專利名稱：：一種以藥用真菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用生物技術(shù)實現(xiàn)對有毒中藥降毒存效的方法，特別是涉及一種以藥用真菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法。二、
背景技術(shù)：
(現(xiàn)有技術(shù))1、現(xiàn)有技術(shù)的主要相關(guān)內(nèi)容中藥馬錢子，又名苦實、番木鱉、馬前子，為馬錢科植物馬錢S"c/zmwm/x-vo脂'cflL.的干燥成熟種子。馬錢子性寒，味苦。歸肝、脾經(jīng)?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》中說它"開通經(jīng)絡(luò)，透達(dá)關(guān)節(jié)之功遠(yuǎn)勝于它藥"，具有散結(jié)消腫、通絡(luò)止痛之功效，主要用于治療面神經(jīng)麻痹、半身不遂、手足無力、小兒麻痹后遺癥、淋巴結(jié)結(jié)核、跌打損傷和骨折等癥。馬錢子有劇毒，有毒成分是士的寧(番木鱉堿，strychnine)和馬錢子堿(布魯生，brucine)，二者均對脊髓后角細(xì)胞有興奮作用，過量使用可引起肌肉強(qiáng)直性痙攣，抑制呼吸中樞，最終因窒息或呼吸中樞麻痹而死亡。馬錢子藥典規(guī)定的最大用量為炮制品0.3g，但用量太小達(dá)不到療效，因此醫(yī)生往往增加其用量來追求療效，從而出現(xiàn)毒性反應(yīng)。曾有內(nèi)服馬錢子7粒致死的報道。成人一次服5—10mg士的寧可致中毒，30mg可致死亡。由于馬錢子在臨床上用藥很不安全，因此如何讓它毒性得以降低而又療效得以保存(簡稱"降毒存效")，保障其安全用藥是亟待解決的問題。目前馬錢子主要用炮制法降低毒性，應(yīng)用較多的主要有兩種，即砂燙法和油炸法，其中砂燙法已被《中華人民共和國藥典》收載為法定方法[參見中華人民共和國藥典(一部)，2005:34]。用傳統(tǒng)方法對馬錢子炮制減小其毒性過程中，由于士的寧的熔融溫度為286—290。C，當(dāng)炮制溫度超過270。C時，士的寧的含量就相應(yīng)地減少，如生品士的寧的含量為1.18%;砂燙(250—300°C)含量降為0.89%;油炸(200—30(TC)含量降為0.58%。故炮制馬錢子時，必須掌握好溫度與時間，才能降低或消除其部分毒性而又保存藥效(參見孟憲紓，李煥秋.中藥制劑學(xué).北京人民衛(wèi)生出版社，1986:14)。通過微生物發(fā)酵中藥，使微生物中豐富的酶系與中藥中復(fù)雜的化學(xué)成分反應(yīng)，可能會產(chǎn)生一些中藥中不具有的成分或改變一些成分含量的變化，它是現(xiàn)代中藥研究的新內(nèi)容[參見曹秋娥，李祺德，王興紅.微生物發(fā)酵中藥應(yīng)成為中藥研究的新內(nèi)容.中草藥，2001，32(3):267—269]。在上世紀(jì)80年代有人以藥用真菌槐耳為發(fā)酵菌種，以農(nóng)副產(chǎn)品為營養(yǎng)基質(zhì)上進(jìn)行固體發(fā)酵，其發(fā)酵產(chǎn)品被稱為"槐耳菌質(zhì)"。根據(jù)真菌使藥材發(fā)酵會引起其組織成分變化，導(dǎo)致性味功能改變的原理，在營養(yǎng)基質(zhì)中摻用一定量的藥材黃芪作為發(fā)酵基質(zhì)，在一定條件下發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)品被稱為"槐芪菌質(zhì)"，其有關(guān)各項免疫指標(biāo)均明顯優(yōu)于槐耳菌質(zhì)[莊毅.抗癌新藥槐耳沖劑的研究.中國藥學(xué)雜志，1998，33(5):273—275]。藥用真菌新型(雙向性)固體發(fā)酵工程(簡稱"雙向發(fā)酵")的關(guān)鍵是將以往固體發(fā)酵中的發(fā)酵基質(zhì)由富含碳、氮等營養(yǎng)的甘蔗渣、麥麩等農(nóng)副產(chǎn)品(被稱為"營養(yǎng)基質(zhì)")改為黃茛等中藥材(被稱為"藥性基質(zhì)")，藥性基質(zhì)既能提供真菌生長所需營養(yǎng)物質(zhì)，其所含成分又會受真菌酶的作用而被發(fā)生改變，其產(chǎn)品被稱為"藥性菌質(zhì)"。藥性菌質(zhì)具有可能比該藥用真菌或藥性基質(zhì)本身或兩者簡單相加更好的藥效、更低的毒性[參見莊毅.藥用真菌新型固體發(fā)酵工程與槐芪菌質(zhì)的研制.中國藥學(xué)雜志，2004，39(3):175—178]。不同藥用真菌分別去發(fā)酵同一種藥材，所產(chǎn)生的藥性菌質(zhì)成分的性、效不同，而用同一種藥用真菌分別發(fā)酵不同中藥材所產(chǎn)生的藥理效應(yīng)也會不同。因此，不同藥用真菌與不同中藥材可交叉組合形成大量發(fā)酵組合，可得到大量不同性質(zhì)、效用的藥性菌質(zhì)[參見莊毅.藥用真菌新型(雙向型)固體發(fā)酵工程.中國食用菌，2002，21(4):3_6]。目前已有一項公開了采用雙向發(fā)酵以實現(xiàn)對雷公藤降毒存效、從而提高雷公藤的應(yīng)用范圍和開發(fā)前景的專利(公開號CN1911262A，2005.8.8)。我們曾報道了雙向發(fā)酵前后馬錢子生物堿含量及其HPLC指紋譜的變化[參見潘揚(yáng)，張弦，蔣亞平，等.雙向發(fā)酵前后馬錢子生物堿含量及其HPLC指紋譜的比較.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006，22(6):362—364],但迄今為止，尚未見針對馬錢子以藥用真菌進(jìn)行固體發(fā)酵實現(xiàn)對其降毒存效，并用于制備止痛、抗炎藥物用途的報導(dǎo)。2、現(xiàn)有技術(shù)存在的問題和缺點現(xiàn)代研究已知馬錢子的中毒與其中士的寧含量有關(guān)，而士的寧受熱易分解而被破壞，且與受熱的時間、溫度成正比，即受熱時間越長，溫度越高，士的寧含量越少，但在實際的炮制如砂燙和油炸過程中馬錢子受熱溫度往往得不到有效的控制。有的固體發(fā)酵法用于有毒中藥降毒存效的方法，往往在發(fā)酵基質(zhì)中加入營養(yǎng)豐富而成分復(fù)雜的農(nóng)副產(chǎn)品，從而使產(chǎn)生的藥性菌質(zhì)的,化學(xué)成分變得更加復(fù)雜，對進(jìn)一步尋找其中毒性成分的轉(zhuǎn)化規(guī)律、篩選新的活性藥物造成極大困難。三、
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種以藥用真菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法。本發(fā)明的原理是馬錢子除了含有既是有毒成分又是有效成分的士的寧等生物堿外，尚含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)成分。在適宜的條件下，接種于馬錢子上的藥用真菌利用其蛋白質(zhì)、脂肪等真菌所必需的營養(yǎng)物質(zhì)生長，菌絲在生長的過程中分泌出大量的酵素(胞外氧化酶)，在空氣中氧的參與下形成H202，觸發(fā)啟動一系列自由基鏈反應(yīng)，使馬錢子的毒性生物堿士的寧發(fā)生自發(fā)反應(yīng)而降解，包括對N原子的氧化(產(chǎn)生士的寧氮氧化物)，或醚鍵的斷裂(產(chǎn)生異型生物堿——異士的寧)，或產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)更合理且活性更好、毒性更低的化合物，所產(chǎn)生的馬錢子藥性菌質(zhì)毒性降低，且保存了馬錢子原有的止痛、抗炎作用。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種以藥用真菌實現(xiàn)對馬錢子條毒存效的固體發(fā)酵方法，其特征在于方法步驟如下(1)選擇藥用真菌菌種，并對藥用真菌菌種進(jìn)行活化，進(jìn)一步擴(kuò)增培養(yǎng)，得到該菌種的菌球液；(2)對藥性基質(zhì)馬錢子進(jìn)行烘干、粉碎、加水浸潤和蒸汽高壓滅菌，取出冷卻；(3)將上述菌種的菌球液接種到藥性基質(zhì)馬錢子上，進(jìn)行固體發(fā)酵；(4)收集馬錢子固體發(fā)酵產(chǎn)物，低溫干燥，得該菌種的馬錢子藥性菌質(zhì)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來進(jìn)一步實現(xiàn)。以上所述的一種以藥用真菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其特點是，步驟(1)中所述的六種藥用真菌是裂褶菌[Sc//矽/^/Mscomm從Fr.]、竹黃菌/aP.Henn]、單色云芝菌[Cor/o/iiswm'co/or(L.:Fr.)Pat.]、雞油菌[Qm^za^e〃M51C沽fln'twFr.]、白僵菌[5emnwZa6awzVma(Bals.)Vuill]或蟬花菌[Cw辦ce/wgw"m'f(Berk.)Berk.]中的一種。以上所述的一種以藥用真菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其特點是，在步驟(1)中所述的對真菌菌種的活化是采用的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，擴(kuò)增培養(yǎng)采用的是液體培養(yǎng)液搖瓶培養(yǎng)。以上所述的一種以藥用真菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其特點是，在步驟(2)中所述的藥性基質(zhì)是指馬錢子，即馬錢科馬錢屬植物馬錢子S/yc/i"osm/x-vom/caL.的種子，對馬錢子烘干，溫度為60—80。C，時間為6—8h;粉碎成粗粉，過5—IO目篩；按馬錢子粗粉的干重加180%—220%的水，浸潤0.5—lh;蒸汽高壓滅菌，蒸汽壓力為15磅(121°C)，滅菌60—90min，冷卻后貯存?zhèn)溆?。以上所述的一種以藥用真菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其特點是，在步驟(3)中所述的固體發(fā)酵的發(fā)酵瓶體積為500—1000ml;每瓶裝馬錢子粗粉160-360g，接種菌種的菌球液6-10ml，發(fā)酵溫度為24—28'C;在培養(yǎng)箱內(nèi)覆蓋吸滿水的厚紗布，每天向紗布上噴水，使空氣相對濕度保持在70%—90%;接種后在無菌條件下用接種針在藥性基質(zhì)上扎孔，以加大發(fā)酵瓶內(nèi)的通氣量；發(fā)酵天數(shù)為30—45天。以上所述的一種以藥用真菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其特點是，在步驟(4)中所述的藥性菌質(zhì)是指藥用真菌(發(fā)酵菌種)在馬錢子藥性基質(zhì)上生長發(fā)酵后而而獲得的產(chǎn)物，在60—80'C干燥，干燥時間為8—16h，置于陰涼干燥處，密封貯藏。這種發(fā)酵產(chǎn)物包含真菌生長形成的菌絲體以及被發(fā)酵后的藥性基質(zhì)殘留物，由于二者緊密結(jié)合、無法分開，因此統(tǒng)稱為藥性菌質(zhì)。馬錢子被裂褶菌、竹黃菌、單色云芝菌、雞油菌、白僵菌和蟬花菌發(fā)酵后的藥性菌質(zhì)，由六種發(fā)酵菌種和馬錢子藥材各取一字組成，而分別被定名為裂錢菌質(zhì)、竹錢菌質(zhì)、單錢菌質(zhì)、雞錢菌質(zhì)、白錢菌質(zhì)和蟬錢菌質(zhì)，并置于陰涼干燥處，密封儲藏。以上所述的對真菌菌種的活化是采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，其培養(yǎng)方法是①馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g，葡萄糖10—20g，瓊脂18—20g，水1000ml;②配制方法稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸0.5h，紗布過濾，再加10—20g葡萄糖和18—20g瓊脂，充分溶解后趁熱用2-4層紗布過濾，分裝于試管內(nèi)，每支試管裝量為10—20ml;◎高壓滅菌將上述試管置于15磅蒸汽(12rC)下滅菌20—30min，冷卻至不燙手的溫度下取出試管擺斜面，冷卻至室溫后貯存?zhèn)溆?；菌種取上述提及的六種藥用真菌中的一種菌種；⑤接種取上述試管，在24—28'C無菌條件下進(jìn)行接種操作，從上述六種菌種之一的原菌種斜面上，切取綠豆粒大小的一塊菌絲體連同培養(yǎng)基，移入PDA斜面培養(yǎng)基的中下部進(jìn)行培養(yǎng)；⑥活化培養(yǎng)與管理接種后置24—28。C培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，箱內(nèi)相對濕度保持70%—卯％，但早晚要進(jìn)行適當(dāng)通風(fēng)，保持空氣新鮮，接種后一周可見新生菌絲體，待培養(yǎng)到菌絲長滿PDA斜面，置冰箱內(nèi)(4°C)保存?zhèn)溆谩Ｒ陨纤龅囊环N以藥用真菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其特點是，以上所述的擴(kuò)增培養(yǎng)采用的是液體培養(yǎng)液搖瓶培養(yǎng)，其培養(yǎng)液由葡萄糖120g，KH2P049g，酵母粉30g，MgS044.5g，CaC0315g，維生素B!0.6g和水6000ml配制而成，以上各成分充分溶解后分別裝入500ml三角瓶中，每瓶裝250ml培養(yǎng)液，15磅蒸汽(121°C)滅菌20—30min，取上述活化后的菌絲體接種到培養(yǎng)液中，搖床的搖速為120—160轉(zhuǎn)/分，在24—28'C下?lián)u培一周，產(chǎn)生菌球，得菌種的菌球液。本發(fā)明的有益效果如下①本發(fā)明的方法工藝簡便合理，可實現(xiàn)對馬錢子的降毒存效，并可用于治療。②經(jīng)實驗證明，本發(fā)明的裂錢菌質(zhì)、竹錢菌質(zhì)、單錢菌質(zhì)、雞錢菌質(zhì)、白錢菌質(zhì)和蟬錢菌質(zhì)均有較好的止痛作用，可明顯減少小鼠由于腹腔注射醋酸引起的扭體次數(shù)。③經(jīng)實驗證明，本發(fā)明的裂錢菌質(zhì)、竹錢菌質(zhì)、單錢菌質(zhì)、雞錢菌質(zhì)、白錢菌質(zhì)和蟬錢菌質(zhì)對巴豆油致小鼠耳殼腫脹均有很好的抑制作用，表現(xiàn)為降低小鼠耳殼腫脹度和提高抑制腫脹率。經(jīng)實驗證明，本發(fā)明的裂錢菌質(zhì)、竹錢菌質(zhì)、單錢菌質(zhì)、雞錢菌質(zhì)、白錢菌質(zhì)和蟬錢菌質(zhì)與馬錢子相比，毒性均有明顯下降。本發(fā)明也可以應(yīng)用于其他有毒中藥材進(jìn)行降毒存效，如馬錢屬(5^yc/mos)其他植物云南馬錢S/ryc/jwwA.W.Hill、海南馬錢STtjc/zwos/kh'"""my/51Merr."Chun、密花馬錢S/^c^mwovatoA.W.Hill的種子，以及川烏(毛茛科植物烏頭Jco"/ft//wcww/cAae/!'Debx.的母根)、草烏(毛茛科植物北烏頭^co"towReichb.的塊根)、雪上一枝蒿(毛茛科植物短柄烏頭^com'加m6rac/^/w^/附Diels.的塊根)、Pf寸子(毛莫禾斗禾直物烏頭爿cow/加wcar附/c/iac//Debx.的子根)、白附子(天南星科植物獨角蓮7V/^o"/騰g/ga她腦EngL的塊莖)、巴豆(大戟科植物巴豆Cra/ow"g/z'w/nL.的果實)、甘遂(大戟科植物甘遂^;/zwWaT.N.LiouexT.P.Wang的塊根)、狼毒(大戟科植物大狼毒Ei(pAwWflwe附加ocy/7/w！Hand.Mazz.的根)、千金子(大戟科植物續(xù)隨子/a^yn》L.的成熟種子)、半夏[天南星科植物半夏乃'朋//^^"朋&(Thunb.)Breit.的塊莖]、天南星[天南星科植物天南星v4Wsae脂en^escews(Wall.)Schott.、異葉天南星v4r/sae附aBl.或東；(匕天南星爿n^ae附aawwrem^Maxim.的塊莖]、天仙子(茄科植物莨菪/fyo^^wn^"/gwL.的種子)、洋金花(茄科植物白曼陀羅w故/L.或毛曼陀羅Itowa/""o:c/aMill.的花)、鬧羊花(杜鶻花科植物羊躑躅i/k^o&m/rawmo//eG.Don的花)、紅娘蟲(蟬科昆蟲黑翅紅娘子//wec/i"rawgw/"eaDeGeer或褐翅紅娘子//wec/z"/W/flfemfltoFabricius的蟲體)、青娘蟲(芫青科昆蟲綠芫青Z^tocwflgcmaePallas的蟲體)、斑蝥(蕪青科昆蟲南方大斑蝥Afy/a6〃'sp/^/eratoPallas或黃黑小斑蝥鄉(xiāng)/a6n'sc/c/zoWL.的蟲體)、蟾酥(蟾蜍科動物中華大蟾蜍5w/ogargw/zamCantor或黑眶蟾蜍we/amwric/wsSchneider的干燥分泌物)等。四具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但是，本發(fā)明不局限于所給出的這些實施例。實施例1。一種以裂褶菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其步驟如下(1)發(fā)酵基質(zhì)(馬錢子)的處理取馬錢子，70。C烘干8h，粉碎成粗粒(過5目篩)，按每瓶160g裝入500ml發(fā)酵瓶內(nèi)，加入320g水潤45min，蓋瓶塞，15磅(121°C)滅菌90min;(2)發(fā)酵菌種準(zhǔn)備取裂褶菌接種于PDA培養(yǎng)基上，28'C進(jìn)行活化培養(yǎng)，過夜。制作菌種培養(yǎng)液，成分為葡萄糖120g，KH2P049g，酵母粉30g,MgS044.5g，CaC0315g，維生素B!0.6g,水6000ml。成分充分溶解后分別裝入500ml三角瓶中，每瓶裝250ml培養(yǎng)液，15磅(12rC)滅菌25min。取活化后的菌絲體菌塊無菌操作條件下接種至培養(yǎng)液，設(shè)定搖床調(diào)節(jié)至140轉(zhuǎn)/分，27il'C搖培約一周，使之產(chǎn)生大量菌球，得裂褶菌菌球液；(3)固體發(fā)酵無菌操作，每個發(fā)酵瓶內(nèi)接種裂褶菌菌球液8ml，27il'C發(fā)酵室內(nèi)進(jìn)行固體發(fā)酵；(4)菌質(zhì)后處理40天后，取出瓶內(nèi)發(fā)酵后形成的濕裂錢菌質(zhì)，稱重，在6(TC下電熱烘干，保存?zhèn)溆茫?5)菌質(zhì)粉碎將所獲得的裂錢菌質(zhì)先粉碎成粗粒(過IO目篩)，然后加相同重量的藥用淀粉，混勻，粉碎，過80目篩，制備成細(xì)粉進(jìn)行藥效、毒性試驗(詳見本發(fā)明有益效果部分)。實施例2。一種以竹黃菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其步驟如下(1)發(fā)酵基質(zhì)(馬錢子)的處理取馬錢子，7(TC烘干8h，粉碎成粗粒(過5目篩)，按每瓶160g裝入500ml發(fā)酵瓶內(nèi)，加入320g水潤45min，蓋瓶塞，15磅(121'C)滅菌90min;(2)發(fā)酵菌種準(zhǔn)備取竹黃菌接種于PDA培養(yǎng)基上，28'C進(jìn)行活化培養(yǎng)，過夜。制作菌種培養(yǎng)液，成分為葡萄糖120g，KH2P049g，酵母粉30g，MgS044.5g，CaC0315g,維生素B,0.6g，水6000ml。成分充分溶解后分別裝入500ml三角瓶中，每瓶裝250ml培養(yǎng)液，15磅(121°C)滅菌25min。取活化后的菌絲體菌塊無菌操作條件下接種至培養(yǎng)液，設(shè)定搖床調(diào)節(jié)至140轉(zhuǎn)/分，27il'C搖培約一周，使之產(chǎn)生大量菌球，得竹黃菌菌球液；(3)固體發(fā)酵無菌操作，每個發(fā)酵瓶內(nèi)接種竹黃菌菌球液8ml，27士1'C發(fā)酵室內(nèi)進(jìn)行固體發(fā)酵；(4)菌質(zhì)后處理40天后，取出瓶內(nèi)發(fā)酵后形成的濕竹錢菌質(zhì)，稱重，在6(TC下電熱烘干，保存?zhèn)溆茫?5)菌質(zhì)粉碎將所獲得的竹錢菌質(zhì)先粉碎成粗粒(過IO目篩)，然后加相同重量的藥用淀粉，混勻，粉碎，過80目篩，制備成細(xì)粉進(jìn)行藥效、毒性試驗(詳見本發(fā)明有益效果部分)。實施例3。一種以單色云芝菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其步驟如下(1)發(fā)酵基質(zhì)(馬錢子)的處理取馬錢子，70'C烘干8h，粉碎成粗粒(過5目篩)，按每瓶160g裝入500ml發(fā)酵瓶內(nèi)，加入320g水潤45min，蓋瓶塞，15磅C121。C)滅菌90min;(2)發(fā)酵菌種準(zhǔn)備取單色云芝菌接種于PDA培養(yǎng)基上，28'C進(jìn)行活化培養(yǎng)，過夜。制作菌種培養(yǎng)液，成分為葡萄糖120g，KH2P049g，酵母粉30g，MgS044.5g，CaC0315g，維生素B,0.6g，水6000ml。成分充分溶解后分別裝入500ml三角瓶中，每瓶裝250ml培養(yǎng)液，15磅(121°C)滅菌25min。取活化后的菌絲體菌塊無菌操作條件下接種至培養(yǎng)液，設(shè)定搖床調(diào)節(jié)至140轉(zhuǎn)/分，27士rC搖培約一周，使之產(chǎn)生大量菌球，得單色云芝菌菌球液；(3)固體發(fā)酵無菌操作，每個發(fā)酵瓶內(nèi)接種單色云芝菌菌球液8ml，27±1'C發(fā)酵室內(nèi)進(jìn)行固體發(fā)酵；(4)菌質(zhì)后處理40天后，取出瓶內(nèi)發(fā)酵后形成的濕單錢菌質(zhì)，稱重，在60'C下電熱烘干，保存?zhèn)溆茫?5)菌質(zhì)粉碎將所獲得的單錢菌質(zhì)先粉碎成粗粒(過IO目篩)，然后加相同重量的藥用淀粉，混勻，粉碎，過80目篩，制備成細(xì)粉進(jìn)行藥效、毒性試驗(詳見本發(fā)明有益效果部分)。實施例4。一種以雞油菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其步驟如下(1)發(fā)酵基質(zhì)(馬錢子)的處理取馬錢子，7(TC烘干8h，粉碎成粗粒(過5目篩)，按每瓶160g裝入500ml發(fā)酵瓶內(nèi)，加入320g水潤45min，蓋瓶塞，15磅(121°C)滅菌90min;(2)發(fā)酵菌種準(zhǔn)備取雞油菌接種于PDA培養(yǎng)基上，28'C進(jìn)行活化培養(yǎng)，過夜。制作菌種培養(yǎng)液，成分為葡萄糖120g，KH2P049g，酵母粉30g,MgS044.5g，CaC0315g,維生素B,0.6g，水6000ml。成分充分溶解后分別裝入500ml三角瓶中，每瓶裝250ml培養(yǎng)液，15磅(121°C)滅菌25min。取活化后的菌絲體菌塊無菌操作條件下接種至培養(yǎng)液，設(shè)定搖床調(diào)節(jié)至140轉(zhuǎn)/分，27士rc搖培約一周，使之產(chǎn)生大量菌球，得雞油菌菌球液；(3)固體發(fā)酵無菌操作，每個發(fā)酵瓶內(nèi)接種雞油菌菌球液8ml，27士rC發(fā)酵室內(nèi)進(jìn)行固體發(fā)酵；(4)菌質(zhì)后處理40天后，取出瓶內(nèi)發(fā)酵后形成的濕雞錢菌質(zhì)，稱重，在60'C下電熱烘干，保存?zhèn)溆茫?5)菌質(zhì)粉碎將所獲得的雞錢菌質(zhì)先粉碎成粗粒(過IO目篩)，然后加相同重量的藥用淀粉，混勻，粉碎，過80目篩，制備成細(xì)粉進(jìn)行藥效、毒性試驗(詳見本發(fā)明有益效果部分)。實施例5。一種以白僵菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其步驟如下(1)發(fā)酵基質(zhì)(馬錢子)的處理取馬錢子，70'C烘干8h，粉碎成粗粒(過5目篩)，按每瓶160g裝入500ml發(fā)酵瓶內(nèi)，加入320g水潤45min，蓋瓶塞，15磅(121°C)滅菌90min;(2)發(fā)酵菌種準(zhǔn)備取白僵菌接種于PDA培養(yǎng)基上，28'C進(jìn)行活化培養(yǎng)，過夜。制作菌種培養(yǎng)液，成分為葡萄糖120g，KH2P049g，酵母粉30g，MgS044.5g，CaC0315g,維生素B,0.6g，水6000rii1。成分充分溶解后分別裝入500ml三角瓶中，每瓶裝250ml培養(yǎng)液，15磅(121'C)滅菌25min。取活化后的菌絲體菌塊無菌操作條件下接種至培養(yǎng)液，設(shè)定搖床調(diào)節(jié)至140轉(zhuǎn)/分，27士rc搖培約一周，使之產(chǎn)生大量菌球，得白僵菌菌球液；(3)固體發(fā)酵無菌操作，每個發(fā)酵瓶內(nèi)接種白僵菌菌球液8ml，27士rC發(fā)酵室內(nèi)進(jìn)行固體發(fā)酵；(4)菌質(zhì)后處理40天后，取出瓶內(nèi)發(fā)酵后形成的濕白錢菌質(zhì)，稱重，在6(TC下電熱烘干，保存?zhèn)溆茫?5)菌質(zhì)粉碎將所獲得的白錢菌質(zhì)先粉碎成粗粒(過IO目篩)，然后加相同重量的藥用淀粉，混勻，粉碎，過80目篩，制備成細(xì)粉進(jìn)行藥效、毒性試驗(詳見本發(fā)明有益效果部分)。實施例6。一種以蟬花菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其步驟如下(1)發(fā)酵基質(zhì)(馬錢子)的處理取馬錢子，7(TC烘干8h，粉碎成粗粒(過5目篩)，按每瓶160g裝入500ml發(fā)酵瓶內(nèi)，加入320g水潤45min，蓋瓶塞，15磅(121°C)滅菌90min;(2)發(fā)酵菌種準(zhǔn)備取蟬花菌接種于PDA培養(yǎng)基上，28'C進(jìn)行活化培養(yǎng)，過夜。制作菌種培養(yǎng)液，成分為葡萄糖120g，KH2P049g，酵母粉30g，MgS044.5g，CaC0315g,維生素B,0.6g，水6000ml。成分充分溶解后分別裝入500ml三角瓶中，每瓶裝250ml培養(yǎng)液，15磅(121°C)滅菌25min。取活化后的菌絲體菌塊無菌操作條件下接種至培養(yǎng)液，設(shè)定搖床調(diào)節(jié)至140轉(zhuǎn)/分，27士rc搖培約一周，使之產(chǎn)生大量菌球，得蟬花菌菌球液；(3)固體發(fā)酵無菌操作，每個發(fā)酵瓶內(nèi)接種蟬花菌菌球液8ml，27士rC發(fā)酵室內(nèi)進(jìn)行固體發(fā)酵；(4)菌質(zhì)后處理40天后，取出瓶內(nèi)發(fā)酵后形成的濕蟬錢菌質(zhì)，稱重，在6(TC下電熱烘干，保存?zhèn)溆茫?5)菌質(zhì)粉碎將所獲得的蟬錢菌質(zhì)先粉碎成粗粒(過IO目篩)，然后加相同重量的藥用淀粉，混勻，粉碎，過80目篩，制備成細(xì)粉進(jìn)行藥效、毒性試驗(詳見本發(fā)明有益效果部分)。實施例7。本發(fā)明的產(chǎn)物裂錢菌質(zhì)、竹錢菌質(zhì)、單錢菌質(zhì)、雞錢菌質(zhì)、白錢菌質(zhì)和蟬錢菌質(zhì)對實驗?zāi)Ｐ偷闹雇醋饔脤嶒灐?、實驗?zāi)康挠^察本發(fā)明的產(chǎn)物對醋酸腹腔刺激致小鼠扭體的影響。2、實驗方法90只，體重20—24g。按體重隨機(jī)分為9組分別為(1)模型對照組(0.5。/。CMC-Na水溶液20ml/kg);(2)雙氯芬酸鈉組(20mg/kg);(3)馬錢子組(40mg生藥/kg，余下六組均按此劑量給藥)；(4)裂錢菌質(zhì)組；(5)竹錢菌質(zhì)組；(6)單錢菌質(zhì)組；(7)雞錢菌質(zhì)組；(8)白錢菌質(zhì)組；(9)蟬錢菌質(zhì)組。各組給藥體積按20ml/kg每日灌胃1次。在給藥后0.5h，各組小鼠腹腔注射0.5%醋酸0.2ml/只，并開始觀察和記錄小鼠15min內(nèi)總扭體次數(shù)，并計算扭體抑制率[模型組平均扭體次數(shù)一給藥組平均扭體次數(shù)/模型組平均扭體次數(shù))xl00%]。結(jié)果用Excel2003進(jìn)行t檢驗。3、實驗結(jié)果與模型對照組相比，陽性對照雙氯芬酸鈉止痛作用最強(qiáng)(P<0.01);馬錢子、裂錢菌質(zhì)、竹錢菌質(zhì)、單錢菌質(zhì)、雞錢菌質(zhì)、白錢菌質(zhì)和蟬錢菌質(zhì)均有較好的止痛作用，可明顯減少小鼠由于腹腔注射醋酸引起的扭體次數(shù)(P<0.05);但與馬錢子相比，這六種菌質(zhì)對腹腔注射醋酸引起的疼痛反應(yīng)的抑制作用均未見顯著性差異，表明馬錢子經(jīng)發(fā)酵后止痛作用并未增強(qiáng)(詳見表1)。表l六種藥性菌質(zhì)對醋酸腹腔刺激致小鼠扭體的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注與模型對照組相比，*尸<0.05，**尸<0.01。實施例8。本發(fā)明的產(chǎn)物裂錢菌質(zhì)、竹錢菌質(zhì)、單錢菌質(zhì)、雞錢菌質(zhì)、白錢菌質(zhì)和蟬錢菌質(zhì)對實驗?zāi)Ｐ偷目寡鬃饔脤嶒灐?、實驗?zāi)康挠^察本發(fā)明的產(chǎn)物對巴豆油所致小鼠耳腫脹的影響。2、實驗方法取雄性小鼠90只，體重20—24g。按體重隨機(jī)分為9組分別為(1)模型對照組(0.5%CMC-Na水溶液20ml/kg);(2)雙氯芬酸鈉組(20mg/kg);(3)馬錢子組(40mg生藥/kg，余下六組均按此劑量給藥)；(4)裂錢菌質(zhì)組；(5)竹錢菌質(zhì)組；(6)單錢菌質(zhì)組；(7)雞錢菌質(zhì)組；(8)白錢菌質(zhì)組；(9)蟬錢菌質(zhì)組。各組給藥體積按20ml/kg每日灌胃1次，連續(xù)給4日。觀測指標(biāo)末次給藥后0.5h，用2%巴豆油0.05ml涂于小鼠右耳兩側(cè)，在致炎4h后處死小鼠，剪下左、右兩耳，用打孔器(直徑9mm)分別在同一部位取下圓耳片，電子天平稱重，計算耳殼重量，并比較各組小鼠耳殼腫脹度(小鼠右耳殼重一小鼠左耳殼重)，并計算腫脹抑制率[(模型組平均腫脹度一給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度x1000/。]。結(jié)果用Excel2003進(jìn)行組間t檢驗。3、實驗結(jié)果巴豆油可引起模型對照組小鼠被涂右耳明顯腫脹，使兩側(cè)耳殼重量差增大。與陽性對照雙氯芬酸鈉一樣，馬錢子、裂錢菌質(zhì)、竹錢菌質(zhì)、單錢菌質(zhì)、雞錢菌質(zhì)、白錢菌質(zhì)和蟬錢菌質(zhì)對巴豆油致小鼠耳殼腫脹均有很好的抑制作用，表現(xiàn)為降低小鼠耳殼腫脹度(P<0.05)和提高抑制腫脹率；但與馬錢子相比，這六種藥性菌質(zhì)對巴豆油可引起小鼠被涂右耳腫脹反應(yīng)的抑制作用均未見顯著性差異，表明馬錢子經(jīng)發(fā)酵后抗炎作用并未增強(qiáng)(詳見表2)。表2六種藥性菌質(zhì)對巴豆油所致小鼠耳腫脹的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注與模型對照組相比，*尸<0.05,*"<0.01。實施例9。本發(fā)明的產(chǎn)物裂錢菌質(zhì)、竹錢菌質(zhì)、單錢菌質(zhì)、雞錢菌質(zhì)、白錢菌質(zhì)和蟬錢菌質(zhì)與馬錢子、制馬錢子的毒性比較實驗。1、實驗?zāi)康膶Ρ景l(fā)明的產(chǎn)物的急性毒性與馬錢子、制馬錢子進(jìn)行平行比較。2、實驗方法(1)預(yù)試驗小鼠隨機(jī)分組，每實驗組每組10只，雌雄各半，以受試物220mg/kg為給藥劑量，每鼠灌胃0.5ml/20g的相同體積，觀察記錄死亡數(shù)。粗略獲得動物100%(Dm)和0%(Dn)死亡的致死劑量，計算實驗組數(shù)(N)及劑間比(1:K)各組劑量，配制等比溶液，進(jìn)行以下正式試驗。(2)正式試驗每種受試品各取體重18—22g小鼠50只，隨機(jī)分為五組，每組10只，雌雄各半，以每種受試品預(yù)試驗結(jié)果選擇適當(dāng)?shù)膭╅g比①馬錢子劑間比為1:,0.8;②制馬錢子劑間比為1:^8;③裂錢菌質(zhì)劑間比為1:0.85;竹錢菌質(zhì):劑間比為1:0.85;單錢菌質(zhì)劑間比為1:0.85;⑥雞錢菌質(zhì)劑間比為1:0.85;⑦白錢菌質(zhì)劑間比為1:0.85;⑧蟬錢菌質(zhì)劑間比為l:0.8。實驗前各組小鼠禁食(不禁水)12h后，灌胃0.4ml/20g體重的不同濃度的藥物，每日觀察一次，連續(xù)觀察14天，記錄受試小鼠精神活動、飲食、飲水、毛色、二便及死亡等情況，死亡小鼠及時進(jìn)行尸檢，計算LD50。3、實驗結(jié)果小鼠經(jīng)灌胃給予馬錢子、制馬錢子及其六種藥性菌質(zhì)后，均很快出現(xiàn)興奮癥狀，活動明顯增多，煩躁不安，最后四肢出現(xiàn)強(qiáng)直性驚厥，很快死亡。死亡時間一般發(fā)生在30min內(nèi)，少數(shù)在2h內(nèi)。未死動物(絕大部分在2h不死者都存活)逐漸恢復(fù)正常，以后的活動、食量及體重增長與未中毒動物相似。馬錢子(LDso為188.2mg/kg)相比，LD5()上升率{[(發(fā)酵品的LD5o—未發(fā)酵品的LDso)/未發(fā)酵品的LD5o]xlOO%}:六種藥性菌質(zhì)的LD50上升率在27.8%—50.6%之間，與制馬錢子34.3%—樣，毒性均有明顯下降(詳見表3)。表3六種藥性菌質(zhì)與馬錢子、制馬錢子的急性毒性比較_LDso(mg/kg)95%可信限(mg/kg)LDso上升率(％)馬錢子組85.2制馬錢子組114.4裂錢菌質(zhì)組128.3竹錢菌質(zhì)組112.4單錢菌質(zhì)組108.970.1—103.5—98.1—133.334.3112.6—146.350.696.9—130.331.996.6—122.727.8雞錢菌質(zhì)組116.5104.6—129.836.7白錢菌質(zhì)組123.9108.8—14145.4蟬錢菌質(zhì)組111.593.1—133.730.9權(quán)利要求1、一種以藥用真菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其特征在于該方法的步驟如下(1)選擇藥用真菌菌種，并對藥用真菌菌種進(jìn)行活化，進(jìn)一步擴(kuò)增培養(yǎng)，得到該菌種的菌球液；(2)對藥性基質(zhì)馬錢子進(jìn)行烘干、粉碎、加水浸潤、蒸汽高壓滅菌，取出冷卻，備用；(3)將上述菌種的菌球液接種到藥性基質(zhì)馬錢子上，進(jìn)行固體發(fā)酵；(4)收集馬錢子固體發(fā)酵產(chǎn)物，低溫干燥，得到馬錢子藥性菌質(zhì)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的固體發(fā)酵方法，其特征在于在步驟(1)中所述的藥用真菌菌種是裂褶菌、竹黃菌、單色云芝菌、雞油菌、白僵菌或蟬花菌中的一種。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的固體發(fā)酵方法，其特征在于在步驟(1)中所述的對真菌菌種的活化是采用的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，擴(kuò)增培養(yǎng)采用的是液體培養(yǎng)液搖瓶培養(yǎng)。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的固體發(fā)酵方法，其特征在于在步驟(2)中所述的對藥性基質(zhì)馬錢子烘干的溫度為60—8(TC,時間為6—8h;粉碎成粗粉，過5—10目篩；按馬錢子粗粉的干重加入180%—220%的水，浸潤0.5—lh;蒸汽高壓滅菌，蒸汽壓力為15磅，溫度121'C，滅菌60—120min，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?、根據(jù)權(quán)利要求1所述的固體發(fā)酵方法，其特征在于在步驟(3)中所述的固體發(fā)酵的發(fā)酵瓶體積為500—1000ml;每瓶裝馬錢子粗粉160—360g;接種菌種的菌球液6—10ml;發(fā)酵溫度為24—28'C;在培養(yǎng)箱內(nèi)覆蓋吸滿水的厚紗布，每天向紗布上噴水，使空氣相對濕度保持在70%—90%;接種后在無菌條件下用接種針在藥性基質(zhì)上扎孔，以加大發(fā)酵瓶內(nèi)的通氣量；發(fā)酵天數(shù)為30—45天。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的固體發(fā)酵方法，其特征在于在步驟(4)所述的馬錢子藥性菌質(zhì)分別是收集到的由裂褶菌、竹黃菌、單色云芝菌、雞油菌、白僵菌或蟬花菌經(jīng)固體發(fā)酵后的產(chǎn)物，在60—80'C下干燥，干燥時間為8—16h，干燥后發(fā)酵產(chǎn)物的名稱分別由六種發(fā)酵菌種和馬錢子中藥材中各取一個字組成，分別被命名為"裂錢菌質(zhì)"、"竹錢菌質(zhì)"、"單錢菌質(zhì)"、"雞錢菌質(zhì)"、"白錢菌質(zhì)"和"蟬錢菌質(zhì)"，并置于陰涼干燥處，密封貯藏。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的菌種活化的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，其培養(yǎng)方法是(1)馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g,葡萄糖10—20g，瓊脂18—20g,水1000ml;(2)配制方法稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸0.5h，紗布過濾，再加10—20g葡萄糖和18—20g瓊脂，充分溶解后趁熱用2-4層紗布過濾，分裝于試管內(nèi)，每支試管裝量為10—20ml;(3)高壓滅菌將上述試管置于15磅蒸汽，121。C下滅菌20—30min，冷卻到不燙手的溫度下取出試管擺斜面，冷卻至室溫后貯存?zhèn)溆茫?4)菌種取上述提及的六種藥用真菌菌種中的一種菌種；(5)接種取上述試管，在24—28'C無菌條件下進(jìn)行接種操作，從上述六種菌種之一的原菌種斜面上，切取綠豆粒大小的一塊菌絲體連同培養(yǎng)基，移入PDA斜面培養(yǎng)基的中下部進(jìn)行培養(yǎng)；(6)活化培養(yǎng)與管理接種后置24—28'C培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，箱內(nèi)相對濕度保持70%—90%，但早晚要進(jìn)行適當(dāng)通風(fēng)，保持空氣新鮮，接種后一周可見新生菌絲體，待培養(yǎng)到菌絲長滿PDA斜面，置冰箱內(nèi)4i:保存?zhèn)溆谩?、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的菌種擴(kuò)增培養(yǎng)采用的液體培養(yǎng)液搖瓶培養(yǎng)，其培養(yǎng)液由葡萄糖120g，KH2P049g，酵母粉30g，MgS044.5g，CaC0315g，維生素Bt0.6g和水6000ml配制而成，以上各成分充分溶解后分別裝入500ml三角瓶中，每瓶裝250ml培養(yǎng)液，在15磅蒸汽，121。C滅菌20一30min，取上述活化后的菌絲體菌塊接種到培養(yǎng)液中，設(shè)定搖床的搖速為130—150轉(zhuǎn)/分，在24—28'C下?lián)u培一周，產(chǎn)生菌球，得菌種的菌球液。全文摘要一種以藥用真菌實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的固體發(fā)酵方法，其步驟如下，對發(fā)酵所用的裂褶菌、竹黃菌、單色云芝菌、雞油菌、白僵菌或蟬花菌進(jìn)行活化和擴(kuò)增培養(yǎng)，對作為藥性基質(zhì)的馬錢子進(jìn)行烘干、粉碎、加水浸潤、蒸汽高壓滅菌等處理，將上述六種菌種分別接種于藥性基質(zhì)馬錢子上，在一定的條件下進(jìn)行固體發(fā)酵，收集所得各自相應(yīng)的發(fā)酵產(chǎn)物，低溫干燥，得到馬錢子的六種藥性菌質(zhì)——裂錢菌質(zhì)、竹錢菌質(zhì)、單錢菌質(zhì)、雞錢菌質(zhì)、白錢菌質(zhì)和蟬錢菌質(zhì)。本方法工藝簡便合理，可得到實現(xiàn)對馬錢子降毒存效的六種藥性菌質(zhì)，以用于治療。本發(fā)明的六種藥性菌質(zhì)在毒性上明顯低于馬錢子，在止痛、抗炎等方面有確切療效，可保持馬錢子原有的主要藥效。文檔編號A61K131/00GK101254236SQ20081002342公開日2008年9月3日申請日期2008年4月14日優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日發(fā)明者劉學(xué)湘,弦張,揚(yáng)潘,蔣亞平,蔡寶昌,龍陳申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué)