專利名稱：Bmp-7在制備預(yù)防和/或治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制備防治慢性肝病肝纖維化、肝硬化技術(shù)的藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝纖維化是各種慢性肝病病情發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)和病理特征。進(jìn)展性的 肝纖維化可出現(xiàn)肝功能的減退，進(jìn)而出現(xiàn)以肝小葉再生為特征的肝硬化，最終 導(dǎo)致肝功能的衰竭。近年來(lái)人們對(duì)肝纖維化的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了深入廣泛的探討， 逐漸改變了傳統(tǒng)肝纖維化不可逆轉(zhuǎn)的觀點(diǎn)[1]。但在實(shí)際臨床工作中，人們對(duì)肝纖 維化的治療仍然缺乏行之有效的措施。我國(guó)是一個(gè)肝病高發(fā)國(guó)家，每年因慢性 肝病纖維化以至發(fā)展成肝硬化都給眾多患者及社會(huì)都帶來(lái)巨大的損失，因此積 極探尋肝纖維化治療的有效方法顯得尤為緊迫。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs, Bone Morphogenic Proteins)是一組具有誘導(dǎo)新骨形 成的蛋白，也稱骨形成蛋白(OPs, Osteogenic Proteins)。其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白7 (BMP-7，也稱OP-l)因其在骨折時(shí)能夠促進(jìn)斷面骨小梁的形成，2001年已被美 國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床121。但近年來(lái)的深入研究卻表明，BMP-7在治療組織纖維 化的領(lǐng)域中可能有著更為誘人的應(yīng)用前景[3'4]。 BMP-7從形態(tài)和結(jié)構(gòu)上分析，可 與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子卩l(xiāng) (TGF-betal, Transforming Growth factor f31) —起歸屬于 TGF-(3超家族中的一員，通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，BMP-7卻發(fā)揮了與TGF-(M 截然不同的作用[5]。早在2000年，Hruska等就發(fā)現(xiàn)，在單側(cè)輸尿管結(jié)扎的大鼠 腎損模型中，給予BMP-7五天即可以改善腎小管和腎間質(zhì)的損害問(wèn)。Bottiglio 等在研究狼瘡性腎炎的小鼠模型中也觀察到，持續(xù)給予BMP-7十六周可有效緩 解腎間質(zhì)的炎癥并阻止間質(zhì)纖維化的形成和發(fā)生[7]。在隨后的研究中，Klahr等 又證明了 BMP-7具有抗纖維化的類似現(xiàn)象[8]。這種種有趣現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，引起了 人們對(duì)BMP-7作用機(jī)制的深思和探討。新近的研究終于揭示了 BMP-7抗纖維化 作用的初步機(jī)制。ZeisbergM等在體內(nèi)和體外均發(fā)現(xiàn)BMP-7可以逆轉(zhuǎn)由TGF-|31 誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而揭開了 BMP-7抗腎纖維化機(jī)制的一角 [3]; WangS等在腎病模型中也觀察到了類似的BMP-7對(duì)TGF-pl的拮抗作用[91; 而Marie I等在對(duì)研究炎癥性腸病模型的研究中又發(fā)現(xiàn)，BMP-7可以下調(diào)局部 TGF-pl的表達(dá)，從而顯著改善了局部腸段的病理改變[1()。綜合分析以上新近的 研究結(jié)果，強(qiáng)烈提示BMP-7具有抗組織纖維化的作用，其機(jī)制與拮抗TGF-(31 的作用或下調(diào)TGF-(31的表達(dá)密切相關(guān)。在慢性肝病時(shí)，TGF-(31是目前已知最強(qiáng)烈的纖維化促進(jìn)因子，通過(guò)與細(xì)胞 表面的受體結(jié)合，產(chǎn)生至關(guān)重要的致纖維化的病理生理效應(yīng)"'"'^。能否將BMP-7 應(yīng)用于慢性肝病肝纖維化的防治？BMP-7在肝臟中是否也能夠?qū)筎GF-pi的病 理生理效應(yīng)？目前這方面的研究鮮見報(bào)道[13]。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)BMP-7的研究報(bào)道 還很少，僅有的幾篇尚都局限于骨骼系統(tǒng)的研究[14'15]。國(guó)外的研究表明，生理狀 態(tài)時(shí)，體內(nèi)循環(huán)的BMP-7主要來(lái)自于腎臟，肝臟并無(wú)表達(dá)[16。但125[1]同位素 示蹤實(shí)驗(yàn)已觀察到，肝臟具有很強(qiáng)的與BMP-7結(jié)合的能力t17]。本專利發(fā)明人在 美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究肝臟再生的動(dòng)物模型時(shí)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了肝細(xì)胞和肝星 狀細(xì)胞的表面分布有BMP-7的結(jié)合受體[18]。這些研究結(jié)果對(duì)BMP-7應(yīng)用于實(shí) 驗(yàn)性肝纖維化治療的設(shè)想已經(jīng)提供了一定的基礎(chǔ)性的依據(jù)，但BMP-7與肝臟中 的細(xì)胞結(jié)合以后能否產(chǎn)生抗纖維化的作用，能否進(jìn)一步應(yīng)用于臨床，仍需要深 入地研究和觀察，這也正是課題組專家的關(guān)注點(diǎn)所在。經(jīng)過(guò)國(guó)家自然科學(xué)基金 項(xiàng)目(30570847)和上海市浦江人才計(jì)劃項(xiàng)目(05PJ14098)資助的研究，本發(fā) 明人終于發(fā)現(xiàn)，BMP-7具有顯著的預(yù)防和治療實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的作用，其作用 機(jī)制可能與以下因素有關(guān)(1)抑制細(xì)胞中促纖維化生長(zhǎng)因子TGF-(31的信號(hào)通 道蛋白Smadl/3的活性；(2)抑制TGF-pl的表達(dá)。本研究同時(shí)也表明，BMP-7 在影響TGF-pi表達(dá)和信號(hào)的同時(shí)，對(duì)TGF-pi受體TPRI和TpRII的表達(dá)并無(wú) 明顯影響。目前為止，關(guān)于BMP-7對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化影響的研究，國(guó)內(nèi)外尚未 見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題在于目前臨床除中藥外，尚無(wú)有效治療肝纖維化、肝硬化現(xiàn) 代單分子藥物。
本發(fā)明提出了骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-7在制備預(yù)防或/和治療哺乳動(dòng)物慢性 肝病肝纖維化、肝硬化藥物中的應(yīng)用；所述哺乳動(dòng)物包括人。
如上所述應(yīng)用，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-7在制備預(yù)防或/和治療哺乳動(dòng) 物實(shí)驗(yàn)性肝纖維化藥物中的應(yīng)用；所述哺乳動(dòng)物包括人。
如上所述應(yīng)用，其中將骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-7用于哺乳動(dòng)物腹腔隔日注 射，注射劑量為50-300pg/kg/次，時(shí)間在5 7周之間。
一種組合物，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-7，以及氰甲垸、三氟乙酸、牛血 清蛋白輔料、藥學(xué)上可接受的緩沖液。
如上所述組合物，其中BMP-7的儲(chǔ)存濃度在1.0-3.0mg/ml之間，使用濃度 為10-100|ng/ml。
該組合物在制備預(yù)防或/和治療哺乳動(dòng)物慢性肝病肝纖維化、肝硬化的藥物 中的應(yīng)用。
制備該組合物的方法，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-7與氰甲烷，三氟乙酸，牛血清蛋白輔料，以藥學(xué)上可接受的緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液NaCl 137mmol/L， KC12.7mmol/L， Na2HP04 4.3mmol/L， KH2P041.4mmol/L)溶解，
以溶液的方式混合制備藥劑。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將BMP-7應(yīng)用于預(yù)防和治療實(shí)驗(yàn)性肝纖維化具有顯著的作用。 其可以(1)抑制細(xì)胞中促纖維化生長(zhǎng)因子TGF-pi的信號(hào)通道蛋白Smadl/3 的活性；(2)抑制TGF-pi的表達(dá)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
(1)
(2)
(3)
(4)
BMP-7是體內(nèi)存在的天然多肽，對(duì)人體無(wú)免疫原性、無(wú)致病性。 BMP-7在美國(guó)己被FDA批準(zhǔn)用于骨折的輔助治療，具有較好的安全 性。
BMP-7能夠拮抗TGF-pi的病理生理作用，而TGF-pl是目前慢性肝 病中已知最強(qiáng)烈的纖維化促進(jìn)因子，所以其應(yīng)用于肝纖維化防治的 效果具備理論基礎(chǔ)。
我國(guó)存在巨大的慢性肝病人群，BMP-7若能產(chǎn)業(yè)化推出，將具有較 好的應(yīng)用前景。


圖1豬血清腹腔注射法制備大鼠肝纖維化模型的肝組織Masson染色照片。
A為正常對(duì)照組(40倍)，B為2周模型組(40倍)，C為6周模型組(40倍)，
D為8周模型組(40倍)。
圖2為雙酶門脈灌注和梯度離心法分離的原代大鼠肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞。A
為原代分離的大鼠肝星狀細(xì)胞，B為原代分離的大鼠肝細(xì)胞。
圖3 10ng/ml的BMP-7對(duì)肝星狀細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響。
圖4 10ng/ml的BMP-7對(duì)肝細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響。
圖5 50ng/ml的BMP-7對(duì)肝星狀細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響。
圖6 50ng/ml的BMP-7對(duì)肝細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響。
圖7 100ng/ml的BMP-7對(duì)肝星狀細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響。
圖8 100ng/ml的BMP-7對(duì)肝細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響。
圖9 50ng/ml的BMP-7對(duì)肝星狀細(xì)胞中TGF-pi表達(dá)的影響。A為處理前，
B為處理后。
圖10 BMP-7對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的預(yù)防和治療作用。A、 B、 C、 D和E 分別為不同實(shí)驗(yàn)組的肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(Masson膠原染色，40倍)，A為正常 對(duì)照組，B為肝纖維化模型組，C為早期治療組，D為逆轉(zhuǎn)組(后期治療組)，E 為預(yù)防組。
圖11 BMP-7對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝組織中TGF-pl表達(dá)的影響。其中泳 道1為模型組，2為后期治療組，3為早期治療組，4為預(yù)防組，5為正常對(duì)照組。
圖12 BMP-7對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝組織中TGF-pl表達(dá)的影響。A為模 型組，B為早期治療組。
具體實(shí)施例方式
1. 成功地制備了大鼠肝纖維化模型
運(yùn)用豬血清腹腔反復(fù)注射法，誘導(dǎo)免疫性大鼠肝纖維化模型。豬血清0.5ml/ 次，腹腔注射實(shí)驗(yàn)大鼠，每周兩次，共8周。如圖1所示。
2. 從模型動(dòng)物中成功地分離、培養(yǎng)肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞。
運(yùn)用雙酶(I型膠原酶和鏈霉蛋白酶E)門脈灌注及剃度離心法，分別分離 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞。如圖2所示。
3. 觀察BMP-7分別對(duì)原代肝細(xì)胞膠原產(chǎn)生和分泌能力的影響。 本發(fā)明中的BMP-7購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，純度大于95%(每個(gè)包裝的BMP-7
凍干粉劑，含0.2拜BMP-7， 33%氰甲垸，0.1%三氟乙酸，0.5mg牛血清蛋白)， 使用前儲(chǔ)存于-20。C，無(wú)需其它處理。
使用10ng/ml、 50ng/ml和100ng/ml濃度的BMP-7分別加入肝星狀細(xì)胞和 肝細(xì)胞的培養(yǎng)液中，分別于培養(yǎng)24小時(shí)和96小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞 勻漿液，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)其中的細(xì)胞外基質(zhì)。如圖3-圖8所示，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，與對(duì)照組相比，BMP-7可顯著減少肝星狀細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和分泌，
特別是i、 m型膠原影響較為明顯，對(duì)IV型膠原的影響相對(duì)較小；但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，
BMP-7對(duì)肝細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和分泌影響較小。濃度為50ng/ml BMP-7 的作用較10ng/ml的作用為強(qiáng)，但與100ng/ml的濃度無(wú)明顯區(qū)別。
4. 在體外水平上研究BMP-7可能存在的作用機(jī)制。 (1) BMP-7對(duì)TGF-pi結(jié)合受體的影響。
在體外水平觀察BMP-7對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的影響機(jī)制運(yùn)用雙標(biāo)記免疫熒 光技術(shù)，分別通過(guò)細(xì)胞免疫雙熒光和組織免疫雙熒光技術(shù)檢測(cè)BMP-7受體在纖 維化肝臟中的定位，并檢測(cè)TGF-pl受體和磷酸化Smad信號(hào)通道蛋白的改變， 運(yùn)用Real time PCR檢測(cè)TGF-pl的表達(dá)，分別觀察BMP-7對(duì)TGF-卩1結(jié)合受體 的影響，BMP-7對(duì)TGF-(31細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通道的影響以及BMP-7對(duì)肝星狀細(xì) 胞TGF-pi表達(dá)的影響。
設(shè)立實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組，使用50ng/ml的BMP-7加入肝星狀細(xì)胞的培養(yǎng) 液中，培養(yǎng)96小時(shí)后，觀察BMP-7分別對(duì)肝星狀細(xì)胞表面T|3R-I和T卩R-II的 影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP-7對(duì)肝星狀細(xì)胞表面TGF-pl結(jié)合受體TPR-I的表達(dá)或TpR-II的表達(dá)均無(wú)明顯影響。
(2) BMP-7對(duì)TGF-pi細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通道的影響。
Smad蛋白為TGF-P超家族成員的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通道蛋白，被激活后可發(fā) 生磷酸化并移行至細(xì)胞核內(nèi)。Smad2/3為TGF-pl的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白。使用50ng/ml 的BMP-7分別加入肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)96小時(shí)后，觀察 BMP-7分別對(duì)肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞中的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP-7可以明顯抑制 肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞中Smad2/3激活表達(dá)。
(3) BMP-7對(duì)肝星狀細(xì)胞TGF-pi表達(dá)的影響。 對(duì)分離培養(yǎng)的激活后的肝星狀細(xì)胞，用50ng/ml的BMP-7進(jìn)行處理，96小
時(shí)后，作Real-time PCR檢測(cè)TGF-pl的表達(dá)。使用引物為 rat TGF P 1 f: 5，-ACTACACGCGAAGGCACAGC國(guó)3， rat TGF 0 1 r: 5，-CTGCTCCTTCTTGTCTCCCGA-3' rat TGF P 1 probe: fam-5，-ctggagcccgcggtgattgtagagc-3，-tamara 73 如圖9所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP-7可顯著抑制激活后的肝星狀細(xì)胞中TGF-pi
的表達(dá)。
5.在活體水平上研究BMP-7對(duì)大鼠肝纖維化的影響及其機(jī)制。
(1) 制備免疫性大鼠肝纖維化模型。運(yùn)用豬血清腹腔反復(fù)注射法，誘導(dǎo)免 疫性大鼠肝纖維化模型。豬血清0.5ml/次，腹腔注射實(shí)驗(yàn)大鼠，每周兩次，共8 周。
(2) BMP-7預(yù)防、治療大鼠肝纖維化。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組①肝纖維化模 型組；②治療組自第二周起(肝纖維化開始發(fā)生)，給予100ng/kg的BMP-7，
(BMP-7制劑為凍干粉劑，含0,2nmBMP-7， 33%氰甲烷，0.1%三氟乙酸，0.5mg 牛血清蛋白，用磷酸鹽緩沖液(NaCl 137mmol/L， KC1 2.7mmol/L， Na2HP04 4.3腿ol/L， KH2P04 1.4mmol/L)或枸櫞酸鹽緩沖液(取2.1 %枸櫞酸水溶液， 用50%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.2)溶解，配成BMP-7的濃度為 1.0mg/ml-3.0mg/ml的溶液儲(chǔ)存。使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液或枸櫞酸鹽緩沖液稀 釋成50問(wèn)/ml的濃度使用液。也可以根據(jù)實(shí)際情況配成稍濃或者更稀的溶液， 以便于給藥時(shí)精確取量而同時(shí)又不明顯影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的循環(huán)體液量為準(zhǔn)。根據(jù) 劑量，給予使用液腹腔注射，隔日一次。③逆轉(zhuǎn)組自第四周起(肝纖維化已經(jīng) 形成)，給予lOOpg/kg的BMP-7使用液，腹腔注射，隔日一次。④預(yù)防組自 實(shí)驗(yàn)開始起(肝纖維化尚未發(fā)生)，給予lOOpg/kg的BMP-7使用液，腹腔注射， 隔日一次。⑤正常對(duì)照組即陰性對(duì)照組，給予等量磷酸鹽緩沖液腹腔注射， 隔日一次。各組治療時(shí)間分別為5 7周。如圖10所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP-7對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化具有明顯的預(yù)防和治療 作用；使用越早，效果越明顯。
(3) BMP-7對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝組織中TGF-P1表達(dá)的影響。 運(yùn)用免疫印跡(Western Blot)的方法。如圖11所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP-7
可以顯著抑制肝纖維化大鼠肝組織中TGF-pi的表達(dá)。
(4) 免疫組化檢測(cè)BMP-7對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝組織中TGF-pl表達(dá)的影響。
如圖12所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP-7可以抑制纖維化肝組織中TGF-pi的表達(dá)。 6.結(jié)論
綜上所見，該課題通過(guò)體內(nèi)、體外的研究，在活體水平上觀察BMP-7對(duì)實(shí) 驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝組織中TGF-pl表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)大鼠做肝組織切片免疫熒 光染色，分別檢測(cè)肝纖維化模型組與治療組中TGF-pl的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療 組中TGF-pl表達(dá)降低，BMP-7可以抑制纖維化肝組織中TGF-pi的表達(dá)。BMP-7 具有顯著的預(yù)防和治療實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的作用。
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1.骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-7在制備預(yù)防或/和治療哺乳動(dòng)物慢性肝病肝纖維化、肝硬化藥物中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述應(yīng)用，特征在于骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-7在制備預(yù)防或/ 和治療哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性肝纖維化藥物中的應(yīng)用；所述哺乳動(dòng)物包括人。
3. 如權(quán)利要求l所述應(yīng)用，特征在于，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-7用于哺乳 動(dòng)物腹腔隔日注射，注射劑量為50-300嗎/kg/次，時(shí)間在5 7周之間。
4. 一種組合物，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-7，以及氰甲烷、三氟乙酸、牛血 清蛋白輔料、藥學(xué)上可接受的緩沖液。
5. 如權(quán)利要求4所述的組合物，特征在于BMP-7的儲(chǔ)存濃度在1.0-3.0mg/ml 之間，使用濃度為10-100嗎/ml。
6. 如權(quán)利要求4所述的組合物在制備預(yù)防或/和治療哺乳動(dòng)物慢性肝病肝纖 維化、肝硬化的藥物中的應(yīng)用。
7. 制備權(quán)利要求4所述組合物的方法，特征在于將骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-7 與氰甲垸、三氟乙酸、牛血清蛋白輔料，以藥學(xué)上可接受的緩沖液溶解， 以溶液的方式混合制備藥劑。
全文摘要
本發(fā)明BMP-7在制備預(yù)防和/或治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域。通過(guò)動(dòng)物模型及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，制備大鼠肝纖維化模型，分離實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞，觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-7對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP-7可以抑制細(xì)胞中TGF-β1的信號(hào)通道蛋白Smad 1/3的活性，并抑制TGF-β1的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BMP-7對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化具有明顯的預(yù)防和治療作用。
文檔編號(hào)A61P1/00GK101301467SQ200810036429
公開日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者常義忠, 麗 楊, 楊長(zhǎng)青, 王勝蘭 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)