥物的用途。本發(fā)明的技術方案是將式(II)的化合物用于制備治療與免疫相關疾病的藥物中的用途，其中R₁、R₂、R₃均選自氫、烷基、烷酰基，但不同時為氫。本發(fā)明公開的白藜蘆醇的衍生物在制備治療與免疫相關疾病的藥物中的用途，不但與現(xiàn)有的其他藥物相比具有強的藥效作用，而且比該衍生物的先導物白藜蘆醇也有更強的作用。文檔編號A61K31/09GK101264069SQ20071003453公開日2008年9月17日申請日期2007年3月14日優(yōu)先權日2007年3月14日發(fā)明者向大雄,蔣新宇,高潔生申請人:中南大學