專利名稱：：一種血瘀證表征模型的制作方法及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于篩選活血化痂藥物、評價治療血痳證的動物模型的制備方法。
背景技術：
：血瘀證及其動物模型相關研究已有近50年的歷史，對于如何建立證候動物模型這一重大理論和技術問題，一直受到人們關注與探索。目前的證候整體動物模型主要是借用西醫(yī)學的生化模型、病理模型、病理生理模型，然而，血癡證模型動物體內(nèi)的這些生化、病理和生理學變化并不能反映中醫(yī)學證候的性質和程度，也不符合血瘀證的臨床診斷標準。雖然這些模型為中醫(yī)藥研究發(fā)揮了重要作用，但這些模型的評價依據(jù)不是基于中醫(yī)學的證候定義，而是僅僅引用了中醫(yī)學的某些理論進行模型推理，如釆取低溫冷凍動物四肢末端制成的所謂寒凝血瘀證模型，其動物四肢末端的紫暗實際上是局部凍傷，不能反映血瘀證的整體特征和程度；又如用游泳力竭方法制成的所謂氣虛血瘀證模型，其動物冷縮、耳唇蒼白等行為學變化可視作氣虛之像，但并無血瘀之征。由此建立的所謂證候模型仍未能從西醫(yī)學的動物模型中脫胎出來，不僅缺乏中醫(yī)血瘀證表征及其顯示度，而且模型自身的穩(wěn)定性、時間窗和適用領域都不清楚。還有人采用"以方測證"的方法，把凡能影響某些血液性能和生化指標的方藥，都歸屬為活血藥；同樣，凡能^皮活血化癡方藥改變的證候，都歸屬為血瘀證，以至于無藥不活血2無證不血癡o中醫(yī)學定義的證候是對四診信息表達的機體病理生理變化的整體反應狀態(tài)的概括，具有內(nèi)實外虛、動態(tài)時空、多維界面的特性。這個由王永炎院士最近提出的證候定義，為證候模型的建立提供了兩個基本條件即"四診信息表達，，和"整體反應狀態(tài)"。對于如何建立證候動物模型這一重大理論和技術問題，近40年來一直受到人們關注與探索。近來，王永炎院士提出了"證候表征模型"概念以及證候模型研究應該遵循的因一脈一證一治原則，引起了學術界廣泛關注"一33。盡管人們既往在中醫(yī)證候模型研究上做了大量探索性工作，然而，動物證候模型是否表達了人體證候的表現(xiàn)特征，卻往往被忽視。同時卻一味追尋生化、病理指標作為動物證候模型成立的依據(jù)。這些模型以局部的病理損傷、靜止的指標水平、無體表特征的微觀變化等作為模型建立的評價標準，而與人體證候的整體、表征等特點相去甚遠。以往雙側后肢低溫冷凍法[4]和寒冷環(huán)境冷凍法[5]所致寒凝血疳證模型屬于此類。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明以新的證候概念為理論依據(jù)，即證候是四診信息表達的機體病理生理變化的整體反應狀態(tài)"]，"四診信息表達，，的"整體反應狀態(tài)"也是證候模型評價的標準。對于血瘀證而言，舌象、唇象、爪象、耳輪、尾尖、眼球、毛皮以及動物行為等都可視作四診信息表現(xiàn)，但舌像是人類證候體征中最重要的指標，也是機體整體反應的外象。以此作為證候尤其血癡證模型的評價指標，不僅體現(xiàn)了中醫(yī)學"有諸內(nèi)必行諸于外"的整體觀念，而且也具備客觀、直接的"四診信息"特點。因此，我們提出了血瘀證表征模型概念及"因脈證治"建模思路[u。本發(fā)明利用動物的一些生物體表特征模擬人體證候，建立了一種生物表征模型。生物表征是"外"象，是通過望、聞、切收集到的疾病信息，包括癥狀、體征等。就血瘀證而言，舌象、爪象、耳輪、眼球以及動物行為等都可視作四診信息表征，而望診收集到的舌象是人類證候體征中最重要的指標，也是機體整體反應的外象。以此作為證候、尤其是血瘀證表征模型的評價依據(jù)，不僅體現(xiàn)了中醫(yī)學"有諸內(nèi)必行諸于外，，的整體觀念，而且也具備了客觀、直接的"四診信息"特點。本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有血瘀證模型制備技術存在的缺陷，提供一種血瘀證動物表征模型的制備方法，制備具有呈現(xiàn)舌質色澤紫暗或紫黑、舌下脈絡色澤紫暗、脈絡增粗變長的主要血瘀證診斷特征的表征的動物模型，該方法簡便、易行、易控、機理明確、性質穩(wěn)定且重現(xiàn)性好，成本低，指標即可定性也可定量，可以做病理形態(tài)學對比分析，計數(shù)資料和計量資料還可以進行統(tǒng)計學處理，可用于血痹證動物表征模型的復制、評價，以及血痳證及活血化癡藥物的研究。本發(fā)明的血瘀證動物表征模型的制備方法包括把大白鼠、或小白鼠、或其他哺乳動物置于冰水混合液(大約(TC)中，每次3-15分鐘，每天l-3次，持續(xù)10-50天。得到的動物模型表現(xiàn)為血瘀證表征特征舌背面舌質色澤紫暗或紫黑，舌下脈絡色澤紫暗，脈絡增粗變長。血瘀表征血瘀程度定性計分為2分或3分，圖像分析顯示，動物舌反向灰度值范圍為(159.3±17.81)。以圖像分析系統(tǒng)中黑色的灰度值為255，白色的灰度值為0為參照。優(yōu)選的效果較好的條件是把大白鼠、或小白鼠、或其他哺乳動物置于冰水混合液(大約(TC)中，每次5-8分鐘，每天1-2次，持續(xù)20-30天。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明制備的血瘀證動物表征模型具備血瘀證的重要特征舌質紫暗；2.本發(fā)明制備的血瘀證動物表征模型同時具有舌下脈絡變粗變長的特征；3.本發(fā)明制備的方法簡便、易行、易控、機理明確、穩(wěn)定且重現(xiàn)性好；4.本發(fā)明制備的血瘀證動物表征模型可以做病理形態(tài)學對比分析、計數(shù)資料和計量資料，可以進行統(tǒng)計學處理分析；5.成功率高，造價低廉。本發(fā)明作為一種新的模式生物，其制作方法(模型制備、舌像色澤采集方法、舌像灰度分析方法、血瘀程度分級等)可用于血瘀證動物表征模型的復制、評價，以及血瘀證及活血化瘀等藥物的研究等。圖1:正常對照組與模型組大鼠舌下脈脈絡圖(實施例1)。正常10天組和正常20天組兩組大鼠舌質鮮紅潤澤舌下脈絡清晰，較短；模型IO天組和模型20天組大鼠舌質紫暗舌下脈絡增粗增長。圖2:舌質分級圖(實施例2)(O分舌質色澤紅潤；l分舌質色澤紅潤略暗；2分舌質色澤紫暗；3分舌質色澤紫黑記)。圖3:舌下脈絡彩圖(實施例2)O分舌下脈絡色澤紅潤，顯色約l/3舌體長；l分舌下脈絡色澤紫暗，顯色大于1/3小于1/2舌體長；2分舌下脈絡色澤紫暗，顯色約l/2舌體長；3分舌下脈絡色澤紫黑，血管明顯增粗，顯色約2/3舌體長。圖4:大鼠舌像比較圖(實施例3)。具體實施例方式實施例1本實驗釆用反復冰水寒冷刺激致大鼠陽氣衰竭法來誘導大鼠形成寒凝血癡證動物模型。在檢測模型動物血液流變學指標的變化基礎上，重點觀察模型大鼠生物表征的變化，即采用數(shù)碼相機攝取舌下脈胳、耳、爪甲的外觀色澤的變化，有別于以往血瘀證模型研究，研究如下。材料與方法l.材料1.1動物SD大鼠，體重(280士20)g,由維通利華實驗動物研究所提供；動物于實驗前一周運到實驗室，在安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，溫度控制在6(23土1)。C的范圍內(nèi)，相對濕度60%，光線自動控制，明(7:00-19:00)暗(19:00-7:OO)交替，給予充足清潔飲水、攝食。1.2實驗器材10%水合氯醛，數(shù)碼相機照相翻拍架，富士數(shù)碼相機(FinePixS7000，600萬像素)，比色對照卡。1.3實驗環(huán)境動物于實驗前一周運到實驗室(清潔級)，在安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，溫度控制在23土rC的范圍內(nèi)，相對濕度60%，光線自動控制，明(07:00-19:00)暗(19:00-07:00)交替，給予充足清潔飲水、攝食。2方法2.1模型制作方法2.1.1環(huán)境條件參數(shù)溫度22+2。C濕度60%2.1.2冰水池參數(shù)游泳桶高35cm,直徑35cm冰水深25cm冰水自來水加碎水(雞蛋大小)，以水水混合物溫度在大約0°C，冰水上浮一層碎冰為限。2.1.3.冰水冷凍方法水水冷凍時間每次5分鐘冰水冷凍次數(shù)10次組和20次組冰水冷凍步驟每次取3-4只大鼠同時輕輕放入冰水池中，觀察大鼠游泳狀態(tài)，若大鼠出現(xiàn)連續(xù)2次下沉并有氣泡，第3次出現(xiàn)下沉時用鑷子輕輕夾住大鼠背部，使大鼠不至下沉，但只留大鼠眼鼻于液面以上，身體其余部分浸于冰水中，直致時間結束。時間結束后從水水中撈出大鼠，用紗布輕輕擦去鼠腹部殘留的冰水，然后置于鼠籠，給足水飼料。2.2血癡表征(舌像)采集方法舌像拍攝操作步驟1)固定于特定翻拍架上的數(shù)碼相機(FinePixS7000，600萬像素)調節(jié)至高度，使鏡頭離翻拍架平板距離13cm處；2)兩日光燈管的兩個底座分別放在翻拍架兩側的桌面上，燈管方向朝下，一個日光燈置于相機與固定架之間，另一個日光燈固定在距離其15cm距離的地方，連接電源；3)大鼠在最后一次游泳后禁食不禁水24h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.37ml/100g);4)將麻醉鼠仰臥位平放于翻拍臺，比色卡放在鼠的右側，使比色卡的9、11圖光照無反光；5)用無齒鑷與鼠舌體斜30。夾角夾住尖0.5cm位置，向鼠左側平行于桌面輕輕拉出舌，使舌體右側緣靠近下牙左側，拉出舌頭長度以舌尖抵達鼻近心端為度；6)照相機設置自動模式，微距、去閃光燈條件下進行照相(翻拍架圖略)。舌質分級的制備方法見實驗例22.3舌像灰度分析方法釆用ImageJl.36b(NIH，USA)圖像分析軟件對所有舌像進行灰度值分析。舌像分析操作步驟打開Image分析軟件；采用Image打開要分析的圖像；鼠標選取30x30大小區(qū)域；舌根部、舌中部，舌中兩邊各一個，共4個相同大小區(qū)域；依次采用Edit中Invert處理所選區(qū)域；造定后采用Analyze中運行measure,出現(xiàn)舌質灰度值結果，將結果轉入EXCEL文件形式；選取每只大舌中部3點數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。3結果3.1舌下脈絡(數(shù)碼相片)特征數(shù)碼相機拍攝實物(圖1),可以看出，正常10天組和正常20天組兩組大鼠舌質鮮紅潤澤舌下脈絡清晰，較短；模型IO天組和模型20天組大鼠舌質紫暗舌下脈絡增粗增長。從圖中可以看出，模型組舌質色澤較正常組暗，舌下脈絡較正常組深暗且長。3.2耳廓血管(數(shù)碼相片)特征數(shù)碼相機拍攝實物(圖略)，可以看出，正常IO天組和正常20天組兩組大鼠耳廓潤澤、微血管清晰鮮紅；模型IO天組和模型20天組大鼠大鼠耳廓潤澤、微血管清晰暗紅。從圖上分析，各組大鼠耳廓潤澤度、微血管清晰度肉眼差異不明顯。3.3血液流變學指標比較3.3.1血液粘度比較按照文獻|41方法對各組血液流變學統(tǒng)計結果顯示，模型IO天組和模型20天組大鼠血液流變學全血粘度和還原粘度不同切變率狀態(tài)下(150s—、38s_1，10s_1，5s_1)各項指標與正常10天組和正常20天組均有升高，模型IO天組于低切(5s-1)還原粘度(28.27-1.93)顯著高于正常10天組(25.36±2.77),p<0.05;模型20天組全血低切粘度(5s。為16.4±2.32顯著高于正常組(13.76±1.00)，模型20天組還原(38s1，10s—\5s。粘度分別為10.49±2.34，20.28±2.08和29.96±2.39，顯著高于正常組8.19±1.24，17.74±1.05和26.16±2.64,p分別小于0.05.在模型10天組與模型20天組的比較中，20天組各項指標較10天組有所升高，但差異無顯著性(表l)。表1各組在不同切變率狀態(tài)下血液粘度比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注*與正常對照組比較，P<0.05。3.3.2紅細胞壓積、聚集指數(shù)和變形指數(shù)比較按照文獻41方法對各組大鼠紅細胞壓積、聚集指數(shù)和變形指數(shù)進行比較，模型20天組聚集指數(shù)顯著高于正常20天組，P<0.05。在10天組與20天組的比較中，20天組各項指標較IO天組有所升高，但差異無顯著性，見表2。表2各組大鼠紅細胞壓積、聚集指數(shù)和變形指數(shù)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.4血小板最大聚集率、凝血酶時間和凝血酶原時間比較按照文獻|41方法對各組大鼠血小板最大聚集率、凝血酶時間和凝血酶原時間比較顯示，模型10天組(6.6±2.88)歐母(ohm)和模型20天組(8.9±3.38)ohm大鼠血小板最大聚集率均值較正常對照組(4.0±1.41)ohm和(5.4±1.90)ohm高，P<0.05;模型20天組大鼠凝血酶時間(22.3±3.53)和凝血酶原時間(24.6±3.11)S較正常對照組(29.2±2.01)S和(27.7±2.62)S縮明顯短，P<0.05.見表3。表3各組血小板聚集率、凝血酶時間和凝血酶原時間比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*與正常對照組比較，P<0.05。本實驗以"證候表征模型"理論為指導，采用水水反復冷凍為誘導因素，建立了寒凝血瘀證大鼠模型，同時對寒凝血痹證表征模型進行了評價。作者重點觀察和分析了模型大鼠證候表征舌像的變化，對舌質、舌下脈絡、耳廓血管的外觀、色澤的變化進行了分析。實驗發(fā)現(xiàn)，冰水冷凍20天組和水水冷凍IO天組大鼠舌質明顯紫暗，舌下脈絡明顯增粗增長，與正常組大鼠舌質鮮紅潤澤舌下脈絡清晰有明顯差異。同時正常組大鼠耳廓潤澤、微血管清晰鮮紅；而模型組大鼠大鼠耳廓潤澤、微血管清晰但顯暗紅。同時，血液流變學統(tǒng)計結果顯示，模型20天組大鼠血液流變學全血粘度和還原粘度不同切變率狀態(tài)下指標與正常20天組均有升高，模型20天組全血低切粘度顯著高于正常組，模型20天組還原粘度顯著高于正常組，P值均小于0.05.在模型IO天組與模型20天組的比較中，20天組各項指標較10天組有所升高，但差異無顯著性。模型20天組聚集指數(shù)和變形指數(shù)顯著高于正常20天組，P<0.05.在10天組與20天組的比較中，20天組各項指標較10天組有所升高，但差異無顯著性。各組大鼠血小板最大聚集率、凝血酶時間和凝血酶原時間比較顯示，模型20天組大鼠血小板最大聚集率值較正常對照組高，P<0.05;模型20天組大鼠凝血酶時間和凝血酶原時間較正常對照組明顯縮短，高，血液凝血酶時間明顯縮短，較正常對照組易于凝固。因此，依據(jù)"證候表征"理論，模型大鼠舌質紫暗，舌下脈絡增粗增長，耳廓微血管暗紅，符合中醫(yī)寒凝血癡證的癥狀特點，同時模型大鼠生化血液檢測(血流流變學，血小板，凝血酶)結果顯示模型大鼠血液呈粘凝狀態(tài)，滿足血痳證的診斷標準。綜上所述，采用反復冰水冷凍可誘導建立大鼠寒凝血癡證表征模型，符合中醫(yī)寒凝血痳證形成原理，實用價值高，可用于有關血癡證基礎及相關活血化瘀藥物研究。ii實施例2本實驗將以寒冷刺激誘導的寒凝血瘀證模型、腎上腺素皮下注射誘導血瘀證模型和10%大分子右旋糖苷靜脈注射誘導血瘀證模型為研究對象，觀測血瘀證的證候表征，收集的不同血痹證模型大鼠舌質色澤深淺圖和舌下脈絡顯色長短圖進行比較與分析，建立一種適用于血瘀證動物模型研究的舌像變化分級標準，現(xiàn)報道如下。材料和方法l材料1.1實驗動物SD大鼠，由維通利華實驗動物研究所提供；動物于實驗前一周運到實驗室，在安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，溫度控制在23土rc的范圍內(nèi)，相對濕度60%，光線自動控制，明(07:00-19:00)暗(19:00-07:00)交替，給予充足清潔飲水、攝食。1.2實驗試劑與儀器鹽酸腎上腺素(lmg/ml),大分子右旋糖苷，水合氯醛，富士數(shù)碼相機(FinePixS7000，600萬4象素)，聯(lián)想電腦一臺，小天鵪冰沖巨(BK/BC-33Q)，一次性3ml注射器，鑷子，低溫溫度計等。2.實驗方法2.1動物分組SD大鼠隨機分為5組，正常組、水水游泳組、腎上腺素組、右旋糖苷組和低溫冷凍組，每組各8只大鼠。2.2模型制備2.2.1水水游泳組冰水游泳組大鼠于冰水中游泳，每次5分鐘，每天冷凍一次，共20天，第21日處置。2.2.2腎上腺素組大鼠皮下注射2次0.1mg/ml腎上腺素(adrenaline)0.08ml/kg(100g),間隔4小時，在第一次注射后2小時，將大鼠浸入冰水5分鐘，然后禁食，次日處置。2.2.3右旋糖苷組大鼠尾靜脈注射10%大分子右旋糖苷，0.05ml/kg共3次，第一天第1次尾靜脈注射后間隔5小時后進行第2次注射，然后禁食，次日尾靜脈注射后1小時處置。2.2.4低溫冷凍組實驗大鼠置于罩有鐵網(wǎng)罩的小瓷盤上，放入低溫冰拒，在零下15度的冷環(huán)境中，持續(xù)受凍4h左右，之后取出置于與正常大鼠相同環(huán)境中飼養(yǎng)，次日處置。2.3舌像采集拍攝相機富士數(shù)碼相機(FinePixS7000，600萬像素)拍攝方法大鼠釆用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.035ml/kg),大鼠處于深麻醉狀態(tài)下取仰臥位，用鑷子輕輕夾住大鼠舌尖從左輕輕拉出，直至露出舌根部，使整個舌體與大鼠軀干成直線或有小于15度的夾角。拍攝部位舌腹面.3.舌像收集與處理(舌質分級與舌下脈絡分級)所有采集舌像導入電腦，電腦配置如下處理器intelR,pentiumR4CPU2.OGHz;操作系統(tǒng)MicrosoftwindowsXP2002;顯示卡intelR82845G/GL/GE/PE/GVGraphicscontroller，監(jiān)視器intelR82845G/GL/GE/PE/GVGraphicscontroller上的即插即用監(jiān)視器等。顯示器運行狀態(tài)屏幕分辨率1024x768像素，顏色質量最高(32位)，DPI設置大尺寸(120DPI)。采用ACDseev3.2和windows圖片和傳真查看器看圖軟件查看圖片。所有圖片收集后，對舌腹面色澤深淺和舌下脈絡顯色長短進行定性分級。結果l).舌質分級與舌像所有圖片收集后，通過分析比較對舌腹面色澤深淺進行定性分級。初步擬定舌腹面色澤深淺分級計分方法如下，舌腹面色澤深淺分級如下舌質色澤紅潤記O分；舌質色澤紅潤略暗記l分；舌質色澤紫暗記2分；舌質色澤紫黑記3分；參見舌質彩圖2。各組舌質分級記分如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注x2檢驗結果為與正常組比較所得結果。2).舌下脈絡顯色長短分級所有圖片收集后，通過分析比較對舌下脈絡顯色長短進行定性分級。初步擬定舌下脈絡顯色長短分級計分方法如下，舌腹面舌下脈絡色澤與長短分級如下舌下脈絡色澤紅潤，顯色約1/3舌體長記0分；舌下脈絡色澤紫暗，顯色大于1/3小于1/2舌體長記1分；舌下脈絡色澤紫暗，顯色約1/2舌體長記2分；舌下脈絡色澤紫黑，血管明顯增粗，顯色約2/3舌體長記3分。舌下脈絡彩圖3。各組脈絡顯色長短分級記分如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注x2檢驗結果為與正常組比較所得結果。討論本實驗收集了正常大鼠、低溫冷凍致寒凝血瘀證模型大鼠、腎上腺素皮下注射加冰水刺激誘導氣滯血痹證模型大鼠和10%大分子右旋糖苷尾靜脈注射誘導血瘀證模型大鼠的舌像，對收集所有舌像進行分析比較，重點分析比較了舌腹面色澤深淺和舌下脈絡顯色長短，根據(jù)定性分級計分標準。'、'"''因此，通過對正常及不同血瘀證模型大鼠舌像比較，我們擬定了血瘀證證候模型動物舌像變化分級標準，這一標準從舌質和舌下脈絡兩方面反映出血瘀證模型動物證候表征的可定量和客觀化，為今后血瘀證和活血化瘀藥物研究中舌像變化評價提供了可供參考的分級標準。實施例3材料和方法1.材料1.1動物SD大鼠同實施例l中所記述。1.2實驗藥物與儀器用于血液流變學指標測定的儀器血小板聚集指數(shù)檢測儀，血液粘度測定儀LG-R-80(京藥器監(jiān)(準)字00第221031)，紅細胞變形聚集儀LG-B-190(京藥管械(準)字2001笫2400003號)，富士數(shù)碼相機(FinePixS7000，600萬像素)，高速低溫離心機(Sigma),放免儀等。1.3動物分組SD大鼠60只，隨機分為正常組、冰水冷凍20天組(第1天)、水水冷凍20天組(第3天)、水水冷凍20天組(第5天)；1.4模型制備模型大鼠每天定點置于冰水中冷凍5分鐘，每天冷凍一次，共20天；正常大鼠則每天置于常溫水中5分鐘來代替。各組大鼠分別于冷凍后第1、3、5天，按相應要求觀察大鼠外觀表征、采集血液及組織標本。2.方法2.l圖像采集方法舌像拍攝操作步驟同實施例l中所記述。2.2舌像灰度分析方法同實施例1中所記述。2.3檢測指標2.3.1血痳表征各組大鼠在最后一次游泳后禁食不禁水24h，10%水合氯醛腹腔麻醉(0.37ml/100g)，采用富士數(shù)碼相機(FinePixs7000，600萬像素)在相同角度和光線下近距離拍攝舌腹面。2.3.2檢測指標各組大鼠在最后一次游泳后禁食不禁水24h,10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血，檢測如下指標(l)血液流變學取5ml血入預存100ul(2.5萬單位/ml)肝素鈉試管，在血液流變學檢測儀進行血液流變學13項指標檢測。(2)血清TXB2/6-k-PGFloc含量取2.Oml血入已加100ul消炎痛-EDTA液試管中，低溫離心取上清液，采用TXB2和6-k-PGF1a放免試劑盒在放免儀進行檢測。2.4統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)土標準差(x士s)表示，組間差異的顯著性用T檢驗，用SPSS11.5統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)包處理。3.結果3.1.血瘀表征-舌像變化特征正常組大鼠舌質鮮紅潤澤舌下脈絡清晰，較短；模型組大鼠舌腹面舌質明顯紫暗，舌下脈絡增粗增長，與正常組比較差異顯著(圖4)。大鼠反復冰水冷凍20天停止后第l天、第3天和第5天舌腹面舌質均呈現(xiàn)不同程度紫暗，舌下脈絡呈現(xiàn)不同程度顯長顯粗。舌質灰度值分析顯示，水水冷凍20天停止后第1天、第3天和第5天舌質灰度值均較正常組大鼠舌質灰度值有明顯增高(p<0.05或p<0.01)，冰水冷凍20天組大鼠灰度值以第3天最高(表1)。表1血瘀證模型大鼠造模后舌質灰度值比較分組舌質灰度值正常組132.3±12.17水水20次后第1天組147.7±13.06**水水20次后第3天組151.8±14.16**水水20次后第5天組145.4±15.52*注"s正常組P<0.05,**vs正常組P<0.01;3.2.血液流變學變化特征3.2.l血粘度比較各組血液流變學統(tǒng)計結果顯示，水水冷凍20天各組大鼠全血及還原粘度值在高切和低切變率狀態(tài)下較正常組升高，部分值升高有顯著意義，p<0.05(表2)。表2血瘀證模型大鼠造模后不同切變率血粘度比較全ii粘度全血粘度還原粘度還原粘度分組(150s一1)(5s-')(150s—')(5s力正常組3.83±0.34715.23士1.6026.13±0.64130.78±2,581冰水20次后第l天組4.13±0.32616.86±1.3577.57±0.540*38.44±3.531*冰水20次后第3天組3.81±0.27915.55±0.7566.53±0.66833.86±1.305冰水20次后第5天組3.71±0.34415.40±1.2285.61±0.69929.97±1.574注"s正常組P<0.05，"vs正常組P<0.01。3.2.2血球壓積、聚集指數(shù)和變形指數(shù)比較j&球在積.'冰水冷凍20天停止后第1天和第3天組大鼠血球壓積均較正常組有明顯下降(p〈0.05)，但第5天時血球壓積高于正常組。果桌措炎:水水冷凍20天停止后第1天和第3天組大鼠紅細胞聚集指數(shù)低于正常組，但差異不顯著。^多措炎.'冰水冷凍20天組大鼠紅細胞變形指數(shù)高于正常組，差異不顯著(表3)。表3血瘀證模型大鼠造模后壓積、聚積指數(shù)和變形指數(shù)比較分組壓積聚積指數(shù)變形指數(shù)正常組46.5±3.6941.04±0.1490.49±0.015水水20次后第1天組41.3±2.34**0.91±0.1910.50±0.013冰水20次后第3天組43.0±2.108**0.842±0.131*0.502±0.007冰水20次后第5天組48.2±1.79#△△1.33±0.097*A△0.476±0.038注承vs正常組P<0.05，**vs正常組P<0.01;△a與相同刺激次數(shù)第1天組比較P〈0.01;#與相同刺激次數(shù)第3天組比較P〈0.01。3.3血清TXB2/6-k-PGF1oc比值和血漿粘度比較j&,7Z^/^-i^-戶67^",6值冰水冷凍20天組大鼠血清TXB2/6-k-PGFla比值高于正常組，其中第1天、3天比值升高較明顯，具有顯著意義(P<0.05或P<0.01)。j^^祐產(chǎn)；冰水冷凍20天組大鼠血漿粘度值較正常組均有升高，而以造模后第3天值相對較高。見表4。表4血瘀證模型大鼠造模后血漿粘度和血清TXB2/6-k-PGFla比值<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本實驗采用冰水冷凍(大約(TC)刺激20次，每天1次，每次5分鐘的方法，制成寒凝血瘀證表征模型大鼠，分別在造模后第1、3、5天采集并分析模型動物血瘀表征舌像，檢測模型大鼠血液流變學和血清TXB2/6-K-PGFla含量。結果觀察到冰水冷凍20天停止后第1、3、5天大鼠舌腹面舌質均呈現(xiàn)不同程度明顯紫暗，舌下脈絡不同程度增粗增長，與正常組比較有差異。舌質灰度值分析結果顯示，20次停止后第1、3、5天舌質灰度值均較正常組大鼠舌質灰度值有明顯增高(p<0.05或p<0.01)。模型組大鼠高低切變率狀態(tài)下全血及還原粘度值也較正常組有升高，部分值升高顯著(p<0.05);模型組大鼠血清TXB2/6-k-PGF1a比值高于正常組(P<0.05)。大鼠血清TXB2/6-k-PGFlct比值在第1、3天升高較明顯，具有顯著意義(P<0.05或P<0.01)。本次研究顯示，冰水冷凍20次可誘導模型大鼠呈現(xiàn)舌質明顯紫暗血瘀表征，這種血癡表征可持續(xù)存在存少5天時間，而且舌質紫暗程度變化呈現(xiàn)由輕到重，再由重漸變輕的變化特征。同時反映血瘀的血液粘度值和TXB2/6-k-PGFlot比值也相應增高。本次實驗進一步說明寒冷刺激可導致機體體內(nèi)存在瘀血阻滯脈絡，臟腑或器官若出現(xiàn)血痂癡滯或脈絡癡阻則發(fā)生疾病或病理變化的機率會明顯增高。這也許能部分解釋血瘀證作為一種臨床重要而常見的心腦血管疾病中醫(yī)證候。而本次研究選擇冰水冷凍(寒冷)誘導形成寒凝血瘀證表征模型，并觀察血瘀表征舌質紫暗可持續(xù)存在存少5天時間，紫暗程度變化呈現(xiàn)由輕到重，再由重漸變輕的變化特征，這將為血瘀證的生物學基礎研究提供證候模型參考和證候表征舌像評價方法。主要文獻1.郭蕾，王永炎，張志斌；關于證候概念的詮釋，北京中醫(yī)藥大學學報，2003，26(2):5-8。2.田金洲，王永炎，時晶等；證候模型研究的思路，北京中醫(yī)藥大學學報，2005,28(6):18-21。3.田金洲，王永炎，時晶等；證候的概念及其屬性，北京中醫(yī)藥大學學報，2005，28(5):6-8。4.任映郭菁宋崇順田金洲時晶張曼楊金鐸葉鳳華.健腦寧腦中動脈梗塞造型大鼠血液流變學指標的影響及機理研究.[J]中國實驗方劑學雜志2003;9(5):39-40。權利要求1.一種血瘀證動物表征模型的制備方法，其特征在于把哺乳動物置于冰水混合液中，每次3-15分鐘，每天1-3次，持續(xù)10-50天。2.根據(jù)權利要求1所述的一種血瘀證動物表征模型的制備方法，其特征在于把哺乳動物置于水水混合液中，每次5-8分鐘，每天1-2次，持續(xù)20-30天。3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種血瘀證動物表征模型的制備方法，其特征在于所述哺乳動物是大白鼠、或小白鼠。4.根據(jù)權利要求1所述的一種血瘀證動物表征模型的制備方法，所建立的血痂證模型可用于血癡證機理及活血化痹藥物的研究。全文摘要本發(fā)明涉及一種血瘀證動物表征模型的制備方法，該方法采用大白鼠，或小白鼠，或共它哺乳動物，把哺乳動物反復置于冰水混合液中冷凍，每次持續(xù)3-15分鐘，每天1-3次，持續(xù)10-50天后，動物即表現(xiàn)出血瘀證表征特征例如舌背面舌質色澤紫暗或紫黑，舌下脈絡色澤紫暗，脈絡增粗變長。該方法簡便、易行、易控、機理明確、性質穩(wěn)定且重現(xiàn)性好，指標既可定性也可定量，可以做病理形態(tài)學對比分析，計數(shù)資料和計量資料還可以進行統(tǒng)計學處理。文檔編號A61K49/00GK101422388SQ200710185120公開日2009年5月6日申請日期2007年10月30日優(yōu)先權日2007年10月30日發(fā)明者尹軍祥,晶時,林李,王慶國,王永炎,田金洲,泉胡,魏海峰申請人:田金洲;王永炎;尹軍祥;時晶;李林;魏海峰;胡泉;王慶國