專利名稱：一種組織工程角膜基質支架及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及組織工程材料領域，尤其涉及一種組織工程角膜基質支架及其 制備方法和用途。
背景技術：
角膜由上皮層、前彈力層、基質層、后彈力層和內(nèi)皮層構成。角膜基質層
是角膜構成的主要部分，占角膜厚度的90%。它主要由角膜基質細胞、膠原纖維 和其他細胞外基質組成。正常情況下，角膜基質細胞處于靜止狀態(tài)，此外，角膜 基質細胞間的膠原纖維成層平行排列，直徑一致，間距相等。角膜基質特征性的 組織學結構是維持角膜透明的重要條件，是其他組織所不能替代的。應用組織
工程技術構建角膜基質一方面可為角膜上皮、內(nèi)皮細胞生長和組織形成過程中 提供含有必要生長因子、信號的生理環(huán)境，而且還可作為組織工程角膜上皮、 內(nèi)皮的載體，克服體外培養(yǎng)的上皮組織、內(nèi)皮組織質地松軟無法直接縫合固定、 難以轉移的缺陷。因此，角膜基質組織的構建是組織工程技術構建角膜的主要 任務、難點和關鍵所在。
目前應用于角膜基質構建的材料主要是天然來源材料，如動物膠原、明膠、 殼聚糖材料等。但天然材料存在著潛在病原體傳播、制備復雜、生產(chǎn)的標準化 程度不高等缺點。隨著組織工程學的不斷發(fā)展，材料科學的技術水平也日新月 異，如今人工合成可降解高分子材料在生物醫(yī)學中的應用已越來越廣泛。目前
有報道，將兔角膜基質細胞培養(yǎng)擴增后接種于聚羥基乙酸生物材料上，進行體 外構建角膜基質層的初步研究。研究表明聚羥基乙酸材料與角膜基質細胞有較
好的親和力。將角膜基質細胞-聚羥基乙酸復合物體外培養(yǎng)1周后植入裸鼠皮 下，6周后取出觀察，發(fā)現(xiàn)鏡下新生組織成網(wǎng)狀板層結構，免疫組織化學檢測到 I型膠原表達，透射電鏡掃描結果顯示新生組織膠原纖維直徑與正常角膜基質 層相近。
但是聚羥基乙酸體內(nèi)降解過快，降解產(chǎn)物單體羥基酸在局部積聚會造成局 部pH值下降，使細胞中毒乃至死亡。另外，正常人正視眼角膜表面具有一定的不規(guī)則性和非球面特性，因此天然角膜基質的曲率具有其特殊性，而目前所使 用的人工角膜基質支架都無法同其完全吻合，從而在實際使用中存在諸多不 便。
因此，本領域迫切需要提供一種降解速度適當，而且具有天然角膜基質曲 率的組織工程角膜基質支架。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種組織工程角膜基質支架。
本發(fā)明的另一個目的是提供所述支架的制備方法。
本發(fā)明的第三個目的是提供所述支架的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種角膜基質支架，所述的支架由聚乳酸一聚羥
基乙酸共聚物(PLGA)構成；所述支架為多孔支架，孔徑100—300^n;所述支架的 曲率能根據(jù)各人的眼球確定。
在另一優(yōu)選例中，所述的支架具有與需要修復的角膜缺損部位相匹配的形狀 和大小。
在另一優(yōu)選例中，所述聚乳酸一聚羥基乙酸共聚物的分子量為5000—200000; 所述支架中的聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA)的重量比為80:20—20:80。
在另一優(yōu)選例中，所述的聚乳酸一聚羥基乙酸共聚物的分子量為8000 — 150000;所述支架中的聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA)的重量比為75:25—25:75。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種如上所述的本發(fā)明提供的角膜基質支架的 制備方法，所述的方法包括步驟
(a) 將含有聚乳酸一聚羥基乙酸共聚物的溶液和粒徑為100 — 300 u m的鹽混 合，得到懸浮液，所述鹽和共聚物的重量比為4—20:1;所述聚乳酸一聚羥基乙酸 共聚物的分子量為5000—200000;所述共聚物中的聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA) 的重量比為80:20—20:80;
(b) 將懸浮液倒入模具中，干燥24—96小時；
(c) 脫模、除鹽、干燥24—96小時得到多孔膜；和
(d) 使1. 5x1. 5cm的多孔膜形成具有一定曲率的如上所述的本發(fā)明提供的角 膜基質支架。在另一優(yōu)選例中，所述鹽和共聚物的重量比為6 — 15:1。
在另一優(yōu)選例中，步驟(d)中將1. 5x1. 5cra的多孔膜被硬性隱形眼鏡夾持12一48小時；優(yōu)選在25—40。C夾持12 — 48小時。
在另一優(yōu)選例中，所述的聚乳酸一聚羥基乙酸共聚物的分子量為sooo —150000;所述共聚物中的聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA)的重量比為75: 25—25:75。
在另一優(yōu)選例中，所述的鹽是氯化鈉。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種如上所述的本發(fā)明提供的角膜基質支架的用途，可被用于制備組織工程角膜基質移植物。
據(jù)此，本發(fā)明提供了一種降解速度適當，而且具有天然角膜基質曲率的組織工程角膜基質支架。


圖l顯示了角膜基質細胞的培養(yǎng)情況；其中
A是體外培養(yǎng)第二代角膜基質細胞；B是細胞I型膠原免疫熒光染色陽性的情況。
圖2顯示了本發(fā)明提供的支架的表征；其中
A是材料大體觀，顯示弧度良好；B是細胞在材料上接種24小時后，細胞粘附良好的情況；C是體外培養(yǎng)一周后，細胞分泌大量基質的情況。
圖3顯示了本發(fā)明提供的支架構建的細胞一材料復合物和本發(fā)明提供的支架體內(nèi)植入后IO周的情況；其中
A是細胞一材料復合物組的情況；B是單純材料植入組的情況。
具體實施例方式
發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，由聚乳酸一聚羥基乙酸共聚物(PLGA)構成的組織工程角膜基質支架，當聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA)的重量比在一定的范圍內(nèi)時，支架的降解可以保持在較為合理的時間范圍內(nèi)(如體外10周左右)。同時，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，通過一些硬性隱形眼鏡的夾持，可以得到同天然角膜基質形狀高度吻合的組織工程角膜基質支架。
6如本文所用，術語"角膜基質支架"、"角膜基質材料"或"角膜基質支架材料"可互換使用，都是指用于組織工程角膜基質移植物體外構建時所使用的藥學上可接受的生物可降解材料。
本發(fā)明提供的支架為多孔膜結構，孔徑100 — 300um，優(yōu)選120 — 200um;曲率可以根據(jù)各人的眼球確定。其大小、形狀同待修復的角膜缺損部分相匹配。
本發(fā)明提供的角膜基質支架的材料是PLGA，無固定共聚方式，根據(jù)PLA與PGA不同比例，無規(guī)共聚，可以通過本領域熟知的渠道和方式獲得PLGA,例如但不限于通過商購的方式獲得。
本發(fā)明所提供的所述角膜基質支架的制備方法，包括步驟(a)將含有PLGA的溶液和鹽混合，得到懸浮液，所述鹽和共聚物的重量比為4一20:1; (b)將懸浮液倒入模具中，干燥24一96小時；(c)脫模、除鹽、干燥24—96小時得到多孔
膜；和(d)使1.5xl.5cm的多孔膜形成具有一定曲率的本發(fā)明提供的角膜基質支架。
所述的含有PLGA的溶液中PLGA的濃度為0.025 — 0. lg/ml (較佳地0.05g/ml)，其中包括PLGA和可以溶解PLGA的有機溶劑，所述的有機溶劑是氯仿
所述的鹽是氯化鈉；所述的鹽為顆粒狀，直徑范圍為100—300um，優(yōu)選范圍120—200um。
在另一優(yōu)選例中，將顆粒狀的鹽加入含有PLGA的溶液中，充分攪拌時鹽均勻分散得到懸浮液。
所述模具可以是本領域常規(guī)的，優(yōu)選8X8平底玻璃板。
所述的除鹽過程可以是本領域常用的，例如但不限于，用蒸餾水沖洗除去多孔膜中的鹽。
可以使用具有天然角膜基質曲率的物體夾持上述步驟(c)中得到的多孔膜，在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，使用硬性隱形眼鏡夾持多孔膜，得到本發(fā)明提供的角膜基質支架，夾持時間為12—48小時，優(yōu)選在25—40。C夾持12—48小時，更佳地在30—37。C夾持20—36小時。
角膜曲率每個人都不同，隱形眼鏡曲率是根據(jù)每個人眼球確定的，所塑型的材料也可以根據(jù)每個人的眼球確定其曲率。
本發(fā)明還提供組織工程角膜基質移植物的體外構建方法，即將種子細胞接
7種于本發(fā)明提供的角膜基質支架上，形成細胞一材料復合物，適宜條件下培養(yǎng)得到組織工程角膜基質移植物。
本發(fā)明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
1、 首次獲得了一種同天然角膜基質曲率非常接近的人工角膜基質支架。
2、 由本發(fā)明提供的角膜基質支架構建的角膜基質移植物植入體內(nèi)后感覺舒適。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1
制備角膜基質支架
PLGA (PLA/PGA=70/30， Mw=104900;購自山東醫(yī)療器械研究所)，以氯仿(購自國藥集團化學試劑有限公司)為溶劑，配制濃度為0. 05g/ml的PLGA溶液，充分溶解后按NaCl: PLGA=9: 1比例加入直徑150-180u NaCl (購自國藥集團化學試劑有限公司)顆粒，充分攪拌30分鐘使NaCl均勻分散，所得懸浮液快速倒入模具中，空氣中常溫干燥48小時，脫模后用蒸餾水洗去多孔膜中的NaCl，空氣干燥48小時，再放入40。C烘箱干燥24小時。
將上述方法制備的多孔膜剪裁成1.5X1. 5cm備用。美康硬性隱形眼鏡(BC:8.10、 PW: -2.50、 CT: 0.17、 SZ: 9.2， E. G. MEC CO. ， LTD)兩片，夾持多孔膜，放置于37'C烘箱靜置24小時，即得角膜基質支架。
角膜基質支架材料厚度為0.2毫米，具有良好的弧度(圖2.A)。材料孔隙率為85%，孔徑為150—180u m。
實施例2
組織工程角膜基質移植物體外構建材料與方法
1、角膜基質細胞細胞培養(yǎng)與傳代新生兔腹腔注射過量氯胺酮處死，75%酒精浸泡15分鐘消毒，無菌生理鹽水洗凈。于手術顯微鏡下，解剖分離角膜上皮層、角膜基質層和角膜內(nèi)皮層組織。取出角膜基質層放入PBS中清洗，剪成lmm2大小的組織塊，置于15ml離心管中，加入5ml 0.3%的11型膠原酶(溶于PBS) ， 37'C恒溫振蕩器內(nèi)消化約lh。收集細胞懸液，以1000rpm/分鐘速度離心5分鐘，棄去上清液，PBS和F12培養(yǎng)液各洗l遍。臺盼藍染色計數(shù)，選細胞活力〉85%的細胞，以0.4xl()6接種于100mm培養(yǎng)皿內(nèi)，加入10ml F12培養(yǎng)液，放入5%(:02、 37°C、飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，隔日換液。
原代細胞培養(yǎng)7天，光鏡下觀察細胞達融合狀態(tài)，棄去培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入0. 25%胰蛋白酶-0. 02%EDTA 3ml，觀察細胞回縮變圓，迅速加入lml FBS終止消化。吹打吸取細胞懸液，1000rpm/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，PBS清洗一次，離心，棄去上清，加入10ml F12培養(yǎng)液，以1:3的比例傳入新的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入F12培養(yǎng)液至10ml，放入5%C02、 37°C、飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，隔日換液。
2、細胞一材料復合物的體外制備
第三代培養(yǎng)7天觀察生長增殖良好的角膜基質細胞，胰酶消化，計數(shù)，以50xl(f個細胞/ml的濃度100^1接種于5mmX5mmXl隱實施例1制得的角膜基質支架上，放于37'C C02培養(yǎng)箱內(nèi)，4小時后，加入F12培養(yǎng)液，37t:C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日換液。掃描電鏡觀察細胞在生物支架中的生長、增殖及基質分泌情況。
結果
1、角膜基質細胞培養(yǎng)細胞生長迅速，6-8小時后逐漸貼壁，24小時后，形成梭型或不規(guī)則三角形。中央為橢圓形的細胞核。4天后，角膜基質細胞排列呈旋渦狀走行。培養(yǎng)約6-7天后，細胞可鋪占培養(yǎng)皿底面積70%。細胞I型膠原免疫熒光染色陽性。(圖1)
2、掃描電鏡顯示細胞在材料上粘附生長良好，并分泌大量基質(圖2.B，C)。
實施例3
修復角膜基質層缺損
兔耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)，麻醉平穩(wěn)后，常規(guī)消毒鋪巾，開瞼器開瞼，l能逢線懸吊上、下直肌，手術顯微鏡下，自10點至2點，掀起角膜基質瓣，其深度約達角膜全層的1/3，植入實施例2中得到的角膜基質細胞-角膜基質支架復合物，基質瓣復位，11-0縫線縫合。同時，對側眼采用與實驗組相同的手術方法在角膜基質層內(nèi)植入PLGA，設置單純材料對照組。術后持續(xù)觀察8周。
術后第8周取材。4%甲醛磷酸緩沖液固定24小時，石蠟包埋，切片，HE染色。(圖3. A，B)
結果表明，體內(nèi)植入后10周，細胞一材料復合物組可見角膜基質再生良好，材料全部降解。在單純材料植入組，基質內(nèi)重塑過程尚未結束。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實質技術內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實質技術內(nèi)容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。
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權利要求
1.一種角膜基質支架，其特征在于，所述的支架由聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)構成；所述支架為多孔支架，孔徑100-300μm；所述支架的曲率能根據(jù)各人的眼球確定。
2. 如權利要求1所述的支架，其特征在于，所述的支架具有與需要修復的角 膜缺損部位相匹配的形狀和大小。
3. 如權利要求1所述的支架，其特征在于，所述聚乳酸一聚羥基乙酸共聚物 的分子量為5000—200000;所述支架中的聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA)的重量 比為80:20—20:80。
4. 如權利要求1所述的支架，其特征在于，所述的聚乳酸一聚羥基乙酸共聚 物的分子量為8000—150000;所述支架中的聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA)的重 量比為75:25—25:75。
5. —種如權利要求l一4任一所述的角膜基質支架的制備方法，其特征在于， 所述的方法包括步驟(a) 將含有聚乳酸一聚羥基乙酸共聚物的溶液和粒徑為100 — 300ura的鹽混 合，得到懸浮液，所述鹽和共聚物的重量比為4一20:1;所述聚乳酸一聚羥基乙酸 共聚物的分子量為5000—200000;所述共聚物中的聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA) 的重量比為80:20—20:80;(b) 將懸浮液倒入模具中，干燥24—96小時；(c) 脫模、除鹽、干燥24—96小時得到多孔膜；和(d) 使1. 5x1. 5cm的多孔膜形成具有一定曲率的如權利要求l一4任一所述 的角膜基質支架。
6. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述鹽和共聚物的重量比為6 一15:1。
7. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(d)中將1.5xl.5cm的 多孔膜被硬性隱形眼鏡夾持12—48小時；優(yōu)選在25—4(TC夾持12—48小時。
8. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的聚乳酸一聚羥基乙酸 共聚物的分子量為8000—150000;所述共聚物中的聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA) 的重量比為75: 25 — 25: 75。
9. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的鹽是氯化鈉。
10. —種如權利要求l一4任一所述的角膜基質支架的用途，其特征在于, 被用于制備組織工程角膜基質移植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種角膜基質支架，所述的支架由聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)構成；所述支架為多孔支架，孔徑100-300μm；所述支架的曲率可以根據(jù)每個人眼球確定。本發(fā)明還公開了所述角膜基質支架的制備方法及其用途。
文檔編號A61L27/18GK101653623SQ20081004184
公開日2010年2月24日 申請日期2008年8月19日 優(yōu)先權日2008年8月19日
發(fā)明者劉枚華, 焱 王 申請人:杭州萬明生物科技有限公司