專利名稱：：粘膜疾病引起的組織退化、損傷或損害的治療或預(yù)防方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及粘膜疾病的治療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：口腔潰瘍粘膜炎(Oralulcerativemucositis)是癌癥藥物治療和放療中常見的疼痛性、劑量限制性毒性。這種疾病被表征為導(dǎo)致形成潰瘍性損害的口腔粘膜損壞。在粒細(xì)胞減少的患者中，伴有粘膜炎的潰瘍是常導(dǎo)致敗血癥或菌血癥的天然口腔細(xì)菌的常見入口。在接受抗腫瘤藥物治療的患者中，有三分之一以上發(fā)生一定程度的粘膜炎。在接受白血病誘導(dǎo)療法或者多種骨髓移植預(yù)處理方案治療的患者中，所述粘膜炎發(fā)生的頻率和嚴(yán)重程度明顯增加。在這些個(gè)體中，有四分之三以上的患者患有中度至重度粘膜炎并不罕見。中度至重度粘膜炎發(fā)生于幾乎所有接受頭部和頸部腫瘤放療的患者，并且通常始于15Gy的累積輻射量，而后在總劑量達(dá)到60Gy或以上時(shí)加重。粘膜炎的發(fā)展在臨床上經(jīng)歷三個(gè)階段1.伴隨有疼痛性粘膜紅斑的炎癥，其可以對(duì)局部麻醉劑做出應(yīng)答。2.伴有假膜形成的疼痛性潰瘍，以及在骨髓抑制治療的情況下，為需要抗菌治療的潛在威脅生命的敗血癥。疼痛的強(qiáng)度通常需要腸胃外給予麻醉劑鎮(zhèn)痛。3.自愈，發(fā)生在停止抗腫瘤治療后的約2-3周。粘膜炎的標(biāo)準(zhǔn)治療主要是姑息療法，包括使用局部鎮(zhèn)痛劑(例如利多卡因，lidocaine)和/或全身施用麻醉劑和抗生素。目前，唯一一種批準(zhǔn)用于口腔粘膜炎的治療劑是Kepivance(Palifermin)，其僅被批準(zhǔn)用于在進(jìn)行治療惡性血液病的造血干細(xì)胞移植前接受預(yù)處理方案的患者中治療口腔粘膜炎。作為生物過程的粘膜炎的復(fù)雜性僅在最近才被關(guān)注。己經(jīng)提出所述病癥代表口腔粘膜細(xì)胞和組織、活性氧、促炎細(xì)胞因子、凋亡介體和局部因素(例如唾液和口腔微生物群)間的連續(xù)相互作用。盡管上皮細(xì)胞退化和損壞最終導(dǎo)致粘膜潰瘍，但與輻射誘導(dǎo)的粘膜毒性相關(guān)的早期變化似乎發(fā)生在內(nèi)皮和粘膜下層的結(jié)締組織內(nèi)。對(duì)輻射1周內(nèi)粘膜的電子顯微鏡評(píng)估顯示出對(duì)內(nèi)皮和結(jié)締組織二者的損害，但沒有對(duì)上皮的損害。這種損傷可能是由自由基的形成介導(dǎo)的。輻射和化療兩者引發(fā)粘膜炎發(fā)展的整體機(jī)制似乎是類似的。本領(lǐng)域仍然需要改善粘膜疾病的治療或預(yù)防方法。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防、抑制或減輕由粘膜疾病引起的受試者組織退化、損傷或損害，或者恢復(fù)受所述疾病不利影響的受試者組織的治療方法，其包括向所述目標(biāo)受試者施用有效量的式A的免疫調(diào)節(jié)化合物R-NH-CH-(CH2)——C-XCOOHO(A)在式A中，n為l或2，R為氫、?；?、垸基或肽片段，X為芳族氨基酸或雜環(huán)氨基酸或其衍生物，其中，向所述目標(biāo)受試者施用所述免疫調(diào)節(jié)化合物，而不向所述目標(biāo)受試者施用至少一種所述干擾素。X優(yōu)選為L-色氨酸或D-色氨酸。本發(fā)明還涉及式A化合物在制備用于治療粘膜疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明可應(yīng)用于粘膜疾病或其疾病癥狀(manifestations)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，粘膜疾病由受試者(優(yōu)選人類患者)的輻射和/或化療而引起。所述輻射可以是急性輻射或者分次輻射(fractionatedradiation)。粘膜疾病可能是輻射和化療的組合引起的。在某些實(shí)施方案中，所述疾病是口腔粘膜疾病和/或食道粘膜疾病，例如粘膜炎(mocositis)和/或潰瘍性損害(ulcerativelesions)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及通過向哺乳動(dòng)物受試者(優(yōu)選人類患者)施用免疫調(diào)節(jié)化合物來治療粘膜炎。在某些實(shí)施方案中，在向患者施用輻射和/或化療劑之前、期間和/或之后，施用本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)化合物。輻射通常以多種劑量施用，但粘膜疾病發(fā)生于幾乎所有接受頭部和頸部腫瘤放療的患者，并通常始于15Gy的累積輻射量，而后在60Gy或以上的總累積劑量時(shí)加重。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在向患者施用7-8Gy(例如7.5Gy)、15Gy、40Gy、60Gy或更多輻射之前、期間或之后施用本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)化合物。還可以施用本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)化合物治療或預(yù)防由施用化療劑(例如順鉑)而引起的粘膜疾病，例如以約0.1-50mg/kg'范圍內(nèi)的劑量(例如約5mg/kg)施用化療劑而引起的粘膜疾病。本發(fā)明中使用的免疫調(diào)節(jié)化合物包括式A的免疫調(diào)節(jié)劑r-nh-ch-(ch2)——c——Xcooh0(A)式A中，n為l或2，R為氫、?；?、烷基或肽片段，X為芳族氨基酸或雜環(huán)氨基酸或者其衍生物。優(yōu)選X為L-色氨酸或D-色氨酸。作為"X"的芳族氨基酸或雜環(huán)氨基酸的適合衍生物為酰胺、一個(gè)(CrC6)烷基或兩個(gè)(CpC6)烷基取代的酰胺、芳基酰胺和(d-C6)烷基酯或芳基酯。作為"R"的合適的?；蛲榛鶠?至約6個(gè)碳的支鏈或直鏈烷基基團(tuán)、2至約10個(gè)碳原子的?；鶊F(tuán)以及封端基團(tuán)(如芐氧羰基和叔丁氧羰基)。優(yōu)選地，式A中顯示的CH基團(tuán)的碳具有立體構(gòu)型，當(dāng)n為2時(shí)，其立體構(gòu)型不同于X的立體構(gòu)型。優(yōu)選實(shí)施方案使用了化合物，如，D-谷氨?；?L-色氨酸、Y-L-谷氨?；?L-色氨酸、Y-L-谷氨?；?Nin-甲酰-L-色氨酸、N-甲基-Y-L-谷氨?；?L-色氨酸、N-乙酰個(gè)L-谷氨?；?L-色氨酸、Y-L-谷氨酰基-D-色氨酸、P-L-天冬氨酰-L-色氨酸和J3-D-天冬氨酰-L-色氨酸。特別優(yōu)選的實(shí)施方案使用了Y-D-谷氨?；?L-色氨酸，有時(shí)候稱為SCV-07。這些化合物、制備這些化合物的方法、這些化合物的藥學(xué)上可接受的鹽和其藥物制劑公開在美國專利第5,916,878號(hào)中，其通過引用方式并入本文。SCV-07,即Y-D-谷氨?；?L-色氨酸，是具有Y-谷氨?；蛘逷-天冬氨酰基的這類免疫調(diào)節(jié)藥物中的一員，其由俄羅斯科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，并在美國經(jīng)SciClonePharmaceuticals公司驗(yàn)證在幾個(gè)適應(yīng)癥上均具有療效。SCV-07在體內(nèi)和體外具有多種免疫調(diào)節(jié)活性。SCV-07提高了Con-A誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的增殖，增加了Con-A誘導(dǎo)的白介素2(IL-2)的生成和脾臟淋巴細(xì)胞的IL-2受體的表達(dá)，并剌激Thy-1.2在骨髓細(xì)胞上的表達(dá)。在體內(nèi)，SCV-07對(duì)受5-FU免疫抑制的動(dòng)物和使用綿羊紅血細(xì)胞的免疫模型具有強(qiáng)免疫促進(jìn)作用。式A化合物可以以在約0.001-2000mg的范圍內(nèi)的劑量施用，優(yōu)選劑量約為0.01-100mg。可以每周施用一次或多次，優(yōu)選以天為基礎(chǔ)，每天施用一次或多次?？梢酝ㄟ^任何合適的方法施用，包括通過注射、定期輸注和連續(xù)輸注等方式經(jīng)口、鼻、透皮、舌下施用?？赏ㄟ^肌內(nèi)注射施用，當(dāng)然也可以使用其它形式的注射和輸注，并且也可以采用其它施用形式，如經(jīng)口或鼻吸入或口服。劑量還可以以毫克/千克計(jì)算，所述劑量在約0.1-10,000ug/kg的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約1.0-1000ug/kg的范圍內(nèi)。還包括具有取代、刪除、延長、替換或其它修飾部分的生物活性類似物，其具有與SCV-07基本相似的生物活性，如與SCV-07具有足夠同源性，從而通過與SCV-07基本相同的活性以基本相同的方式發(fā)揮作用的SCV-07衍生肽。在一些實(shí)施方案中，所述式A化合物存在于藥學(xué)可接受的液體載體(例如注射用水、生理濃度的鹽水或其類似物)中，或者與合適的一種或多種干載體和一種或多種賦形劑一起以片劑的形式存在?？梢酝ㄟ^常規(guī)的劑量滴定(dose-titration)試驗(yàn)確定式A化合物的有效量。實(shí)施例1:SCV-07在治療倉鼠由急性輻射誘導(dǎo)的口腔粘膜炎中的首次研究1.目的該研究的目的是利用急性輻射誘導(dǎo)的倉鼠口腔粘膜炎疾病模型，對(duì)SCV-07治療該疾病的功效進(jìn)行初步評(píng)估。通過皮下注射以每天一次lug/kg、10ug/kg或100ug/kg的劑量施用SCV-07，在輻射前一天開始并持續(xù)至輻射后第16天，共給藥18天。在任何治療組都沒有觀察到死亡，并且生長速率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異，這表明這些劑量的SCV-07得到很好的耐受。在第-1天至第16天用10ug/kgSCV-07治療的動(dòng)物其第22天的粘膜炎評(píng)分顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低(P=0.024)。在第-1天至第16天用100ug/kgSCV-07治療的動(dòng)物其第14天的粘膜炎評(píng)分顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低(P=0.025)，另外評(píng)分為3或更高的天數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低(P=0.029)。這些數(shù)據(jù)表明，SCV-07對(duì)輻射誘導(dǎo)的粘膜炎的嚴(yán)重程度和病程具有劑量依賴性療效。急性輻射模型已經(jīng)證明倉鼠的急性輻射模型是提供抗粘膜炎化合物初步評(píng)估的一項(xiàng)準(zhǔn)確、有效且經(jīng)濟(jì)的技術(shù)。在這種模型中，粘膜炎的病程得到了很好的定義，并且在輻射后約14-16天達(dá)到評(píng)分峰值。所述急性模型幾乎沒有全身毒性，幾乎不會(huì)引起倉鼠死亡，因此可以使用小組(N=7-8)進(jìn)行初始功效研究。它還用于研究粘膜炎發(fā)病機(jī)理中的特定機(jī)理性要素。對(duì)于在所述急性輻射模型中顯示有效的分子，還可以在更復(fù)雜的分次輻射、化療或同步治療模型中對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。在這個(gè)研究中，在第0天施用40Gy的急性輻射劑量。在第12天至第28天，觀察到臨床上顯著的粘膜炎。2J開究目的和概述研究目的本研究的目的是評(píng)估通過在輻射前一天和輻射至第16天之間按不同的皮下注射方案施用的SCV-07對(duì)由急性輻射誘導(dǎo)的口腔粘膜炎的發(fā)病頻率、嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間的影響。研究概述在第0天，向32只敘利亞金色倉鼠(SyrianGoldenHamsters)的左側(cè)頰囊施用40Gy急性輻射劑量。通過每天一次皮下注射施用測試物。在輻射前一天(第-l天)開始給藥，并持續(xù)至第16天。從第6天開始對(duì)粘膜炎進(jìn)行臨床評(píng)估，并每隔一天評(píng)估持續(xù)直至第28天。3.評(píng)估粘膜炎評(píng)估從第6天開始對(duì)粘膜炎的等級(jí)進(jìn)行評(píng)分，隨后每隔一天進(jìn)行評(píng)分，直至第28天(包括第28天)。根據(jù)以下參數(shù)，評(píng)估與安慰劑相比每種藥物治療對(duì)粘膜炎的效果-各組中的倉鼠患有潰瘍粘膜炎(評(píng)分23)的天數(shù)上的差異。在進(jìn)行評(píng)估的每一天，將各藥物治療組中粘膜炎盲測評(píng)分S的動(dòng)物數(shù)量與對(duì)照組進(jìn)行比較。在累積的基礎(chǔ)上比較差異，并通過卡方分析(chi-squareanalysis)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。在這個(gè)分析中，將功效定義為與對(duì)照組相比，動(dòng)物組患有潰瘍(評(píng)分S)的天數(shù)顯著減少。每日粘膜炎評(píng)分的秩和差異(Ranksumdifferences)對(duì)于每個(gè)評(píng)估日，利用非參數(shù)秩和分析將對(duì)照組的評(píng)分與治療組的評(píng)分進(jìn)行比較。如果治療組從第6天至第28天中的兩天或更多天的評(píng)分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低，則認(rèn)為是治療成功。體重和存活狀態(tài)每天都對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行稱重并記錄其存活狀態(tài)，以評(píng)估治療組之間可能存在的動(dòng)物體重差異，將其作為由治療引起的粘膜炎嚴(yán)重程度和/或潛在毒性的指標(biāo)。4.研究的設(shè)計(jì)將32只敘利亞金色倉鼠分為4組，每組8只。在第0天使所有動(dòng)物在其左側(cè)頰囊接受40Gy的單劑量急性輻射。這可以通過麻醉動(dòng)物并將其左側(cè)頰囊外翻，同時(shí)用鉛屏保護(hù)動(dòng)物其它部位而實(shí)現(xiàn)。如表l中的詳述，通過每天一次皮下注射施用測試物。從第6天開始在臨床上評(píng)估粘膜炎，并每隔一天評(píng)估，持續(xù)直至第28天。表1.硏究的設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*第0天在輻射前30分鐘給藥。5.材料和方法進(jìn)行研究的場所在馬薩諸塞州劍橋(Cambridge，MA)，經(jīng)BiomodelsAAALAC認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。該研究得到了BiomodelsIACUC的正式批準(zhǔn)。動(dòng)物使用在研究開始時(shí)為5-6周齡、平均體重為85.3g的雄性LVG敘利亞金色倉鼠(CharlesRiverLaboratories)。利用耳號(hào)(earpunch)對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行編號(hào)，并以每籠8只動(dòng)物的小組進(jìn)行圈養(yǎng)。在研究開始前，使動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境。在這個(gè)為期5天的過程中，每天觀察動(dòng)物以淘汰不健康的動(dòng)物。圈養(yǎng)在提供有過濾空氣、溫度為70°F+/-5°F、相對(duì)濕度為50%+/-20%的動(dòng)物房中進(jìn)行研究。設(shè)定動(dòng)物房以保持最小為12-15的每小時(shí)換氣量。所述動(dòng)物房受自動(dòng)定時(shí)器調(diào)控，保持12小時(shí)接通和12小時(shí)關(guān)閉的光/暗循環(huán)，沒有微光。使用3^/-0-0^@墊料。墊料最少每周更換一次。利用市售去污劑清洗籠、蓋和瓶子等，并風(fēng)干。使用市售消毒劑對(duì)表面和引入櫥內(nèi)的材料進(jìn)行消毒。每天清掃地板并每周最少利用市售去污劑拖洗兩次。每個(gè)月，利用稀釋的漂白溶液將墻和籠架擦拭至少一次。對(duì)于所有籠舍，均使用具有確定研究、劑量、動(dòng)物編號(hào)和治療組所必須的適當(dāng)信息的籠舍卡片或標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記。記錄研究過程中的溫度和相對(duì)濕度，并保留記錄。飲食使用PurinaLabdiet⑧5061鼠糧飼喂動(dòng)物，并提供水，供其任意取食。動(dòng)物的隨機(jī)選擇和分配在輻射前，按照預(yù)期將動(dòng)物隨意分成4個(gè)治療組。通過與個(gè)體編號(hào)對(duì)應(yīng)的耳號(hào)確定每只動(dòng)物。為了得到更為一致的身份識(shí)別，使用耳號(hào)編號(hào)而非標(biāo)簽，這是因?yàn)闃?biāo)簽在研究過程中可能會(huì)被移動(dòng)。使用籠舍卡片或標(biāo)有研究編號(hào)(SCI-01)、治療組編號(hào)和動(dòng)物編號(hào)的標(biāo)簽確定每個(gè)籠舍。皮下給藥和藥物應(yīng)用提供粉末狀的測試化合物SCV-07，并在施用前溶于無菌的PBS中。制備三種稀釋液100lag/mL，10|ig/mL和1pg/mL。通過帶有27G針的結(jié)核菌素注射器，使用對(duì)各組適當(dāng)?shù)腟CV-07稀釋液，以0.1ml/100g體重的體積施用藥物。在背部或腹部進(jìn)行皮下注射。粘膜炎的誘導(dǎo)利用標(biāo)準(zhǔn)的急性輻射方法誘導(dǎo)粘膜炎。在第0天向所有動(dòng)物施用單劑量輻射(40Gy/劑)。利用160千伏電壓(15-ma)源在30cm的焦距產(chǎn)生輻射，使用0.35mmCu過濾體系硬化(hardened)。以3.2Gy/分鐘的速率靶向輻射左側(cè)頰囊粘膜。在輻射前，用腹膜內(nèi)注射氯胺酮(Ketamine，160mg/kg)和甲苯噻嗪(Xylazine，8mg/kg)麻醉動(dòng)物。利用鉛屏保護(hù)倉鼠身體的其它部位，將左側(cè)頰囊外翻、固定并分離。粘膜炎評(píng)分在上述研究的過程中，計(jì)算粘膜炎評(píng)分、體重變化和存活狀態(tài)。在對(duì)粘膜炎進(jìn)行評(píng)估中，采用吸入麻醉劑麻醉動(dòng)物，將左側(cè)頰囊外翻。通過與經(jīng)驗(yàn)證的圖片判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，對(duì)粘膜炎進(jìn)行目測評(píng)分，范圍為0(正常)至5(嚴(yán)重潰瘍)(臨床評(píng)分)。利用描述的方式，此判斷標(biāo)準(zhǔn)的定義如下表2:粘膜炎評(píng)分<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>認(rèn)為1-2的評(píng)分表示疾病的輕度階段，而3-5的評(píng)分表示中度至重度粘膜炎。目測評(píng)分后，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)每只動(dòng)物的粘膜進(jìn)行拍照。在實(shí)驗(yàn)總結(jié)時(shí)，使所有底片顯影并隨機(jī)對(duì)照片進(jìn)行編號(hào)。利用上述判斷標(biāo)準(zhǔn)，由至少兩位經(jīng)過訓(xùn)練的獨(dú)立觀察員對(duì)照片進(jìn)行盲測分級(jí)(盲測評(píng)分)。6.結(jié)果和討論6.1存活狀態(tài)在該研究過程中沒有觀察到死亡。6.2體重變化對(duì)每日平均百分體重變化數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。在研究過程中，鹽水(PBS)處理的對(duì)照倉鼠組的平均體重增加值是其初始體重的70.4%。在研究過程中，在從第-1天至第16天接受1ug/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值是其初始體重的68.4%。在研究過程中，在從第-l天至第16天接受10ug/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值是其初始體重的70.3%。在研究過程中，在從第-1天至第16天接受100ug/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值是其初始體重的82.0%。通過計(jì)算每只動(dòng)物體重增加的曲線下面積(AUC)評(píng)估這些差異的顯著性，然后利用單向ANOVA檢驗(yàn)比較不同的治療組。此分析的結(jié)果表明不同治療組之間沒有顯著差異(p=0.191)。6.3粘膜炎(表3和4)計(jì)算各組的每日平均粘膜炎評(píng)分。在鹽水處理的對(duì)照組，在第20天觀察到粘膜炎峰值水平，此時(shí)的平均評(píng)分達(dá)到3.8。從第-l天至第16天接受1ug/kgSCV-07的組在第16天粘膜炎平均評(píng)分峰值為3.8。從第-1天至第16天接受10ug/kgSCV-07的組在第16天粘膜炎平均評(píng)分峰值為3.7。從第-1天至第16天接受100ug/kgSCV-07的組在第18天粘膜炎平均評(píng)分峰值為3.4。通過計(jì)算各組評(píng)分為3或更高的天數(shù)并利用卡方檢驗(yàn)比較這些數(shù)字來評(píng)估在不同治療組間觀察到的差異的顯著性。該分析的結(jié)果示于表2中。鹽水處理的對(duì)照組倉鼠在所評(píng)估的46.9%的動(dòng)物日中評(píng)分都為3或更高。對(duì)于在第-1天至第16天接受1ug/kgSCV-07的組，也在所評(píng)估的46.9%的動(dòng)物日觀察到3或更高的粘膜炎評(píng)分。在第-1天至第16天用10ug/kgSCV-07治療的組中的倉鼠在37.5%的動(dòng)物日具有3或更高的評(píng)分，但其與對(duì)照之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P=0.079)。在第-1天至第16天用100ug/kgSCV-07治療的組中，倉鼠在35.4%的動(dòng)物日具有3或更高的評(píng)分，其與對(duì)照之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P=0.029)。利用Mann-Whitney秩和分析對(duì)粘膜炎評(píng)分進(jìn)行進(jìn)一步分析，以比較各組的每日評(píng)分。這個(gè)分析的結(jié)果示于表4中。在此分析中，通常需要粘膜炎評(píng)分顯著下降2天才能視為粘膜炎明顯緩解。相對(duì)于鹽水對(duì)照組，在第-l天至第16天用lug/kgSCV-07治療的組在研究中任一天都沒有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的任何癥狀改善。相對(duì)于對(duì)照，在第-1天至第16天用10ug/kgSCV-07治療的組在第22天顯示出顯著的改善(P-0.024)。相對(duì)于對(duì)照，在第-1天至第16天用100ug/kgSCV-07治療的組在第14天顯示出顯著的改善(P-0.025)。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3.各組動(dòng)物評(píng)分為3或更高的總天數(shù)的卡方分析。這個(gè)統(tǒng)計(jì)量是潰瘍嚴(yán)重程度的計(jì)算值，是在臨床上具有重要意義的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表4.利用Mann-Whtiney秩和檢驗(yàn)，測定所觀察的每日粘膜炎評(píng)分的組間差異顯著性。這個(gè)非參數(shù)統(tǒng)計(jì)量適合于粘膜炎目測評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)。顯示了各個(gè)計(jì)算的P值。下劃線表示顯著改善。結(jié)論1.根據(jù)死亡率和體重增加的觀察結(jié)果，在該研究中沒有來自SCV-07的任何毒性的證據(jù)。2.在第-1天至第16天用10ug/kgSCV-07治療的動(dòng)物在第22天的粘膜炎評(píng)分顯示出與劑量相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低(P二0.024)。3.在第-1天至第16天用100ug/kgSCV-07治療的動(dòng)物在第14天的粘膜炎評(píng)分顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低(P-0.025)，另外評(píng)分為3或更高的動(dòng)物天數(shù)顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低(PK).029)。4.觀察到SCV-07對(duì)粘膜炎的嚴(yán)重程度和病程具有有利的劑量依賴性作用。提高給藥頻率或使每日單劑量加倍可能增強(qiáng)所觀察到的效果。SI<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>附表2-粘膜炎評(píng)分<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例2:SCV-07在治療倉鼠由急性輻射誘導(dǎo)的口腔粘膜炎的二次研究本研究的目的是利用急性輻射誘導(dǎo)的倉鼠口腔粘膜炎疾病模型，對(duì)SCV-07在治療該疾病的功效進(jìn)行初步評(píng)估。通過皮下注射以每天一次或兩次lmg/kg或100ug/kg的劑量施用SCV-07，從輻射前一天開始并持續(xù)至輻射后第20天，共22天。在任何治療組都沒有觀察到死亡，并且生長速率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著增加，這表明這些劑量的SCV-07可以得到很好的耐受，并且實(shí)際上可以降低與粘膜炎相關(guān)的體重減少。在該研究中，對(duì)照組倉鼠在所評(píng)估的28.1%的動(dòng)物日的粘膜炎評(píng)分為3或更高。在第-l天至第20天每天一次用100pg/kgSCV-07治療的動(dòng)物，其評(píng)分為3或更高的動(dòng)物天數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低至6.3%(P〈0細(xì))，并且在第14天(P-O.Oll)、16天(P=0,002)和18天(P=0.001)的單日評(píng)分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低。在第-1天至第20天每天兩次用100pg/kgSCV-07治療的動(dòng)物，其評(píng)分為3或更高的動(dòng)物天數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低至8.9%(P<0.001)，并且在第18天(P<0.001)禾U20天(P=0.003)的單日評(píng)分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低。在第-1天至第20天每天兩次用lmg/kgSCV-07治療的動(dòng)物，其評(píng)分為3或更高的動(dòng)物天數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低至12.5%(P〈0細(xì))，并且在第16天(P=0.043)、18天(P=0.009)和20天(P=0.007)的單日評(píng)分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低。從第-1天至第20天每天兩次用1mg/kgSCV-07治療的動(dòng)物的粘膜炎評(píng)分沒有顯示出任何顯著降低。每天一次用100pg/kgSCV-07治療的組與每天兩次用1mg/kgSCV-07治療的組之間，評(píng)分為3或更高的動(dòng)物天數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P=0.054)。當(dāng)比較這兩組之間的單日評(píng)分時(shí)，僅在第14天觀察到顯著的差異(P=0.005)。這些觀察結(jié)果表明，每天一次用100pg/kgSCV-07治療與每天兩次用lmg/kgSCV-07治療的顯著改善非常接近。這個(gè)觀察結(jié)果表明，每天一次100pg/kg是最接近于本研究和之前SCI-01研究所測劑量中最佳給藥劑量的劑量。介紹1.1背景口腔潰瘍粘膜炎是癌癥藥物治療和放療中常見的疼痛性、劑量限制性毒性。這種疾病被表征為導(dǎo)致形成潰瘍性病變的口腔粘膜損壞。在粒細(xì)胞減少的患者中，伴有粘膜炎的潰瘍是常導(dǎo)致敗血癥或菌血癥的天然口腔細(xì)菌的常見入口。在接受抗腫瘤藥物治療的患者中，有三分之一以上發(fā)生一定程度的粘膜炎。在使用白血病誘導(dǎo)療法或者多種骨髓移植預(yù)處理方案治療的患者中，所述粘膜炎發(fā)生的頻率和嚴(yán)重程度明顯增加。在這些個(gè)體中，有四分之三以上的患者患有中度至重度粘膜炎，這并不罕見。中度至重度粘膜炎發(fā)生于幾乎所有接受頭部和頸部腫瘤放療的患者，并且通常始于15Gy的累積輻射量，而后在總劑量達(dá)到60Gy以上的總劑量時(shí)加重。粘膜炎的發(fā)展在臨床上經(jīng)歷三個(gè)階段1.伴隨有疼痛性粘膜紅斑的炎癥，其可以對(duì)局部麻醉劑做出應(yīng)答。2.伴有假膜形成的疼痛性潰瘍，以及在骨髓抑制治療的情況下，為需要抗菌治療的潛在威脅生命的敗血癥。疼痛的強(qiáng)度通常需要腸胃外麻醉藥鎮(zhèn)痛。3.自愈，發(fā)生在停止抗腫瘤治療后的約2-3周。粘膜炎的標(biāo)準(zhǔn)治療主要是姑息療法，包括使用局部鎮(zhèn)痛劑(例如利多卡因)和/或全身施用麻醉藥和抗生素。目前，唯一一種批準(zhǔn)用于口腔粘膜炎的治療劑是Kepivance(Palifermin)，其僅被批準(zhǔn)用于在進(jìn)行治療惡性血液病的造血干細(xì)胞移植前接收預(yù)處理方案的患者中治療口腔粘膜炎。粘膜炎作為生物過程的復(fù)雜性僅在最近才被關(guān)注。已經(jīng)提出所述病癥代表口腔粘膜細(xì)胞和組織、活性氧、促炎性細(xì)胞因子、凋亡介體和局部因素(例如唾液和口腔微生物群)間的連續(xù)相互作用。盡管上皮細(xì)胞退化和損壞最終導(dǎo)致粘膜潰瘍，但與輻射誘導(dǎo)的粘膜毒性相關(guān)的早期變化似乎發(fā)生在內(nèi)皮和粘膜下層的結(jié)締組織內(nèi)。對(duì)輻射1周內(nèi)粘膜的電子顯微鏡評(píng)估顯示出對(duì)內(nèi)皮和結(jié)締組織二者的損害，但沒有對(duì)上皮的損害。這種損傷可能是由自由基的形成介導(dǎo)的。輻射和化療兩者引發(fā)粘膜炎發(fā)展的整體機(jī)制似乎是類似的。1.2急性輻射模型已經(jīng)證明由本課題的主要研究者開發(fā)的急性輻射倉鼠模型是提供抗粘膜炎化合物初步評(píng)估的一項(xiàng)準(zhǔn)確、有效且經(jīng)濟(jì)的技術(shù)。在這個(gè)模型中，粘膜炎的病程得到了很好的定義，并且在輻射后約14-16天達(dá)到評(píng)分峰值。所述急性模型幾乎沒有全身毒性，幾乎不會(huì)引起倉鼠死亡，因此可以使用小組(N=7-8)進(jìn)行初始功效研究。它還用于研究粘膜炎發(fā)病機(jī)理中的特定機(jī)制性要素。對(duì)于在所述急性輻射模型中顯示有效的分子，還可以在更復(fù)雜的分次輻射、化療或同步治療模型中對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。在這個(gè)研究中，在第0天施用40Gy的急性輻射劑量。在第12天至第28天，觀察到在臨床上顯著的粘膜炎。2.研究目的和概述2.1研究目的本研究的目的是評(píng)估通過在輻射前一天和輻射后第20天之間按不同的皮下注射方案施用的SCV-07對(duì)由急性輻射誘導(dǎo)的口腔粘膜炎的發(fā)病頻率、嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間的影響。之前利用SCV-07的研究(研究SCI-Ol，實(shí)施例l)已經(jīng)表明，從第-l天至第16天每天一次施用100^ig/kg劑量具有一定的抗粘膜炎活性。在這個(gè)研究中，從第-1天至第20天每天一次或兩次施用100ng/kg和lmg/kg的SCV-07，以觀察在之前研究中所見的部分效果是否能夠持續(xù)。2.2研究概述第0天，向40只敘利亞金色倉鼠的左側(cè)頰囊施用40Gy急性輻射劑量。通過每天一次或兩次皮下注射100pg/kg或lmg/kg施用測試物SCV-07。在輻射前一天(第-l天)開始給藥，并持續(xù)至第20天。從第6天開始對(duì)粘膜炎進(jìn)行臨床評(píng)估，并每隔一天評(píng)估，持續(xù)直至第28天。3.評(píng)估3.1粘膜炎評(píng)估從第6天開始對(duì)粘膜炎的級(jí)別進(jìn)行評(píng)分，隨后每隔一天進(jìn)行評(píng)分，直至第28天(包括第28天)。根據(jù)以下參數(shù)，評(píng)估與安慰劑相比，每種藥物治療對(duì)粘膜炎的效果3丄1各組中的倉鼠在患有潰瘍粘膜炎(評(píng)分>3)的天數(shù)上的差異。在進(jìn)行評(píng)估的每一天，將各藥物治療組中粘膜炎盲測評(píng)分^3的動(dòng)物數(shù)量與對(duì)照組進(jìn)行比較。在累積的基礎(chǔ)上比較差異，并通過卡方分析確定統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。在這個(gè)分析中，將功效定義為與對(duì)照組相比，動(dòng)物組患有潰瘍(評(píng)分S)的天數(shù)顯著降低。與此相同的實(shí)驗(yàn)還用于評(píng)估不同藥物治療組之間的差異。3丄2每日粘膜炎評(píng)分的秩和差異對(duì)于每個(gè)評(píng)估日，利用非參數(shù)秩和分析將對(duì)照組的評(píng)分與治療組的評(píng)分進(jìn)行比較。如果治療組從第6天至第28天中的兩天或更多天的評(píng)分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低，則認(rèn)為是治療成功。3.2體重和存活狀態(tài)每天都對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行稱重并記錄其存活狀態(tài)，以評(píng)估治療組之間可能存在的動(dòng)物體重差異，將其作為由治療引起的粘膜炎嚴(yán)重程度和/或潛在毒性的指標(biāo)。4.研究設(shè)計(jì)將40只敘利亞金色倉鼠分為5組，每組8只。在第0天使所有動(dòng)物在其左側(cè)頰囊接受40Gy的單劑量急性輻射。這可以通過麻醉動(dòng)物并將其左側(cè)頰囊外翻，同時(shí)用鉛屏保護(hù)動(dòng)物其它部位而實(shí)現(xiàn)。根據(jù)表5的詳述，通過每天一次皮下注射施用測試物。在第6天開始在臨床上評(píng)估粘膜炎，并每隔一天評(píng)估，持續(xù)直至第28天。表5.SCI-02研究設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*第0天在輻射前30分鐘給藥。5.材料和方法5.1進(jìn)行研究的場所在馬薩諸塞州沃特敦(Watertown，MA)，經(jīng)BiomodelAAALAC認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。該研究得到了BiomoddIACUC的證實(shí)批準(zhǔn)。5.2動(dòng)物使用在研究開始時(shí)為5-6周齡、平均體重為85.3g的雄性LVG敘利亞金色倉鼠(CharlesRiverLaboratories)。利用耳號(hào)對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行編號(hào)，并以每籠8只動(dòng)物的小組進(jìn)行圈養(yǎng)。在研究開始前，使動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境。在這個(gè)為期5天的過程中，每天觀察動(dòng)物以淘汰不健康的動(dòng)物。5.3圈養(yǎng)在提供有過濾空氣、溫度為70°F+/-5°F、相對(duì)濕度為50%+/-20%的動(dòng)物房中進(jìn)行研究。設(shè)定動(dòng)物房以保持最小為12-15的每小時(shí)換氣量。所述動(dòng)物房受自動(dòng)定時(shí)器調(diào)控，保持12小時(shí)接通和12小時(shí)關(guān)閉的光/暗循環(huán)，沒有微光。使用5^Z-(9-Cbfe⑧墊料。墊料最少每周更換一次。利用市售去污劑清洗籠、蓋和瓶子等，并風(fēng)干。使用市售消毒劑對(duì)表面和引入櫥內(nèi)的材料進(jìn)行消毒。每天清掃地板并且每周最少利用市售去污劑拖洗兩次。每個(gè)月利用稀釋的漂白溶液將墻和籠架擦拭至少一次。對(duì)于所有籠舍，均使用具有確定研究、劑量、動(dòng)物編號(hào)和治療組所必須的適當(dāng)信息的籠舍卡片或標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記。記錄研究過程中的溫度和相對(duì)濕度，并保留記錄。5.4飲食使用PurinaLabdiet5061鼠糧飼喂動(dòng)物，并提供水，供其任意取食。5.5動(dòng)物隨機(jī)選擇和分配在輻射前，按照預(yù)期將動(dòng)物隨意分成5個(gè)治療組。通過與個(gè)體編號(hào)對(duì)應(yīng)的耳號(hào)識(shí)別每只動(dòng)物。為了得到更為一致的身份識(shí)別，使用耳號(hào)編號(hào)而非標(biāo)簽，這是因?yàn)闃?biāo)簽在研究過程中可能會(huì)被移動(dòng)。使用籠舍卡片或標(biāo)有研究編號(hào)(SCI-02)、治療組編號(hào)和動(dòng)物編號(hào)的標(biāo)簽確定每個(gè)籠舍。5.6皮下給藥和藥物應(yīng)用提供粉末狀的測試化合物SCV-07，并在施用前溶于無菌的PBS中。制備三種稀釋液100ng/mL，10pg/mL和1pg/m。通過帶有27G針的結(jié)核菌素注射器，使用對(duì)各組適當(dāng)?shù)腟CV-07稀釋液，以0.1ml/100g體重的體積施用藥物。在背部或腹部進(jìn)行皮下注射。5.7粘膜炎的誘導(dǎo)利用標(biāo)準(zhǔn)的急性輻射方法誘導(dǎo)粘膜炎。在第0天向所有動(dòng)物施用單劑量輻射(40Gy/劑)。利用160千伏電壓(15-ma)源在30cm的焦距產(chǎn)生輻射，使用0.35mmCu過濾體系硬化。以3.2Gy/分鐘的速率耙向輻射左側(cè)頰囊粘膜。在輻射前，用腹膜內(nèi)注射氯胺酮(160mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)麻醉動(dòng)物。利用鉛屏保護(hù)倉鼠身體的其它部位，將左側(cè)頰囊外翻，固定并分離。5.8粘膜炎評(píng)分在上述研究的過程中，計(jì)算粘膜炎評(píng)分、體重變化和生存狀態(tài)。為了對(duì)粘膜炎進(jìn)行評(píng)估，利用吸入麻醉劑麻醉動(dòng)物，并將左側(cè)頰囊外翻。通過與經(jīng)驗(yàn)證的圖片判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，對(duì)粘膜炎進(jìn)行目測評(píng)分，范圍為0(正常)至5(嚴(yán)重潰瘍，臨床評(píng)分)。利用描述的方式，此判斷標(biāo)準(zhǔn)的定義如下<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表6SCI-02:粘膜炎評(píng)分認(rèn)為1-2的評(píng)分表示疾病的輕度階段，而3-5的評(píng)分表示中度至重度粘膜炎。目測評(píng)分后，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)每只動(dòng)物的粘膜進(jìn)行拍照。在實(shí)驗(yàn)總結(jié)時(shí)，將所有底片顯影并隨機(jī)對(duì)照片進(jìn)行編號(hào)。利用上述判斷標(biāo)準(zhǔn)，由至少兩位經(jīng)過訓(xùn)練的獨(dú)立觀察員對(duì)照片進(jìn)行以盲測分級(jí)(盲測評(píng)分)。6.結(jié)果和討論6.1生存狀態(tài)在該研究過程中沒有觀察到死亡。6.2體重變化對(duì)每日平均百分體重變化數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。在研究過程中，鹽水處理的對(duì)照倉鼠的平均體重增加值是其初始體重的44.1%。在研究過程中，在從第-1天至第20天每天一次接受100ug/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值是其初始體重的49.9%。在研究過程中，在從第-1天至第20天每天兩次接受100ug/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值是其初始體重的61.3%。在研究過程中，在從第-1天至第20天每天一次接受lmg/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值是其初始體重的63.4%。在研究過程中，在從第-l天至第20天每天兩次接受lmg/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值是其初始體重的69.1%。通過計(jì)算每只動(dòng)物體重增加的曲線下面積(AUC)評(píng)估這些差異的顯著性，然后利用單向ANOVA檢驗(yàn)比較不同治療組。該分析的結(jié)果表明，SCV-07治療組和對(duì)照組之間具有顯著差異(P=0.012)。每天兩次用100pg/kg治療的組和每天一次用1mg/kgSCV-07治療的組、每天兩次用1mg/kgSCV-07治療的組的體重增加都顯著大于鹽水對(duì)照組(分別為P=0.014、P=0.009、P=0.004)。6.3粘膜炎(表7和8)計(jì)算每組的每日平均粘膜炎評(píng)分。在鹽水處理的對(duì)照組，在第18天觀察到粘膜炎峰值水平，此時(shí)的平均評(píng)分達(dá)到3.0。從第-1天至第20天每天一次接受100ug/kgSCV-07的組在第16天的粘膜炎平均評(píng)分峰值為2.2。從第-1天至第20天每天兩次接受100ug/kgSCV-07的組在第14天和第16天的粘膜炎平均評(píng)分峰值為2.5。從第-1天至第20天每天一次接受1mg/kgSCV-07的組在第14天的粘膜炎平均評(píng)分峰值為2.9。從第-1天至第20天每天兩次接受1mg/kgSCV-07的組在第14天的粘膜炎平均評(píng)分峰值為2.6。通過計(jì)算各組評(píng)分為3或更高的天數(shù)并利用卡方(x2)檢驗(yàn)比較這些數(shù)字來評(píng)估在不同治療組間觀察到的差異的顯著性。該分析的結(jié)果示于表7中。鹽水處理的對(duì)照組倉鼠在所評(píng)估的28.1%的動(dòng)物日中評(píng)分都為3或更高。對(duì)于在第-1天至第20天每天一次接受100ug/kgSCV-07的組，在所評(píng)估的6.3%的動(dòng)物日觀察到3或更高的粘膜炎評(píng)分，這與對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P<0.001)。對(duì)于在第-1天至第20天每天兩次接受100ug/kgSCV-07的組，在所評(píng)估的8.9%的動(dòng)物日觀察到3或更高的粘膜炎評(píng)分，這與對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P〈0.001)。對(duì)于第-1天至第20天每天一次用lmg/kgSCV-07治療的組，在28.1%的動(dòng)物日具有3或更高的評(píng)分，其與對(duì)照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異(P4.000)。第-1天至第20天每天兩次用lmg/kgSCV-07治療的組，在12.5%的動(dòng)物日都具有3或更高的評(píng)分，其與對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(PO.OOl)。每天一次用100pg/kgSCV-07治療的組與每天兩次用1mg/kgSCV-07治療的組之間，評(píng)分為3或更高的動(dòng)物天數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異(P:0.054)。利用Mann-Whitney秩和分析對(duì)粘膜炎評(píng)分進(jìn)行進(jìn)一步分析，以比較各組的每日評(píng)分。這個(gè)分析的結(jié)果示于表8中。在此分析中，通常需要粘膜炎評(píng)分顯著下降2天才能視為粘膜炎明顯緩解。相對(duì)于鹽水對(duì)照組，在第-l天至第20天每天一次用100ug/kgSCV-07治療的組在研究的第14天(？=0.011)、第16天(P=0.002)和第18天(P=0.001)顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著改善。相對(duì)于對(duì)照，在第-1天至第20天每天兩次用100ug/kgSCV-07治療的組在第18天(PO.001)和第20天(P=0.003)顯示出顯著改善。相對(duì)于對(duì)照，在第-l天至第20天每天一次用1mg/kgSCV-07治療的組的粘膜炎在研究中任一天都沒有顯示任何顯著改善。相對(duì)于對(duì)照，在第-l天至第20天每天兩次用lmg/kgSCV-07治療的組在第16天(P二0.043)、第18天(P^.009)和第20天(P-0.007)顯示出顯著改善。通過對(duì)每天一次用100pg/kgSCV-07治療的組和每天兩次用1mg/kgSCV-07治療的組進(jìn)行比較，僅在第14天顯示出單日的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P-0.005)。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表7.SCI-02.各組動(dòng)物評(píng)分為3或更高的總天數(shù)的卡方分析。這個(gè)統(tǒng)計(jì)量是潰瘍嚴(yán)重程度的計(jì)算值，是具有臨床重要性的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表8.SCI-02.利用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，測定所觀察的每日粘膜炎評(píng)分的組間差異顯著性。這個(gè)非參數(shù)統(tǒng)計(jì)量適合于粘膜炎目測評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)。顯示了各個(gè)計(jì)算的P值。下劃線表示顯著改善。7.結(jié)論1.根據(jù)死亡率和體重增加的觀察結(jié)果，在該研究中沒有來自SCV-07的任何毒性的證據(jù)。2.與鹽水對(duì)照組相比，每天兩次用100嗎/mlSCV-07治療的組、每天一次用1mg/mlSCV-07治療的組或每天兩次用1mg/mlSCV-07治療的組的體重增加顯著增加(分別為P^.014、P二0.009和PK).004)。3.在第-1天至第20天每天一次用100pg/mlSCV-07治療的動(dòng)物評(píng)分為3或更高的動(dòng)物天數(shù)顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低(P<0.001)，并且在第14天(P=0.011)、第16天(P-0.002)和第18天(P=0.001)的單日評(píng)分也顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著降低。4.在第-1天至第20天每天兩次用100ug/kgSCV-07治療的動(dòng)物評(píng)分為3或更高的動(dòng)物天數(shù)顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低(P<0.001)，并且在第18天(PO.OOl)和第20天(P=0.003)的單日評(píng)分也顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著提高。5.在第-1天至第20天每天兩次用lmg/kgSCV-07治療的動(dòng)物評(píng)分為3或更高的動(dòng)物天數(shù)顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著降低(P<0.001)，并且在第16天(P=0.043)、第18天(P^.009)和第20天(P-0.007)的單日評(píng)分也顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著提高。6.從第-1天至第20天每天兩次用1mg/kgSCV-07治療的動(dòng)物，其粘膜炎評(píng)分沒有顯示出任何顯著降低。7.每天一次用100嗎/kgSCV-07治療的組與每天兩次用1mg/kgSCV-07治療的組之間，評(píng)分為3或更高的動(dòng)物日數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P=0.054)。當(dāng)比較這兩組的單日評(píng)分時(shí)，僅在第14天觀察到顯著的差異(P=0.005)。這些觀察結(jié)果表明，每天一次用100pg/kgSCV-07治療與每天兩次用lmg/kgSCV-07治療的顯著改善非常接近。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>9.2附表4-粘膜炎評(píng)分天<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實(shí)施例3:SCV-07在治療倉鼠由分次輻射誘導(dǎo)的口腔粘膜炎中的作用功效的研究1.介紹1.1背景已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KGF-1和其他FGF家族成員在BDF-1中誘導(dǎo)口腔和食道粘膜表面的上皮增厚。人們認(rèn)為SCV-07和衍生的SCV-07肽具有可能與KGF-1重疊的機(jī)制，并且發(fā)現(xiàn)了它們?cè)谄渌衬p傷模型中的保護(hù)作用。口腔潰瘍粘膜炎是癌癥藥物治療和放療中常見的疼痛性、劑量限制性毒性。這種疾病被表征為導(dǎo)致形成潰瘍性病變的口腔粘膜損壞。在粒細(xì)胞減少的患者中，伴有粘膜炎的潰瘍是常導(dǎo)致敗血癥或菌血癥的天然口腔細(xì)菌的常見入口。在接受抗腫瘤藥物治療的患者中，有三分之一以上發(fā)生一定程度的粘膜炎。在使用白血病誘導(dǎo)療法或者多種骨髓移植預(yù)處理方案治療的患者中，所述粘膜炎的發(fā)生頻率和嚴(yán)重程度明顯增加。在這些個(gè)體中，有四分之三以上的患者患有中度至重度粘膜炎并不罕見。中度至重度粘膜炎發(fā)生于幾乎所有接受頭部和頸部腫瘤放療的患者中，并且通常始于15Gy的累積輻射量，而后在總劑量達(dá)到60Gy或以上時(shí)加重。粘膜炎的發(fā)展在臨床上經(jīng)歷三個(gè)階段1.疼痛性紅斑，其通常可以由局部麻醉劑或非鎮(zhèn)靜性鎮(zhèn)痛劑控制。2.常伴有假膜形成的疼痛性潰瘍。在并發(fā)性骨髓抑制(concomitantmyelosuppression)的情況下，由口腔起源的菌血癥或敗血癥并不罕見。疼痛的強(qiáng)度通常需要麻醉藥鎮(zhèn)痛，常為腸胃外施用。3.自愈，發(fā)生在停止抗腫瘤治療后的約2-3周。目前，唯一批準(zhǔn)用于預(yù)防和/或治療粘膜炎的生物物質(zhì)或藥物是Kepivance(palifermin)。Kepivance的應(yīng)用限于為治療惡性血液病而接受干細(xì)胞移植的患者的粘膜炎。因此，粘膜炎的標(biāo)準(zhǔn)療法由舒緩性洗劑(palliativerinses)組成，例如鹽水、碳酸氫鹽溶液、漱口液、局部鎮(zhèn)痛劑(例如利多卡因)和/或全身施用的麻醉藥。粘膜炎作為生物過程的復(fù)雜性僅在最近才被關(guān)注。已經(jīng)提出所述病癥代表口腔粘膜細(xì)胞和組織、活性氧、促炎性細(xì)胞因子、凋亡介體、多個(gè)信號(hào)通路和局部因素(例如唾液和口腔微生物群)間的連續(xù)相互作用。盡管上皮細(xì)胞退化和損壞最終導(dǎo)致粘膜潰瘍，但與輻射誘導(dǎo)的粘膜毒性相關(guān)的早期變化似乎發(fā)生在內(nèi)皮和粘膜下層的結(jié)締組織內(nèi)。輻射和化療兩者引發(fā)粘膜炎發(fā)展的整體機(jī)制似乎是類似的。1.2分次輻射模型已經(jīng)證明由本課題的主要研究者開發(fā)的分次輻射倉鼠模型是提供對(duì)抗粘膜炎化合物初步評(píng)估的一項(xiàng)準(zhǔn)確、有效且經(jīng)濟(jì)的技術(shù)。在這個(gè)模型中，在第0、1、2、3、7、8、9和10天使倉鼠左側(cè)頰囊接受8個(gè)7.5Gy的劑量，而在急性輻射研究中在第0天使用40Gy的單劑量。使用這個(gè)輻射方案的基本原理是它更加接近于癌癥患者接受放療的臨床過程。在這個(gè)模型中，粘膜炎的病程得到了很好的定義，并在輻射后約14-16天達(dá)到粘膜炎評(píng)分峰值。分次輻射模型的死亡率(通常來自麻醉劑的副作用)稍高于急性輻射模型中觀察到的死亡率，因此組的大小提高(至每組10只)以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.研究目的和概述2.1研究目的本研究的目的是評(píng)估皮下注射施用的SCV-07對(duì)由分次輻射方法誘導(dǎo)的口腔粘膜炎的發(fā)病頻率、嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間的影響。2.2研究概述在第O、1、2、3、6、7、8和9天對(duì)40只雄性敘利亞金色倉鼠的左側(cè)頰囊施用8劑7.5Gy的輻射。這通過麻醉動(dòng)物并將其左側(cè)頰囊外翻，同時(shí)用鉛屏保護(hù)動(dòng)物身體的其他部位而完成。如表9中的詳述，通過每天一次皮下注射施用測試物。從第7天開始，對(duì)粘膜炎進(jìn)行臨床評(píng)估，并每隔一天評(píng)估，持續(xù)到第35天。施用表9所列的測試物，第1組和第2組從第-1天至第29天給藥，第3組僅在輻射日給藥，第4組在第-15天至第29天之間的非輻射日(第-l天、第4天、第5天和第10-29天)給藥。3.評(píng)估3.1粘膜炎評(píng)估從第6天開始對(duì)粘膜炎的級(jí)別進(jìn)行評(píng)分，隨后每隔一天進(jìn)行評(píng)分，直至第34天(包括第34天)。根據(jù)以下參數(shù)，評(píng)估與安慰劑相比，每種藥物治療對(duì)粘膜炎的效果3丄1各組倉鼠具有潰瘍粘膜炎(評(píng)分23)的不同天數(shù)的差異。在進(jìn)行評(píng)估的每一天，將各藥物治療組中粘膜炎盲測評(píng)分^3的動(dòng)物數(shù)量與對(duì)照組進(jìn)行比較。在累積的基礎(chǔ)上比較差異，并通過卡方分析確定統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。在這個(gè)分析中，將功效定義為與對(duì)照組相比，動(dòng)物組患有潰瘍(評(píng)分23)的天數(shù)顯著降低。3丄2每日粘膜炎評(píng)分的秩和差異對(duì)于每個(gè)評(píng)估日，利用非參數(shù)秩和分析將對(duì)照組的評(píng)分與治療組的評(píng)分進(jìn)行比較。如果治療組從第6天至第28天中的兩天或更多天的評(píng)分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低，則認(rèn)為是治療成功。3.2體重和生存狀態(tài)每天都對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行稱重并記錄其生存狀態(tài)，以評(píng)估治療組間可能存在的動(dòng)物體重差異，其作為由治療引起的粘膜炎嚴(yán)重程度和/或潛在毒性的指標(biāo)。4.研究設(shè)計(jì)在第0、1、2、3、6、7、8和9天對(duì)40只雄性敘利亞金色倉鼠的左側(cè)頰囊施用8個(gè)7.5Gy的劑量輻射。這通過麻醉動(dòng)物并將其左側(cè)頰囊外翻，同時(shí)用鉛屏保護(hù)動(dòng)物身體的其他部位而完成。如表9中的詳述，上午8點(diǎn)通過皮下注射施用測試物，每天一次。從第6天開始對(duì)粘膜炎進(jìn)行臨床評(píng)估，并每隔一天進(jìn)行一次直至第34天。施用表9所列的測試物，第1組和第2組從第-1天至第29天給藥，第3組僅在輻射日(第0-3天和第6-10天)給藥，第4組在第-1天至第29天之間的非輻射日(第-l天、第4天至第5天和第10-29天)給藥。表9.SCI-03.研究設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>第O、1、2、3、6、7、8和9天在輻射前約30分鐘注射SCV-07。5.材料和方法5.1進(jìn)行研究的場所在馬薩諸塞州沃特敦，經(jīng)BiomodelsAAALAC認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。5.2動(dòng)物使用在研究開始時(shí)為5-6周齡、平均體重為85.3g的雄性LVG敘利亞金色倉鼠(CharlesRiverLaboratories)。利用耳號(hào)對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行編號(hào)，并以每籠約IO只動(dòng)物的小組進(jìn)行圈養(yǎng)。在研究開始前，使動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境5天，并在此期間，每天觀察動(dòng)物以淘汰不健康的動(dòng)物。5.3圈養(yǎng)在提供有過濾空氣、溫度為70。F+A5。F、相對(duì)濕度為50%+/-20%的動(dòng)物房中進(jìn)行研究。設(shè)定動(dòng)物房以保持最小為12-15的每小時(shí)換氣量。所述動(dòng)物房受自動(dòng)定時(shí)器調(diào)控，保持12小時(shí)接通和12小時(shí)關(guān)閉的光/暗循環(huán)，沒有微光。使用SW-(9-Cofo⑧墊料，墊料最少每周更換一次。利用市售去污劑清洗籠、蓋和瓶子等，并風(fēng)干。使用市售消毒劑對(duì)表面和引入櫥內(nèi)的材料進(jìn)行消毒。每天清掃地板并且每周最少利用市售去污劑拖洗兩次。每個(gè)月利用稀釋的漂白溶液將墻和籠架擦拭最少一次。對(duì)于所有籠舍，均使用具有確定研究、劑量、動(dòng)物編號(hào)和治療組所必須的適當(dāng)信息的籠舍卡片或標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記。記錄研究過程中的溫度和相對(duì)濕度，并保留記錄。5.4飲食使用PurinaLabdie^S)5061鼠糧飼喂動(dòng)物，并提供水，供其任意取食。5.5動(dòng)物隨機(jī)選擇和分配在輻射前，按照預(yù)期將動(dòng)物隨意分成4個(gè)治療組。通過與個(gè)體編號(hào)對(duì)應(yīng)的耳號(hào)識(shí)別每只動(dòng)物。為了得到更為一致的身份識(shí)別，使用耳號(hào)編號(hào)而非標(biāo)簽，這是因?yàn)闃?biāo)簽在研究過程中可能會(huì)被移動(dòng)。使用籠舍卡片或標(biāo)有研究編號(hào)(SCI-03)、治療組編號(hào)和動(dòng)物編號(hào)的標(biāo)簽確定每個(gè)籠舍。5.6皮下給藥和藥物應(yīng)用提供粉末狀的測試化合物人SCV-07肽，并在施用前溶于無菌的PBS中。通過具有27G針的結(jié)核毒素注射器施用0.1體積的藥物。在背部或腹部進(jìn)行皮下注射。5.7粘膜炎誘導(dǎo)利用Philips160kVp(千伏電壓)(18.75-ma)X射線源在30cm的焦距產(chǎn)生輻射，并使用3.0mm的硬化A1過濾體系。以3.32Gy/分鐘的速率靶向輻射左側(cè)頰囊粘膜。帶有Victoreen530型劑量計(jì)的所述源標(biāo)度表明施用速率為28.57nC/分鐘。利用這個(gè)標(biāo)度，每只動(dòng)物每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在每個(gè)輻射劑量接受的能量約為64.5nC(納庫侖)。在輻射前，用腹膜內(nèi)注射氯胺酮(160mg/kg)禾口甲苯噻嗪(8mg/kg)麻醉動(dòng)物。利用鉛屏，將左側(cè)頰囊外翻、固定并分離。5.8粘膜炎評(píng)分在上述研究的過程中，計(jì)算粘膜炎評(píng)分、體重變化和生存狀態(tài)。為了對(duì)粘膜炎進(jìn)行評(píng)估，利用吸入麻醉劑麻醉動(dòng)物，并將左側(cè)頰囊外翻。通過與經(jīng)驗(yàn)證的圖片判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，對(duì)粘膜炎進(jìn)行目測評(píng)分，范圍為0(正常)至5(嚴(yán)重潰瘍，臨床評(píng)分)。利用描述的方式，此判斷標(biāo)準(zhǔn)的定義如下表10SCI-03:粘膜炎評(píng)分<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>認(rèn)為1-2的評(píng)分表示疾病的輕度階段，而3-5的評(píng)分表示中度至重度粘膜炎。目測評(píng)分后，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)每只動(dòng)物的粘膜進(jìn)行拍照。在實(shí)驗(yàn)總結(jié)時(shí)，將所有底片顯影并隨機(jī)對(duì)照片進(jìn)行編號(hào)。利用上述判斷標(biāo)準(zhǔn)，由至少有兩位經(jīng)過訓(xùn)練的獨(dú)立觀察員對(duì)照片進(jìn)行以盲測分級(jí)(盲測評(píng)分)。6.結(jié)果6.1存活狀態(tài)在該研究中，對(duì)照組在第8天由于輻射所需的麻醉而發(fā)生一例死亡。6.2體重變化研究組之間的體重變化沒有顯著性差異。對(duì)每日平均百分體重變化數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。在研究過程中，鹽水處理的對(duì)照倉鼠的平均體重增加值為其初始體重的76.3%。在研究過程中，在從第-1天至第29天接受100ug/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值為其初始體重的80.7%。在研究過程中，在輻射日接受100ug/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值僅為其初始體重的66.3%。在研究過程中，在第-l天、第4天、第5天和第10-29天接受100ug/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值為其初始體重的69.7%。通過計(jì)算每只動(dòng)物體重增加的曲線下面積(AUC)評(píng)估這些差異的顯著性，然后利用單向ANOVA檢驗(yàn)比較不同治療組。這個(gè)分析的結(jié)果表明不同治療組之間沒有顯著差異(P=0.490)。6.3粘膜炎(表ll和12)對(duì)照動(dòng)物之間粘膜炎發(fā)展的動(dòng)力學(xué)和嚴(yán)重程度與預(yù)期的一致。計(jì)算每組的每日平均粘膜炎評(píng)分。在鹽水處理的對(duì)照組，在第19天出現(xiàn)為3.2的粘膜炎平均評(píng)分峰值。從第-1天至第29天接受SCV-07的組在第19天出現(xiàn)為3.3的粘膜炎平均評(píng)分峰值。在輻射日(第0-3天和第6-9天)接受SCV-07的組在第17天出現(xiàn)為3.0的粘膜炎平均評(píng)分峰值。在第1、4、5天和第10-29天接受SCV-07的組在第17、19和23天出現(xiàn)為2.9的粘膜炎平均評(píng)分峰值。通過計(jì)算各組評(píng)分為3或更高的天數(shù)并利用卡方(x2)檢驗(yàn)比較這些數(shù)字來評(píng)估在不同治療組間觀察到的差異的顯著性。該分析的結(jié)果示于表11中。鹽水處理的對(duì)照組倉鼠在所評(píng)估的36%的動(dòng)物日評(píng)分都為3或更高。從第-l天至第29天接受SCV-07的組中，在所評(píng)估的32.7%的動(dòng)物日觀察到3以上的粘膜炎評(píng)分，其與對(duì)照組之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P=0.448)。對(duì)于在第0-3天和第6-9天接受SCV-07的組，在所評(píng)估的24%的動(dòng)物日觀察到3或更高的粘膜炎評(píng)分，這與對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P:0.002)。對(duì)于在第-1、4、5和第10-29天接受SCV-07的組，在所評(píng)估的30.7%的動(dòng)物日觀察到3或更高的粘膜炎評(píng)分，其與對(duì)照組之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P二0.204)。利用Mann-Whitney秩和分析對(duì)粘膜炎評(píng)分進(jìn)行進(jìn)一步分析，以比較各組的每日評(píng)分。這個(gè)分析的結(jié)果示于表12中。在此分析中，通常需要粘膜炎評(píng)分顯著下降2天才能視為粘膜炎明顯緩解。在第-1天至第29天用SCV-07治療的組在第29天(P=0.004)、第31天(P=0.017)和第33天(P=0.002)明顯好于鹽水對(duì)照。在第0-3天和第6-9天用SCV-07治療的組在第21天(P=0.047)、第23天(PO.OOl)、第25天(P=0.009)、第29天(PO.OOl)、第31天(P=0.015)和第33天(PO扁)明顯好于鹽水對(duì)照。在第-1、4、5天和第10-29天用SCV-07治療的組在第29天(P〈0.001)、第31天(P^.004)和第33天(PO.001)明顯好于鹽水對(duì)照。36<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表ll.SCI-03.各組動(dòng)物評(píng)分為3或更高的總天數(shù)的卡方分析。這個(gè)統(tǒng)計(jì)量是潰瘍嚴(yán)重程度的計(jì)算值，是具有臨床重要性的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表12.SCI-03.利用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，測定所觀察的每日粘膜炎評(píng)分的組間差異顯著性。這個(gè)非參數(shù)統(tǒng)計(jì)量適合于粘膜炎目測評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)。顯示了各個(gè)計(jì)算的P值。下劃線表示粘膜炎評(píng)分相對(duì)于對(duì)照的顯著降低。7.結(jié)論1.根據(jù)死亡率和體重增加的觀察結(jié)果，在該研究中沒有來自SCV-07的任何毒性的證據(jù)。2.在輻射日(第0-3天和第6-9天)用100pg/kg人SCV-07治療的動(dòng)物顯示出粘膜炎評(píng)分為3或更高的天數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低(P-0.002)，在第21天(P《047)、第23天(P〈0.001)、第25天(P-0.009)、第29天(P〈0.001)、第31天(P^.015)和第33天(P〈0.001)的粘膜炎評(píng)分顯著降低。這個(gè)結(jié)果表明，SCV-07可有效降低粘膜炎的整體嚴(yán)重程度，從而可以促進(jìn)粘膜炎損傷的消退。3.在第-1天至第29天或者在非輻射日(第-l、4、5和第10-29天)用SCV-07治療的倉鼠并未顯示出評(píng)分為3或更高的動(dòng)物天數(shù)的顯著降低，但卻在第29、31和33天顯示出粘膜炎評(píng)分的顯著降低。4.以施用輻射的方案為基礎(chǔ)比較SCV-07的功效可以了解其某些作用機(jī)制，但仍需要進(jìn)一步評(píng)估。實(shí)際上，在非輻射日施用藥物的SCV-07方案并不像預(yù)期的一樣有效，尤其對(duì)于在連續(xù)多日治療的動(dòng)物更是如此。另外，所有用SCV-07治療的動(dòng)物在研究晚期的應(yīng)答都相同，這一觀察結(jié)果表明SCV-07在輻射誘導(dǎo)的粘膜炎的整體發(fā)病機(jī)理和消退中發(fā)揮多重作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>實(shí)施例4:SCV-07在治療倉鼠由順鉑和急性輻射組合誘導(dǎo)的口腔粘膜炎中的研究之前利用SCV-07的研究表明，在由急性輻射和分次輻射誘導(dǎo)的口腔粘膜炎疾病倉鼠模型中SCV-07均可有效治療所述疾病。在這個(gè)研究中，在由化療和輻射組合誘導(dǎo)的口腔粘膜炎倉鼠模型中，具體在采用順鉑和輻射組合誘導(dǎo)的口腔粘膜炎倉鼠模型中，評(píng)估SCV-07的功效。方法將40只金色敘利亞倉鼠按照預(yù)期隨機(jī)分成大小相等的四個(gè)組。通過在第-1天施用5mg/kg的單個(gè)劑量順鉑并在第0天施用35Gy的單個(gè)劑量輻射，在金色敘利亞倉鼠的左側(cè)頰囊誘導(dǎo)粘膜炎。從第-1天開始并每天一次持續(xù)至第20天，通過皮下注射以10嗎/kg、100嗎/kg或lmg/kg的劑量施用100pL體積的SCV-07。每天對(duì)動(dòng)物活動(dòng)和體重進(jìn)行評(píng)估。從第6天開始并持續(xù)在研究過程中每隔一天進(jìn)行評(píng)估，利用標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分6點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)口腔粘膜炎進(jìn)行評(píng)估。在整個(gè)研究過程中，利用卡方檢驗(yàn)對(duì)評(píng)分為3的潰瘍粘膜炎的天數(shù)進(jìn)行評(píng)估，并利用秩和檢驗(yàn)對(duì)每日單組評(píng)分進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果在所有試驗(yàn)組中，用SCV-07治療的動(dòng)物的粘膜炎均受到有利的作用。重度粘膜炎從溶劑對(duì)照組中所評(píng)估的50%動(dòng)物日降低至SCV-07治療動(dòng)物中的約30%。在疾病過程的后期階段，粘膜炎達(dá)到峰值之后，可以觀察到最顯著的影響。沒有觀察到各組之間在體重變化上的顯著差異。在試驗(yàn)過程中沒有動(dòng)物死亡。結(jié)論1.根據(jù)死亡率和體重增加的觀察結(jié)果，在該研究中沒有來自SCV-07的任何毒性的證據(jù)。.在第-1天至第20天利用10pg/kgSCV-07治療的動(dòng)物顯示出粘膜炎評(píng)分為3或更高的天數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低(P<0.001)，并且在第22天(P=0.010)、第24天(P=0.022)、第26天(P=0.015)和第28天(P<0.001)的粘膜炎評(píng)分顯著降低。3.在第-1天至第20天利用100pg/kgSCV-07治療的動(dòng)物顯示出粘膜炎評(píng)分為3或更高的天數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低(P<0.001)，并且在第6天(P=0.015)、第22天(P=0.003)、第24天(P=0.005)、第26天(P<0.001)和第28天(P<0.001)的粘膜炎評(píng)分顯著降低。4.在第-1天至第20天利用lmg/kgSCV-07治療的動(dòng)物顯示出粘膜炎評(píng)分為3或更高的天數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低(P<0.001)，并且在第6天(P=0.015)、第20天(P=0.029)、第22天(P=0.012)、第24天(P=0,001)、第26天(P=0.003)和第28天(P<0.001)的粘膜炎評(píng)分顯著降低。1.1背景已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KGF-1和其他FGF家族成員在BDF-1中誘導(dǎo)口腔和食管粘膜表面的上皮增厚。認(rèn)為SCV-07和衍生的SCV-07肽具有可能與KGF-1重疊的機(jī)制，并且發(fā)現(xiàn)了它們?cè)谄渌衬p傷模型中的保護(hù)作用?？谇粷冋衬ぱ资前┌Y藥物治療和放療中常見的疼痛性、劑量限制性毒性。這種疾病被表征為導(dǎo)致形成潰瘍性病變的口腔粘膜損壞。在粒細(xì)胞減少的患者中，伴有粘膜炎的潰瘍是常導(dǎo)致敗血癥或菌血癥的天然口腔細(xì)菌的常見入口。在接受抗腫瘤藥物治療的患者中，有三分之一以上發(fā)生一定程度的粘膜炎。在使用白血病誘導(dǎo)療法或者多種骨髓移植預(yù)處理方案治療的患者中，所述粘膜炎的發(fā)生頻率和嚴(yán)重程度明顯增加。在這些個(gè)體中，有四分之三以上的患者患有中度至重度粘膜炎并不罕見。中度至重度粘膜炎發(fā)生于幾乎所有接受頭部和頸部腫瘤放療的患者中，并且通常始于15Gy的累積輻射量，而后在總劑量達(dá)到60Gy或以上時(shí)加重。粘膜炎的發(fā)展在臨床上經(jīng)歷三個(gè)階段1.疼痛性紅斑，其通常可以由局部麻醉劑或非麻醉鎮(zhèn)痛劑控制。2.常伴有假膜形成的疼痛性潰瘍。在并發(fā)性骨髓抑制的情況下，由口腔起源的菌血癥或敗血癥并不罕見。疼痛的強(qiáng)度通常需要麻醉藥鎮(zhèn)痛，常為腸胃外施用。3.自愈，發(fā)生在停止抗腫瘤治療后的約2-3周。目前，唯一批準(zhǔn)用于預(yù)防和/或治療粘膜炎的生物物質(zhì)或藥物是Kepivance(palifermin)。Kepivance的應(yīng)用限于為治療惡性血液病而接受干細(xì)胞移植的患者的粘膜炎。因此，粘膜炎的標(biāo)準(zhǔn)療法由舒緩性洗劑組成，例如鹽水、碳酸氫鹽溶液、漱口液、局部鎮(zhèn)痛劑(例如利多卡因)和/或全身施用的麻醉藥。粘膜炎作為生物過程的復(fù)雜性僅在最近才被關(guān)注。已經(jīng)提出所述病癥代表口腔粘膜細(xì)胞和組織、活性氧、促炎性細(xì)胞因子、凋亡介體、多個(gè)信號(hào)通路和局部因素(例如唾液和口腔微生物群)間的連續(xù)相互作用。盡管上皮細(xì)胞退化和損壞最終導(dǎo)致粘膜潰瘍，但與輻射誘導(dǎo)的粘膜毒性相關(guān)的早期變化似乎發(fā)生在內(nèi)皮和粘膜下層的結(jié)締組織內(nèi)。輻射和化療兩者引發(fā)粘膜炎發(fā)展的整體機(jī)制似乎是類似的。1.2利用順鉑的口腔粘膜炎化學(xué)-輻射模型。已經(jīng)證明由本課題的主要研究者開發(fā)的化學(xué)-輻射倉鼠口腔粘膜炎模型是提供對(duì)抗粘膜炎化合物初步評(píng)估的一項(xiàng)準(zhǔn)確、有效且經(jīng)濟(jì)的技術(shù)。在這個(gè)模型中，倉鼠在第-1天接受5mg/kg的單劑量順鉑，接著在第0天在左側(cè)頰囊接受35Gy的單劑量輻射，而在急性輻射研究中在第0天使用40Gy的單劑量。該模型中的粘膜炎病程與急性輻射模型非常類似，并在輻射后約16-18天達(dá)到粘膜炎評(píng)分峰值。2.研究目的和概述2.1研究目的本研究的目的是評(píng)估皮下注射施用的SCV-07對(duì)由分次輻射方法誘導(dǎo)的口腔粘膜炎的發(fā)病頻率、嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間的影響。2.2研究概述倉鼠在第-1天通過腹膜內(nèi)注射接收5mg/kg的單劑量順鉑，然后在第0天在左側(cè)頰囊接收35Gy的單劑量輻射。這通過麻醉動(dòng)物并將其左側(cè)頰囊外翻，同時(shí)用鉛屏保護(hù)動(dòng)物其它部位而實(shí)現(xiàn)。如表13的詳述，通過每天一次皮下注射施用測試物。在第6天開始，對(duì)粘膜炎進(jìn)行臨床評(píng)估，并每隔一天評(píng)44估，持續(xù)至第28天。從第-l天至第20天施用測試物。3.評(píng)估3.1粘膜炎評(píng)估從第6天開始對(duì)粘膜炎的級(jí)別進(jìn)行評(píng)分，隨后每隔一天進(jìn)行評(píng)分，直至第28天(包括第28天)。根據(jù)以下參數(shù)，評(píng)估與安慰劑相比，每種藥物治療對(duì)粘膜炎的效果3丄1各組倉鼠具有潰瘍粘膜炎(評(píng)分23)的不同天數(shù)的差異。在進(jìn)行評(píng)估的每一天，將各藥物治療組中粘膜炎盲測評(píng)分》3的動(dòng)物數(shù)量與對(duì)照組進(jìn)行比較。在累積的基礎(chǔ)上比較差異，并通過卡方分析確定統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。在這個(gè)分析中，將功效定義為與對(duì)照組相比，動(dòng)物組患有潰瘍(評(píng)分23)的天數(shù)顯著降低。3丄2每日粘膜炎評(píng)分的秩和差異對(duì)于每個(gè)評(píng)估日，利用非參數(shù)秩和分析將對(duì)照組的評(píng)分與治療組的評(píng)分進(jìn)行比較。如果治療組從第6天至第28天中的兩天或更多天的評(píng)分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低，則認(rèn)為是治療成功。3.2重量和生存狀態(tài)每天都對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行稱重并記錄其生存狀態(tài)，以評(píng)估治療組間可能存在的動(dòng)物體重差異，將其作為由治療引起的粘膜炎嚴(yán)重程度和/或潛在毒性的指標(biāo)。4.研究設(shè)計(jì)4540只雄性敘利亞金色倉鼠在第-1天通過腹膜內(nèi)注射接受5mg/kg順鉑。在第0天，向所有動(dòng)物的左側(cè)頰囊施用35Gy的急性輻射劑量。這通過麻醉動(dòng)物并將左側(cè)頰囊外翻，同時(shí)用鉛屏保護(hù)動(dòng)物其它部位而實(shí)現(xiàn)。如表13中的詳述，通過皮下注射施用測試物，每天一次。在第6天開始，對(duì)粘膜炎進(jìn)行臨床評(píng)估，并每隔一天進(jìn)行評(píng)估直至第28天。表13.SCI-04.研究設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>*第0天在輻射前30分鐘進(jìn)行給藥。5.材料和方法5.1進(jìn)行研究的場所在馬薩諸塞州沃特敦，經(jīng)BiomodelsAAALAC認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。該研究得到了BiomodelsIACUC的的正式批準(zhǔn)，IACUC批準(zhǔn)號(hào)07-0620-01。5.2動(dòng)物使用在研究開始時(shí)為5-6周齡、平均體重為90g的雄性LVG敘利亞金色倉鼠(CharlesRiverLaboratories)。利用耳號(hào)對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行編號(hào)，并以每籠約10只動(dòng)物的小組進(jìn)行圈養(yǎng)。在研究開始前，使動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境5天，并在此期間，每天觀察動(dòng)物以淘汰不健康的動(dòng)物。5.3圈養(yǎng)在提供有過濾空氣、溫度為70°F+/-5°F、相對(duì)濕度為50%+/-20%的動(dòng)物房中進(jìn)行研究。設(shè)定動(dòng)物房以保持最小為12-15的每小時(shí)換氣量。所述動(dòng)物房受自動(dòng)定時(shí)器調(diào)控，保持12小時(shí)接通和12小時(shí)關(guān)閉的光/暗循環(huán)，沒有微光。使用B^Z-(9-Co^⑧墊料。墊料最少每周更換一次。利用市售去污劑清洗籠、蓋和瓶子等，并風(fēng)干。使用市售消毒劑對(duì)表面和引入櫥內(nèi)的材料進(jìn)行消毒。每天清掃地板并且每周最少利用市售去污劑拖洗兩次。每個(gè)月利用稀釋的漂白溶液將墻和籠架擦拭最少一次。對(duì)于所有籠舍，均使用具有確定研究、劑量、動(dòng)物編號(hào)和治療組所必須的適當(dāng)信息的籠舍卡片或標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記。記錄研究過程中的溫度和相對(duì)濕度，并保留記錄。5.4飲食使用PurinaLabdiet5061鼠糧飼喂動(dòng)物，并提供水，供其任意取食。5.5動(dòng)物隨機(jī)選擇和分配在輻射前，按照預(yù)期將動(dòng)物隨意分成4個(gè)治療組。通過與個(gè)體編號(hào)對(duì)應(yīng)的耳號(hào)識(shí)別每只動(dòng)物。為了得到更為一致的身份識(shí)別，使用耳號(hào)編號(hào)而非標(biāo)簽，這是因?yàn)闃?biāo)簽在研究過程中可能會(huì)被移動(dòng)。使用籠舍卡片或標(biāo)有研究編號(hào)(SCI-04)、治療組編號(hào)和動(dòng)物編號(hào)標(biāo)的標(biāo)簽確定每個(gè)籠舍。5.6皮下給藥和藥物應(yīng)用提供粉末狀的測試化合物人SCV-07肽，并在施用前溶于無菌的PBS中。利用具有27G針的結(jié)核毒素注射器施用0.1體積的藥物。在背部或腹部進(jìn)行皮下注射。5.7粘膜炎誘導(dǎo)在這個(gè)研究中，用順鉑和輻射的組合誘導(dǎo)粘膜炎。在第-l天單次注射(IP)施用5mg/kg順鉑。在第0天施用35Gy的單焦點(diǎn)輻射劑量。利用Philips160kVp(千伏電壓)(18.75-ma)X-射線源在30cm的焦距產(chǎn)生輻射，并使用3.0mm硬化Al過濾體系。以3.32Gy/分鐘的速率靶向輻射左側(cè)頰囊。帶有Victoreen模型530劑量計(jì)的所述源標(biāo)度表明施用速率為28.57nC/分鐘。利用這個(gè)標(biāo)度，每只動(dòng)物在每個(gè)輻射劑量接受的劑量約為688.6nC(納庫侖)。在輻射前，利用腹膜注射氯胺酮(160mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)麻醉動(dòng)物。利用鉛屏，將左側(cè)頰囊外翻、固定并進(jìn)行分離。5.8粘膜炎評(píng)分在上述研究的過程中，計(jì)算粘膜炎評(píng)分、體重變化和生存狀態(tài)。為了對(duì)粘膜炎進(jìn)行評(píng)估，利用吸入麻醉劑麻醉動(dòng)物，并將左側(cè)頰囊外翻。通過與經(jīng)驗(yàn)證的圖片判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，對(duì)粘膜炎進(jìn)行目測評(píng)分，范圍為0(正常)至5(嚴(yán)重潰瘍，臨床評(píng)分)。利用描述的方式，此判斷標(biāo)準(zhǔn)的定義如下表14SCI-04:粘膜炎評(píng)分<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>認(rèn)為1-2的評(píng)分代表疾病的輕度階段，而3-5的評(píng)分表示中度至重度粘膜炎。目測評(píng)分后，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)每只動(dòng)物的粘膜進(jìn)行拍照。在實(shí)驗(yàn)總結(jié)時(shí)，將所有底片顯影并隨機(jī)對(duì)照片進(jìn)行編號(hào)。利用上述判斷標(biāo)準(zhǔn)，由至少有兩位經(jīng)過訓(xùn)練的獨(dú)立觀察員對(duì)照片進(jìn)行以盲測分級(jí)(盲測評(píng)分)。6.結(jié)果和討論6.1生存狀態(tài)在這個(gè)研究中沒有觀察到死亡。6.2體重變化研究組之間的體重變化沒有顯著性差異。對(duì)每日平均百分體重變化數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。在研究過程中，鹽水處理的對(duì)照倉鼠的平均體重增加值為其初始體重的46.5%。在研究過程中，在從第-1天至第20天接受10ug/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值為其初始體重的51.3%。在研究過程中，在從第-1天至第20天接受100ug/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值為其初始體重的46.7%。在研究過程中，在從第-1天至第20天接受lmg/kgSCV-07的組中，倉鼠的平均體重增加值為其初始體重的48.8%。通過計(jì)算每只動(dòng)物體重增加的曲線下面積(AUC)評(píng)估這些差異的顯著性，然后利用單向ANOVA檢驗(yàn)比較不同的治療組。這個(gè)分析的結(jié)果表明不同治療組之間沒有顯著差異(P=0.663)。6.3粘膜炎(表15和16)對(duì)照動(dòng)物之間粘膜炎發(fā)展的動(dòng)力學(xué)和嚴(yán)重程度與預(yù)期的一致。計(jì)算每組的每日平均粘膜炎評(píng)分。在鹽水處理的對(duì)照組，在第18天出現(xiàn)為3.1的粘膜炎平均評(píng)分峰值。從第-1天至第20天接受10ug/kgSCV-07的組在第16天出現(xiàn)為2.9的粘膜炎平均評(píng)分峰值。從第-1天至第20天接受100ug/kgSCV-07的組在第14天和第16天出現(xiàn)為2.8的粘膜炎平均評(píng)分峰值。在第-1天至第20天接受1mg/kgSCV-07的組在第16天出現(xiàn)為3.2的粘膜炎平均評(píng)分峰值。通過計(jì)算各組評(píng)分為3或更高的天數(shù)并利用卡方(x2)檢驗(yàn)比較這些數(shù)字來評(píng)估在不同治療組間觀察到的差異的顯著性。該分析的結(jié)果示于表15中。鹽水處理的對(duì)照組倉鼠在所評(píng)估的50%的動(dòng)物日評(píng)分都為3或更高。從第-l天至第20天接受10ng/kgSCV-07的組中，在所評(píng)估的34.2%的動(dòng)物日觀察到3或更高的粘膜炎評(píng)分，其與對(duì)照組之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P<0.001)。從第-1天至第20天接受100pg/kgSCV-07的組中，在所評(píng)估的29.2%的動(dòng)物日觀察到3或更高的粘膜炎評(píng)分，其與對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P<0.001)。從第-1天至第20天接受100^g/kgSCV-07的組中，在所評(píng)估的30.8%的動(dòng)物日觀察到3或更高的粘膜炎評(píng)分，其與對(duì)照組之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P<0.001)。利用Mann-Whitney秩和分析對(duì)粘膜炎評(píng)分進(jìn)行進(jìn)一步分析，以比較各組的每日評(píng)分。這個(gè)分析的結(jié)果示于表16中。在此分析中，通常需要粘膜炎評(píng)分顯著下降2天才能視為粘膜炎明顯緩解。與鹽水對(duì)照相比，在第-1天至第20天用10pg/kgSCV-07治療的組在第22天(P=0.010)、第24天(P=0.022)、第26天(P=0.015)和第28天(P<0.001)的粘膜炎明顯較少。與鹽水對(duì)照相比，在第-l天至第20天用100ng/kgSCV-07治療的組在第6天(P:0.015)、第22天(？=0.003)、第24天(P=0.005)、第26天(P<0.001)和第28天(P<0.001)的粘膜炎明顯較少。與鹽水對(duì)照相比，在第-1天至第20天用lmg/kgSCV-07治療的組在第6天(P=0.015)、第20天(P=0.029)、第22天(P=0.012)、第24天(P=0.001)、第26天(P=0.003)和第28天(P〈0扁)的粘膜炎明顯較少。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表15.SCI-04各組動(dòng)物評(píng)分為3或更高的總天數(shù)的卡方分析。這個(gè)統(tǒng)計(jì)量是潰瘍嚴(yán)重程度的計(jì)算值，是具有臨床重要性的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表16.SCI-04.利用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，測定所觀察的每日粘膜炎評(píng)分的組間差異顯著性。這個(gè)非參數(shù)統(tǒng)計(jì)量適合于粘膜炎目測評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)。顯示了各個(gè)計(jì)算的P值。下劃線表示粘膜炎評(píng)分相對(duì)于對(duì)照的顯著降低。7.結(jié)論1.根據(jù)死亡率和體重增加的觀察結(jié)果，在該研究中沒有來自SCV-07的任何毒性的證據(jù)。2.從第-1天至第20天利用10|ag/kgSCV-07治療的動(dòng)物顯示出粘膜炎評(píng)分為3或更高的天數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低(PO.OOl)，并且在第22天(P=0.010)、第24天(P=0.022)、第26天(P=0.015)和第28天(PO.OOl)的粘膜炎評(píng)分顯著降低。3.從第-1天至第20天利用100pg/kgSCV-07治療的動(dòng)物顯示出粘膜炎評(píng)分為3或更高的天數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低(P〈0.001)，并且在第6天(P=0.015)、第22天(P=0.003)、第24天(P=0.005)、第26天(PO.001)和第28天(PO.001)的粘膜炎評(píng)分顯著降低。4.從第-1天至第20天利用lmg/kgSCV-07治療的動(dòng)物顯示出粘膜炎評(píng)分為3或更高的天數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低(PO.001)，并且在第6天(P:0.015)、第20天(P=0.029)、第22天(P二0.012)、第24天(P-O.OOl)、第26天(？=0.003)和第28天(PO.001)的粘膜炎評(píng)分顯著降低。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>9.2附表8-粘膜炎評(píng)分<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>權(quán)利要求1.用于治療、預(yù)防、抑制或減輕由粘膜疾病引起的受試者組織退化、損傷或損害，或者恢復(fù)受所述疾病不利影響的受試者組織的治療方法，其包括向所述受試者施用有效量的式A的免疫調(diào)節(jié)化合物其中，n為1或2，R為氫、酰基、烷基或肽片段，X為芳族氨基酸或雜環(huán)氨基酸或者其衍生物。2.如權(quán)利要求1的方法，其中X為L-色氨酸或D-色氨酸。3.如權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物為SCV-07。4.如權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物的施用劑量在約0.001-2000mg的范圍內(nèi)。5.如權(quán)利要求l的方法，其中所述化合物的施用劑量在約0.01-100mg的范圍內(nèi)。6.如權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物的施用劑量在約0.1-10,000ug/kg受試者體重的范圍內(nèi)。7.如權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物的施用劑量在約1-1,000ug/kg受試者體重的范圍內(nèi)。8.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述疾病是由受試者接受的輻射或化療中的至少一種引起的。9.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述粘膜包括口腔粘膜或食道粘膜中的至少一種。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述疾病包括粘膜炎或潰瘍性損害中的至少一種。11.如權(quán)利要求8的方法，其中所述輻射施用的累積劑量至少為約15Gy。12.如權(quán)利要求8的方法，其中所述輻射施用的累積劑量至少為約40Gy。13.如權(quán)利要求8的方法，其中所述輻射施用的累積劑量至少為約60Gy。14.如權(quán)利要求8所述的方法，其中化療包括順鉑。15.如權(quán)利要求14的方法，其中所述順鉑的施用劑量在0.1-50mg/kg的范圍內(nèi)。16.如權(quán)利要求14的方法，其中所述順鉑的施用劑量為約5mg/kg。全文摘要利用免疫調(diào)節(jié)化合物治療粘膜疾病。文檔編號(hào)A61K38/00GK101657210SQ200880011935公開日2010年2月24日申請(qǐng)日期2008年2月11日優(yōu)先權(quán)日2007年2月13日發(fā)明者伊斯雷爾·里奧斯,辛西婭·塔特希爾申請(qǐng)人:?？她堉扑幑?